Abstract
香烟烟雾(CS)是心血管和肺疾病的主要危险因素。因为CS是一个包含7000多化学品1这是具有挑战性的评估个别成分其总体毒性的贡献复杂的气溶胶。个别成分以及混合物的毒理学配置文件可以然而,建立了体外 ,由通量筛选工具,这使烟草烟雾的危害和潜在的有害成分(HPHCs)的分析施加高,受美国食品和药品的定义管理局(FDA)。2
对于初步评估,使用该化合物的毒性的实时,无标记评估的基于阻抗的工具。该仪器读数依赖于细胞黏附,活力和形态,所有共同提供的电池状态的概述。无量纲参数,命名的单元格指数,用来量化。一组的DIF同的染色方法是为基于荧光成像开发的调查和HCS平台被用来获取对每个HPHC引起的一种细胞毒性更深入的信息。
测试的15个成分中,只有五人入选基于HCS-分析,他们注册了一个可计算的LD 50(<20毫米)。这些包括1- aminonaphtalene,砷(V),铬(VI),巴豆醛和苯酚。基于它们在HCS效果,1- aminonaphtalene和酚可确定以诱导线粒体功能障碍,并连同铬(VI),为基于增加组蛋白H2AX的磷酸化基因毒性。巴豆醛被确定为氧化应激诱导剂和砷作为应力激酶途径的活化剂。
这项研究表明,阻抗和基于HCS技术的组合提供了用于在体外的CS成分的评估一个强大的工具。
Introduction
毒理学风险评估历来依赖于使用动物模型当中,虽然在生命科学基础,也有不足之处联系,如不一致译人类和成本高。此外,出现了越来越多的努力,找到“3R原则”2(替代,减少和优化)的精神动物试验替代方案。这种努力已经加速,在过去的几年中,这不仅是因为最近的进展,如高通量的技术和系统生物学方法,但由于立法限制使用动物试验也,特别是在欧洲联盟。
的细胞信号途径调节到毒性损伤的响应的复杂性使得它显然使用单一毒理学终点将不足以描述的某些化合物的毒理学基础。对于这一点,数百相互作用的p的相互有助于生物网络roteins也将需要被考虑在内。研究毒物对这些网络的影响,一个系统毒理学方法与表型中,高通量筛选测定组合是有用的推断效能并同时提供对个别毒物作用机制的更多信息。
在这项研究中,我们采用HCS作为强大的筛选工具,它是由一个自动显微镜和生物软件应用的,可以采集,处理和分析来自特定的基于荧光的细胞分析而得的图像数据。这允许在小区内的视觉变化进行量化,在单细胞或亚细胞水平,并可以同时分析许多参数。3例如,DNA双链断裂是使用组蛋白H2AX的磷酸化的基于抗体的鉴定评估,并使用细胞烫发活性氧(ROS)的定量eable超敏感的染料。
因为肺上皮细胞代表针对吸入毒物,包括香烟烟雾中的第一生物屏障,我们利用主支气管上皮细胞作为体外模型来分析由美国食品和药品管理局公布HPHCs的效果。4本手稿是一个后续-最多上以前的研究5中,我们评估HPHCs的不同子集的生物学影响。
作为我们工作流以评估在体外的细胞毒性的一部分,我们最初评估选择的15 HPHC的的效力,使用基于阻抗的实时蜂窝分析使我们能够建立剂量范围,适合于随后的HCS(RTCA)系统分析( 图1)。毒理学评估HCS然后用细胞毒性九个多参数进行端点,每次在两个时间点(4和24小时)监测。所使用的标记物指示线粒体毒性,DNA损伤,应激激酶,活性氧(ROS),谷胱甘肽(GSH)的含量,蛋白酶3 - 7活性,细胞色素C释放和细胞膜的通透性,如表1所述。
我们的方法使识别和香烟烟雾成分通过剂量和时间依赖性的采样的效果的表征。最终,这产生每个HPHC 的体外毒理学特性。多组学方法也可以被用来进一步补充HCS分析。这最后还提供了在细胞信号和/或转录水平的影响有了更深的了解。
Protocol
1.收获正常人支气管上皮细胞(NHBEs)
- 预温细胞培养基(支气管上皮细胞生长培养基的培养基)中,HEPES,胰蛋白酶,和胰蛋白酶中和在水浴溶液(TNS),在37℃。
- 收获细胞时达到汇合的80%。
注意:下面的NHBE细胞培养播种条件可被用于获得在未涂覆T75烧瓶最佳合流用20ml培养基:- 种子1×10 6个细胞进行3天的培养,0.5×10 6个细胞进行4天的培养和0.25×10 6个细胞进行5天的培养。更换培养基每2天,当细胞在培养刷新营养素。培养细胞在37℃和5%的CO 2。
- 从烧瓶中(多个)除去上清液,并添加HEPES洗涤细胞( 例如 ,将3ml的75cm 2的烧瓶中)。旋转每个烧瓶以覆盖与HEPES溶胶单层细胞ution。
- 取出的HEPES溶液,并添加胰蛋白酶溶液( 例如 ,将3ml的75cm 2的烧瓶中)。旋转烧瓶以覆盖用胰蛋白酶溶液中的细胞单层。
- 在37±2℃下进行5分钟的烧瓶中。监测细胞脱离,在显微镜下,如有必要,孵育时间更长,轻轻拍打瓶以释放任何残留的附着的细胞。
- 添加TNS以停止反应( 例如 ,将3ml的75cm 2的烧瓶中)与细胞悬浮液转移到15毫升管。
- 离心在300×g下将细胞悬浮液5分钟。
- 弃去上清液并重新悬浮细胞沉淀在10ml新鲜培养基中,混合轻轻以产生均匀细胞悬浮液。
- 通过一个100微米的细胞滤网过滤细胞悬浮液以除去聚集物和计数细胞。注意:在我们的实验室中的电场多信道细胞计数系统被用来精确地和一致地评估viablE细胞数量。
2.实时细胞分析仪(RTCA)为基础的剂量范围内发现(DRF)
注:一个基于阻抗的测量系统用于:1)评估化合物毒性,2)选择的化合物,以通过HCS进一步调查和3)选择适当剂量的HCS。该NHBE细胞在RCTA板通过在各加入25微升试验化合物稀释至100μl介质本很好给药。因此,所有的试验溶液在5次(5×)所需的最终浓度制备。
- 播种NHBE细胞
- 编程工具来定义阻抗测量的次数和持续时间。在这项研究中,数据分别记录每15分钟48小时(从24小时±2小时之前,用测试试剂给药的细胞后24小时)。
- 测量吹打50μl的预热介质的入96孔RTCA板的每个孔的板背景。注意:这一步代表了技术要求为仪器来计算介质电阻,然后用作基于细胞的计算基准参考。
- 在144,000个细胞/ ml(±5%)的浓度制备细胞悬浮液,并加入50微升细胞悬浮液(7200个细胞/孔),其中50微升已/孔加入培养基的仪器背景RTCA板的各孔测量。
- 让细胞将它们放置到RTCA支架(以改善细胞的均匀分布)之前附着在室温下30分钟。孵育在RTCA摇篮RTCA板在培养箱中(37℃和5%的CO 2),并开始记录的数据在给药前在24±2小时。
- HPHCs和阳性对照的稀释液
- 阳性对照稀释
- 稀释星形孢菌素股票溶液(10mM)1:10二甲基亚砜( 见表3),并添加对d的5微升ilution至195微升培养基,得到5倍的工作溶液。
- HPHC稀释
- 溶解/稀释各HPHC在车辆( 表2),以产生的1M储备溶液。稀释各HPHC原液1:10在介质以产生100mM的溶液。
- 生成“化合物模样板”通过利用培养基+ 10%的车辆,以获得5×工作溶液( 图2)的五步骤1时10连续稀释。注意:最终,最终剂量为:0.2微米,2微米,20微米,0.2毫米,2毫米,20毫米。还准备剂量0,对应于唯一车辆,在此步骤。
- 加药
- 暂停RTCA仪器打开摇篮取下盖板。
- 取出板,并将其放置在RTCA板温度工具(设计期间RTCA外实验程序来稳定RTCA板的温度站),以避免冷却的细胞,这可能会影响阻抗测量。
- 从“化合物原版”到细胞中,一式三份保持相同的给药顺序如在化合物主板(最高剂量中的行号7的顶行和载体对照)( 图2)加入25微升的5倍的溶液。不要删除现有的(100微升)的细胞培养基。
- 加入25微升5倍的阳性对照的解决了底排(半右)细胞,而不删除现有的培养基。底行(半左)在25微升培养基加入到细胞中,而不删除现有的细胞培养介质。
- 密封采用封口膜板。将板放回RTCA摇篮,将其锁定。重新启动数据记录为所需的曝光时间( 例如 ,24小时)。注:使用这种密封膜的建议,以避免潜在的污染,包括富裕以及交叉污染。
- <strong>数据分析RTCA和LD 50计算
- 导出原始数据为文本(.txt)或Excel(.xls)文件。注意:文件将包含所有关于板布局(化合物,剂量和井位)的信息。生细胞指数值在96孔格式(镜像板以及分布)组织并提供了用于在其中发生记录每时间点。在时间t处i。在96孔板中的位置的值是由CI T(I)表示。
- 标识为归一化的剂量为在96孔板的每个位置i(之前引用最新的时间点例如 ,细胞指数在23小时50分钟00秒位置i,CI T(I)= 23:50:00 = Cl 参考 (i)段)。注意:进行计量时,此信息必须被注解。
- 分,在一个井的基础上,由归一化参考各时间点的值,以在给药时间正常化的所有值。在positio标准值妮在t时刻的96孔板是由NCI T(I)表示,并因此由NCI T(I)= CI T(I)/ CI 价 (i)用于所有的t所定义。
- 在24小时计算曲线(AUC)下的面积给药后对每个样品I(位置i中的96孔板),包括阳性对照和车辆的位置。
- 获得在位置i由每个矩形的区域求和得到的AUC,每个矩形2的时间点之间被用t k和T L(叔ķ<T L)表示;使用X * Y,其中x = T L计算各矩形区域- 子介是二时间点和y是两个时间点(γ=(NCI TK(I)+ NCI TL(ⅰ))的活性的平均值之间的距离/ 2)。
注:AUC在24小时后给药为位置i由AUC(i)来表示。因为所有的条件在一式三份孔镀用三个值的中位数。
<利>使用以下等式规范化值: - 获得在位置i由每个矩形的区域求和得到的AUC,每个矩形2的时间点之间被用t k和T L(叔ķ<T L)表示;使用X * Y,其中x = T L计算各矩形区域- 子介是二时间点和y是两个时间点(γ=(NCI TK(I)+ NCI TL(ⅰ))的活性的平均值之间的距离/ 2)。
其中i是用于该AUC在24小时的血样计算在96孔板的位置,
车辆为在一盘的车辆的孔在24小时的血样的AUC值的中位数,
阳性对照是AUC值的中值用于在板的阳性对照孔在24小时的血样,
CR是用于车辆(0%)所需位数归一化值,以及
SC是用于阳性对照的所需位数归一化值(-100%)
注:在这一步骤结束时,获得的数据集,其中包含,在96孔板中,浓度Ci每个位置i(对数单位)被施加到包含在位置的样品/孔i和其相应的在24小时后给药AUC_normaliz标准化的AUCED(i)中。 - 打印和适应(C I,AUC_normalized(I)) -值用4参数Hill方程。如果可能的话,也算LD 50。
其中Y = AUC_normalized,
零活动起0 =活动水平在零浓度测试化合物,
无限活动起INF =活动水平在无限集中,
AC50 =浓度在该活性达到最大水平的50%,
希尔系数n =上AC50斜坡的措施,以及
C =浓度在对应于值的剂量-反应曲线图的x轴对数单位。
注:AC50相当于LD 50(细胞毒性实验)。它是效能的量度,其中较低的值表示高效力。
- 阳性对照稀释
3.通过测量HCS毒性效应
注:共有毒性九个多参数标记,在六个不同的测定法进行分组,使用HCS平台( 表1)进行测定。基于所述RTCA细胞活力分析(第2部分)各组分的剂量范围被定义并且还包括一个3R4F参考剂量。基准剂量相当于HPHC本,在一个棒的从基准香烟3R4F烟雾的量。
- 播种NHBE细胞
- 在120,000个细胞/毫升(±5%)制备细胞悬浮液和100μl的细胞悬浮液添加到96-孔的HCS板的各孔(12,000细胞/孔)。准备足够的板对所有试验(细胞毒性,DNA损伤,应激激酶,ROS,GSH含量和细胞凋亡)和时间点(4和24小时)的评估。
- 留在室温下将HCS板30分钟,以允许细胞附着到孔中,然后以3孵育7℃和5%CO 2的给药前24±2小时。
- HCHPs和阳性对照的稀释
注:NHBE细胞在HCS板将通过加入25微升的试样液至100μl介质已经存在于每个孔中的给药。因此,所有的剂量都在5倍所需的最终浓度制备。- 阳性对照稀释(阳性对照板)
- 分配40微升的各阳性对照的原液( 见表 3)在塔#2( 图4a中 ,在红色阴影孔)。分配20微升车辆在列#3和#5( 图4a中,在淡蓝色阴影孔)并在列#4车辆40微升( 图4a中 ,在淡蓝色阴影孔)。
- 撤回12微升从列#2的孔中,它分配给在列#3的孔中,并混合( 图4b)继续直到最终连续稀释用3剂量(D1,D2,和d3)和车辆(V)的每个阳性对照化合物获得( 图4c)。为了产生积极的控制板,准备在媒体( 图4D)1:40稀释化合物。
- HPHC稀释(化合物主盘)
注:HCS HPHCs所述的选定的剂量范围如表2所列。- 稀释各HPHC原液(1μM)1:10在培养基中的100mM的浓度。使用介质,用10%的车辆,以获得所选择的5倍的剂量为每个HPHC执行稀释液。
- 阳性对照稀释(阳性对照板)
- 加药
- 由化合物模样板添加25μl的5倍的解决方案来将细胞一式三份保持相同的给药顺序如在化合物主板(最高剂量中的行号7的顶行和载体对照)( 图5)。请不要删除电子xisting(100微升)细胞培养基。
- 添加25微升从阳性对照板5X溶液至细胞底部行保持相同的给药顺序作为阳性对照板( 图5)英寸不要删除现有的(100微升)的细胞培养基。注意:每个实验都有一个特定的阳性对照; 见表3孵育该板在37℃和5%CO 2的所需的曝光时间(4或24小时)。
- 染色
- 对于所有检测的准备
- 预暖洗涤缓冲液(PBS)中在37℃下的解决方案。
- 加入10.81毫升的37%甲醛固定溶液(4%的甲醛溶液)编写89.19毫升洗涤缓冲液和预温它在37℃。
- 通过在37℃加入10ml 10×透化缓冲液的90 1ml洗涤缓冲液和预温它的制备透化缓冲液。
- 准备Blo保险丝通过在37℃下加入10毫升10×封闭缓冲液至90 1ml洗涤缓冲液和预温它的他妈的缓冲器。
- 预温在37℃的细胞培养介质。
- 从孵化器中取出HCS板一旦4和24小时的曝光时间到达并执行了以下具体方案为每个检测。
- 细胞毒性测定
- 根据下式制备活细胞染色溶液的足够体积(V):中的体积(μL)V = 50×宽×1.2(井W的数量)
- 根据供应商的指示稀释线粒体染料在活细胞染色解决方案。根据供应商的指示稀释细胞膜透性染料在活细胞染色解决方案。
- 加入50μl活细胞染色溶液到指定为“细胞毒性分析”的板(多个)的每孔中。不要除去细胞培养基,并在37℃,5%的CO孵育30分钟
- 轻轻吸出介质并染色溶液和添加的固定溶液至每100μl/孔孔,然后在黑暗中在室温下20分钟孵育板(多个)。
- 轻轻吸固定溶液,并用100微升洗一次/孔洗涤缓冲液。
- 除去洗涤缓冲液,并添加100μl/孔1×透化缓冲液到每个孔中,并孵育在黑暗中在室温下10分钟。
- 吸透化缓冲液和洗涤板两次100μl/孔的洗涤缓冲液。
- 抽吸洗涤缓冲液和添加100μl的1×封闭缓冲液到每个孔中,并孵育在黑暗中在室温下15分钟。
- 根据下列公式准备一抗溶液的足够体积(V):封闭缓冲液(微升)V的体积= 50×宽×1.2(井W的数量)。在一抗溶液250:稀释的抗细胞色素C抗体(小鼠)1。
- 吸阻塞的缓冲ð添加50μl/孔一抗溶液,以每孔并孵育在黑暗中在室温下60分钟。
- 制备根据下式二次抗体与核解的足够体积(V):封闭缓冲液(微升)V的体积= 50×宽×1.2(井W的数量)。在二抗核解决方案500:稀释抗鼠抗体1。在二抗核解决方案1000:稀释核染料1。
- 抽吸一抗溶液和洗涤板三次以100μl/孔的洗涤缓冲液使用洗板。
- 抽吸洗涤缓冲液和添加50μl/孔的二次抗体与核解到板(多个)的每孔中,并孵育在黑暗中在室温下60分钟。
- 抽吸二次抗体与核解和洗涤板三次以100μl/孔的洗涤缓冲液使用洗板。加入100微升/洗涤缓冲液中好。板(s)是(有)今准备在HCS读者评价。
- DNA损伤分析
- 轻轻吸从指定的“DNA损伤”板块的媒介。
- - 3.4.2.8 3.4.2.4:如按顺序说明执行相同的步骤。注意,在这种情况下,只有培养基步骤3.4.2.4中除去。
- 根据下列公式准备一抗溶液的足够体积(V):封闭缓冲液的体积(μL)V = 50×宽×1.2(井W的数量)
- 稀释的抗磷酸H2AX抗体(小鼠)1:在一抗溶液2000。
- 执行如3.4.2.10所描述的相同步骤。
- 根据下式制备二级抗体与核解的足够体积(V):封闭缓冲液的体积(μL)V = 50×宽×1.2(井W的数量)
- 在二抗核解决方案500:稀释抗鼠抗体1。
- 稀释NucleaR染料1:1000的二抗核解决方案。
- 执行如在序列中描述的相同步骤:3.4.2.12-3.4.2.14。
- 应激激酶分析
- 轻轻吸从每个指定的“应力激酶”的板的介质。
- - 3.4.2.8 3.4.2.4:如按顺序说明执行相同的步骤。注意,在这种情况下,只有培养基步骤3.4.2.4中除去。
- 根据下列公式准备一抗溶液的足够体积(V):封闭缓冲液的体积(μL)V = 50×宽×1.2(井W的数量)
- 在一抗溶液200:稀释的抗磷酸cJun抗体(兔)1。
- 执行如3.4.2.10所描述的相同步骤。
- 根据下式制备二级抗体与核解的足够体积(V):封闭缓冲液的体积(μL)V = 50×宽×1.2(井W的数量)
- 在二抗核解决方案500:稀释抗兔抗体1。
- 在二抗核解决方案1000:稀释核染料1。
- 执行如在序列中描述的相同步骤:3.4.2.12-3.4.2.14。
- ROS含量
- 根据下式制备活细胞染色溶液的足够体积(V):中等(微升)V的体积= 50×宽×1.2(井W的数量)。
- 根据供应商的指导稀释活细胞染色溶液的ROS染料
- 稀释核染料1:活细胞染色Solution.3.4.5.4 1000)加入50微升活细胞染色液到指定的“ROS”每个孔板;不要除去细胞培养基,并孵育在黑暗中在室温下30分钟。
- 轻轻吸出介质并染色溶液并用100μl/孔培养基洗涤板三次。
- 吸出介质,加100 _6; /孔固定溶液,每孔为在黑暗中在室温下20分钟孵育板。
- 轻轻吸定影溶液和冲洗板三次用100μl/孔的洗涤缓冲液。
- 添加100μl/孔洗涤缓冲液。板(s)是(是)现在已经准备好。
- 1小时内评估的HCS读者板。
- GSH含量测定
- 根据下式制备活细胞核染色液的足够体积(V):中等(微升)V的体积= 50×宽×1.2(井W的数量)。
- 稀释核染料(远红)1:1000的活细胞核染色Solution.3.4.6.3)。加入50μl活细胞细胞核染色解决方案,以指定的“GSH含量”板的每一个孔。不要除去细胞培养基,并在37℃,5%的CO 2温育30分钟。
- 根据制备活细胞GSH染色液的足够体积(V)公式如下:HBSS量(微升)V = 50 x宽x 1.2(井W的数目)
- 根据供应商的说明稀释GSH染料活细胞GSH染色液。
- 轻轻吸出介质和核染色溶液并用100μl/孔培养基洗涤板三次。
- 吸中,加入100微升/孔的活细胞GSH染色液,每孔的板(S)的。
- 孵育在黑暗中在室温下10分钟。板(s)是(是)现在已经准备好。
- 1小时内评估的HCS读者板(S)。
- 凋亡试验
- 根据下式制备活细胞染色溶液的足够体积(V):中等(微升)V的体积= 50×宽×1.2(井W的数量)。
- 在活细胞染色溶液300:稀释胱天蛋白酶染料1。
- 除去细胞的培养基中,加50微升活细胞染色溶液至T的每个孔他板(多个)指定为“细胞凋亡”,并在37℃孵育30分钟,5% 的 CO 2。
- 根据下式制备活细胞核染色液的足够体积(V):修复溶液(微升)V的体积= 50×宽×1.2(井W的数量)。
- 在活细胞的核染色解决方案1000:稀释核染料1。
- 除去活细胞染色溶液中,添加100μl/孔的活细胞核染色液到板(多个)的每孔中,并孵育在黑暗中在室温下30分钟。
- 吸出固定液/核染料溶液和洗涤板(多个)三次用100μl/孔的洗涤缓冲液。
- 添加100μl/孔洗涤缓冲液。板(s)是(是)现在已经准备好。
- 评估的HCS读者板(S)。
- 对于所有检测的准备
- 数据分析HCS
- 导出原始数据为Excel(.xls)文件。注意:使用原始细胞指数值在96孔形式组织在(镜像板以及分布),并在给定的时间点给药后提供了用于每个端点。
- 正常化使用以下等式的值:
其中i是一个很好的测量的原始信号值,
车辆是用于车辆井被测信号值的中值上的板,
CR是用于车辆(0%)所需位数归一化值,以及
SC是用于阳性对照(100)的所需位数归一化值,
注:在这一步骤结束时,获得的数据集,包含,对于施加到包含在位置样本的每个位置i。在96孔板中,浓度C I(对数单位)/孔i和其相应的归一信号N(i)中。 - 打印和适应(C I,N(I)) -使用4参数希尔方程值。
其中,在零浓度测试化合物的零活动起0 =活动水平,
无限活动起INF =活动水平在无限集中,
AC50 =浓度在该活性达到最大水平的50%,
希尔系数n =上AC50斜坡的措施,以及
C =浓度在对应于值的剂量-反应曲线图的x轴对数单位。
注:AC50是效力衡量,其中较低的值表明高效力。
Representative Results
RTCA
因为没有检测到毒性作用,当HCS端点不会信息,没有显示的那些化合物细胞活力下降到在RCTA不是由HCS( 图3b,C,D,G,K,L,M所测试的最高浓度页 )。化合物显示仅在最高浓度细胞活力下降( 图3e,O)也被取消了HCS。最后,只用一个可计算的LD 50(<20毫摩尔)的成分被选择用于进一步的HCS分析( 图 3a,F,H,J,N)。符合上述标准HPHCs是:1-aminonaphtalene,砷(V),铬(VI),巴豆醛和苯酚。
HCS
作为质量检查(QC),阳性对照是科幻首先进行分析,以保证正确地进行该染色步骤。阳性对照处理的细胞的代表性图片示于图6中 ,数据值是如前所述标准化为车辆。没有剂量反应曲线被绘制为只有三个剂量测试,不是所有的三个剂量都在每一个时间点考虑。阳性对照的剂量被选择(基于先前的实验中,未示出的数据),使适当的反应是为在两个4小时和24小时的每个端点观察。在特定的剂量1和2中使用而剂量2和3用于评估在24小时的效果,在4小时来评估的效果。如果为阳性对照的剂量没有观察到反应板被丢弃。注意,对于所有的端点,除非线粒体膜电位和GSH含量时,信号强度的增加,预计。
所有的化合物,除苯酚,引起坏死性苯氧型的基础上,增加细胞膜的通透性( 图7a,F,H,1)。 1- aminonaphtalene,铬(VI),巴豆醛和苯酚被确定为基础上,增加组蛋白H2AX的磷酸化( 图7E,J,N,P)为基因毒性。苯酚和1- aminonaphtalene被发现诱发严重线粒体功能障碍( 图7b,邻 ),其与1-aminonaphtalene,导致了增加的细胞色素C的释放( 图7c)。增加的胱天蛋白酶3/7活性的检测在铬曝光提供凋亡事件的证据。氧化应激诱导(ROS或GSH)也处理后与1- aminonaphtalene,巴豆醛和苯酚( 图7d,M,Q)进行检测。最后,砷诱导细胞应激的转录因子cJun( 图7克 )增加的磷酸化证明。
负载/ 53987 / 53987fig1.jpg“/>
图1.化合物TOX-探查工作流。 一个)的工作流程的示意图,随后在这项研究。首先,使用RTCA平台来选择适当的剂量为后续HCS来表征特定化合物的毒性特征。b)该研究的实验设计进行剂量范围发现。播种后24小时,细胞剂量和阻抗值在接下来的24小时连续监控,而HCS终点进行了调查4和给药后24小时。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2. RTCA曝光板。首先被执行五步1点10连续稀释生成的复合主盘。每种化合物,包括车辆控制(剂量0),然后在一式三份与介质和星形孢菌素作为对照加入到曝光板在一起。需要注意的是序列传输时保持剂量,最高剂量是行号1,而车辆控制是行数7. 请点击此处查看该图的放大版本。
图3代表RTCA细胞活性的结果。a) 第 1-aminonaphtalene, 二)2-硝基丙烷, 三)乙酰胺, 四)丙酮, 电子)丙烯酰胺,f)的砷(V)中,G)苯,h)的铬(VI) ,j)的巴豆醛,k)的甲基乙基酮, 升)NickeL(II)中,m)硝基苯,n)的苯酚, 邻)喹啉, 对)甲苯。在24小时的血样,曲线(AUC)下面积计算各剂量(包括阳性对照和载体)从0到100%的活性(y轴),其中0反映的活性和标准化的范围内车辆与阳性对照-100。然后值描绘,并用四参数Hill方程,并在可能,LD 50计算拟合。浓度对数标度(X轴)表示。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4.稀释方案为HCS试验得到阳性对照化合物A)阳性对照的加入和已经hicle到串行稀释板。b)该阳性对照的系列稀释。 三)200X阳性对照的剂量。 德)的200倍阳性对照的剂量在介质(1:40稀释),产生含有5倍剂量阳性对照板。请注意,每个剂量是一式三份稀释,以反映在曝光板的最后布局)。 请点击此处查看该图的放大版本。
图5. HCS曝光板。首先被执行五步稀释生成复合主盘。每个化合物,包括车辆控制(剂量0),然后在一式三份与阳性对照加入到曝光板在一起。请注意剂量订单转移后保持,最高剂量是行号1,而车辆控制是行数7. 请点击此处查看该图的放大版本。
图6.代表性的荧光抗体照片或染料染色的细胞的 ) 核参数 - 核染料 :它与DNA结合的活的或固定细胞中的渗透染料。此染色剂用于识别各个细胞标记的核区域b) 坏死 - 细胞膜渗透性染料 :的细胞膜完整性的基于染料的检测。试剂在本质上是不可渗透的细胞膜。期间坏死,膜变得可渗透和染料进入细胞并与DNA结合产生强光S。ignal 三) 凋亡 - 细胞色素C:细胞色素C释放,早期凋亡的一个著名标志性的基于抗体的检测。在细胞凋亡的诱导,细胞色素C从线粒体释放并扩散到细胞核四)DNA 损伤 - pH2AX:组蛋白H2AX的磷酸化的基于抗体的检测,双链DNA断裂的一个公知的标志E) 胁迫激酶 - cJun:在丝氨酸73 cJun的,细胞应激的一个公知的标志的磷酸化的基于抗体的检测六) 氧化应激 - DHE:超氧自由基的基于染料的检测。本身二氢乙荧光在细胞质蓝色,而氧化型荧光乙锭在红DNA嵌入G)GSH - MBCL:免费GSH分子染料检测。 MBCL与谷胱甘肽反应来产生高荧光产品高) 细胞凋亡 - 胱天蛋白酶激活3/7:3/7蛋白酶的活性基染料检测。试剂是非荧光与抑制DNA结合一个4个氨基酸的肽。在胱天蛋白酶3/7的活化,该肽被裂解使染料与DNA结合,并产生一个明亮,荧光响应。面板BH显示阳性对照处理的细胞。 请点击此处查看该图的放大版本。
图7.代表性的HCS结果:1 aminonaphtalene(AE),砷(V)(f和g),铬(VI)( 香港 ),巴豆醛(LN) 和苯酚(OQ)。 4小时(蓝线)和24小时(橙色线)信号计算各剂量和归一化到车辆活性(0%)。这不包括在曲线拟合计算值显示为灰色。浓度对数标度(X轴)表示。 请点击此处查看该图的放大版本。
化验 | 端点# | 生物终点 | 细胞室 | 输出功能 |
细胞毒性 | 1 | 线粒体质量6 | 细胞质 | 现货平均面积 |
2 | 线粒体膜电位6 | 细胞质 | 现货平均强度 | |
3 | 细胞色素c释放核 | 平均强度 | | |
4 | 细胞膜的通透性8 | 核 | 平均强度 | |
DNA损伤 | 五 | 磷酸H2AX 9 | 核 | 平均强度 |
应激激酶 | 6 | 磷酸cJun 10 | 核 | 平均强度 |
ROS | 7 | ROS 11 | 核 | 平均强度 |
GSH含量 | 8 | GSH 12 | 细胞质 | 现货平均强度 |
细胞凋亡 | 9 | 胱天蛋白酶3 13 | 细胞质 | 现货平均强度 |
表1. HCS一个列表ssays和端点。
车辆 | RTCA剂量(μM) | LD 50 | HCS剂量 | |||||||||||
细胞活力选定(μM) | 3R4F(NM) | |||||||||||||
1 Aminonaphtalene | 乙醇 | 20000 | 2000 | 200 | 20 | 2 | 0.2 | 280μM | 2000 | 500 | 200 | 150 | 0.27 | |
2-硝基丙烷 | 乙醇 | 20000 | 2000 | 200 | 20 | 2 | 0.2 | > 20毫米 | ||||||
乙酰胺 | 乙醇 | 20000 | 2000 | 200 | 20 | 2 | 0.2 | > 20毫米 | ||||||
丙酮 | 水 | 20000 | 2000 | 200 | 20 | 2 | 0.2 | > 20毫米 | ||||||
丙烯酰胺 | 水 | 20000 | 2000 | 200 | 20 | 2 | 0.2 | > 20毫米 | ||||||
砷(V) | 水 | 20000 | 2000 | 200 | 20 | 2 | 0.2 | 160μM | 200 | 100 | 50 | 25 | <TD> 0.17||
苯 | 乙醇 | 20000 | 2000 | 200 | 20 | 2 | 0.2 | > 20毫米 | ||||||
铬(VI) | 水 | 20000 | 2000 | 200 | 20 | 2 | 0.2 | 20μM | 100 | 50 | 20 | 10 | 0.06 | |
巴豆醛 | 水 | 20000 | 2000 | 200 | 20 | 2 | 0.2 | 200μM | 20000 | 2000 | 200 | 20 | 2000 | |
甲乙酮 | 水 | 20000 | 2000 | 200 | 20 | 2 | 0.2 | >20毫米 | ||||||
镍 | 水 | 20000 | 2000 | 200 | 20 | 2 | 0.2 | > 20毫米 | ||||||
硝基苯 | 乙醇 | 20000 | 2000 | 200 | 20 | 2 | 0.2 | > 20毫米 | ||||||
苯酚 | 乙醇 | 20000 | 2000 | 200 | 20 | 2 | 0.2 | 2300μM | 5000 | 2000 | 1000 | 500 | 240 | |
喹啉 | 乙醇 | 20000 | 2000 | 200 | 20 | 2 | 0.2> 20毫米 | |||||||
甲苯 | 水 | 20000 | 2000 | 200 | 20 | 2 | 0.2 | > 20毫米 |
表2. 在治疗24小时 相对LD 50 测试HPHC化合物列表 。选择HCS分析化合物是橙色高亮显示和测试的剂量也给予。该3R4F剂量相当于构成本,在一个棒的从基准香烟3R4F烟雾的量。
化验 | 复合 | 原液 | 溶剂 | 剂量(多个)(μM)|||
细胞活力 | 星形孢菌素 | 10毫 | DMSO | 50 | ||
细胞毒性 | 霉素 | 10毫 | DMSO | 50 | 20 | 五 |
DNA损伤 | 百草枯 | 100毫米 | DMSO | 500 | 200 | 50 |
应激激酶 | 茴香 | 2毫米 | DMSO | 10 | 4 | 1 |
ROS | 鱼藤酮 | 200毫米 | DMSO | 1000 | 400 | 100 |
GSH含量 | 利尿酸 | 200毫米 | DMSO | 1000 | 400 | 100 |
细胞凋亡 | 星形孢菌素 | 40毫米 | DMSO | 200 </ TD> | 50 | 20 |
表3列出用于每个检测阳性对照和浓度。
Discussion
用于替代动物实验和新的高通量测试方法的需求在过去几年里得到了广泛的讨论。这已使科学家和监管当局调查标准毒性试验的替代方法,利用细胞试验紧密模仿靶组织的生理学。在这项研究中,我们已经证明结合具有高含量筛选(HCS)平台实时细胞分析仪(RTCA)评估暴露于单个CS成分对人肺上皮细胞的影响的适用性。这种设置可以类似用于评估其他各种空气污染物,空气中的颗粒,和纳米粒子诱导的细胞毒性。此外,所获得的结果可以与来自全基因组转录和计算方法基于因果生物网络相匹配。据此前报道,这种方法使我们能够证实的分子通路数据在CS曝光5与HCS终点的扰动,解决这些途径扰动也表型。
为流程图测定中,实时细胞分析提供以剂量和时间依赖性的分辨率,这允许它的剂量和暴露时间点可以是用于下游分析14有利更好的决策细胞活力相关的信息。分析仪的原理依赖于在由细胞产生的,因为它们附着和扩散上覆盖有金微电极的培养以及表面电阻抗的变化。阻抗被转换成称为小区索引一个无量纲参数,其可用于监测细胞粘附,扩散,形态和最终细胞活力。虽然该技术不提供关于细胞毒性机制的信息,其灵敏度能的,即使在非常低的剂量在所述HCS并不翔实形态学细胞变化的检测(数据未显示)。基于前雇主OU中的实验中,我们已经注意到,RTCA方法能够检测在较低剂量相比,HCS端点形态学变化。
在与实时细胞分析初步筛选中,HCS平台被用来获取关于每个HPHC引起的那种细胞毒性的更深入的信息。允许个人资料HPHCs对他们在细胞车厢潜在影响HCS检测板/细胞器以及识别那些引发遗传毒性和氧化应激。该分析揭示了不同的配置文件,从而选定HPHCs诱导NHBE细胞毒性。在一般情况下,所有的化合物中,除苯酚,发现在最高测试剂量以诱导坏死。在H2AX的癌症发展1 aminonaphtalene诱导的磷酸化的潜在作用,作为遗传毒性标志物,但是HCS面板中的线粒体毒性读出这个HPHC中还发现了活性(质量增加,细胞色素C relea一致本身)和氧化应激(GSH耗竭)。同样,如先前所描述,苯酚被确定以诱导线粒体功能障碍,并导致DNA损伤以及谷胱甘肽耗竭。铬(VI),列为I组致癌的化合物之一,和巴豆醛也都鉴定为基因毒性,特别是铬(VI)也诱导细胞凋亡(半胱天冬级联活化)和巴豆醛引起增加ROS产生。最后砷(V)中,被发现会引起cJun磷酸化这是应力激酶途径激活的标志。
在这项研究中,我们利用NHBE细胞在体外肺上皮细胞的模型。在HCS设置使用这些细胞是前所未有的,使更广泛的端点,包括遗传毒性和氧化应激标志物的调查。两个活细胞和固定细胞染色方法被我们的协议内描述的,示范的整体技术的灵活性。 f中行为,非常相同的协议可以被应用到更广泛的目标,这可以通过使用任何荧光染料或抗体的加以处理。对的活染色方案的成功执行,则尊重培养时间,因为一些染料具有有限的半衰期和荧光信号完成图像采集之前可能降低是重要的。同样重要的是要考虑到,如果使用不同的细胞类型中,所有的染色条件,应重新评估,作为最佳的染料浓度和温育时间可以是不同的。
在当前的论文中,我们描述了只有五个化合物,其中的HCS方法筛选的场景。考虑到先前描述的板布局,他们被给予超过2种不同的板集总共24板(6测定和2的时间点)板.The数量也可以增加,从而允许更多的化合物或同时筛选在不变拟多个端点的tigation。在这样做之前,但是,应该考虑到,某些端点(GSH和ROS)需要立即采集,并作为结果,板的给药应以交错的方式来执行,以允许采集先前板。另一方面,使用固定的细胞染色协议表示有利的,因为在板可堆叠,在定影后的任何步骤中断协议,用于染色过程完成在稍后阶段。这种方法,例如,将提供操作员的时间来完成所有的活细胞染色板而不损害数据质量。
通过减少板的数量进一步优化工作流程,它也将是可能的复用多个端点在一起。例如,在这种情况下DNA损伤和应激激酶可以一起研究简单地使用两个二级抗体与荧光发射的不同的Channels。所述HCS平台的不断发展,其中包括全自动细胞接种,化合物稀释,剂量和染色,以及加入的新的端点将进一步扩大HCS平台的能力,作为对上皮HPHCs和其他细胞类型的有力的分析工具。
Disclosures
所有作者都是菲莫国际的员工。菲利普莫里斯国际公司是该项目的资金和赞助商的唯一来源。
Acknowledgments
笔者想感谢Karsta Luettich和Gregory Vuillaume他们的手稿的审查。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Cellomics ArrayScan VTI HCS Reader | Thermo | N01-0002B | |
xCelligence RTCA MP | ACEA | 05331625001 | |
Screener (HCS) | Genedata | NA | |
CASY counter TTC | Roche | 05 651 719 001 | |
e-Plates VIEW 96 | ACEA | 06 472 451 001 | |
RTCA Frame 96 | ACEA | 05232392001 | |
RTCA Cardio Temperature Tool | ACEA | 2801171 | |
Plate sealer breathseal | Greiner bio-one | 676051 | |
Normal Human Bronchial Epithelial cells (NHBE) | Lonza | CC-2540 | non-smoking 60-year-old Caucasian male donor |
BEGM BulletKit | Lonza | CC-3170 | Warm at 37 °C before use |
ReagentPack Subculture Reagents kit | Lonza | CC-5034 | Warm at 37 °C before use |
Penicillin/Streptomycin (100x) | Corning | 30-002-CI | |
Easy Flask filter cap 75 cm2 | Thermo Scientific | 12-565-349 | |
96 well assay plate black | Corning | 3603 | |
Hoechst 33342 | Fisher Scientific | PI-62249 | |
Draq5 (For Far Red Nuclear Staining) | Biostatus | DR50200 | |
Mitochondrial Dye: MitoTracker Red CMXRos | Life technologies | M-7512 | |
Mitochondrial Dye: MitoTracker Red CM-H2XRos | Life technologies | M-7513 | |
ROS Dye: Dihydroethidium | Sigma | D7008 | |
ROS Dye: CellROX | Life technologies | C10422 | |
ROS Dye: MitoSOX | Life technologies | M36008 | |
GSH Dye: Monochlorobimane | Sigma | 69899 | Toxic |
GSH Dye: Monobromobimane | Life technologies | M-1378 | Toxic |
Membrane permeability Dye: YO-PRO-1 | Life technologies | Y3603 | Irritating |
Membrane permeability Dye: TO-PRO-1 | Life technologies | T3602 | Irritating |
Membrane permeability Dye: TOTO-1 | Life technologies | T3600 | Irritating |
Caspase Dye: Cellevent Caspase 3/7 green | Life technologies | C10423 | Irritating |
Anti-Cytochrome C antibody (Mouse) | Thermo | MA5-11823 | |
Anti-phospho-c-Jun antibody (Mouse) | Thermo | MA5-15889 | |
Anti-phospho-H2AX antibody (Mouse) | Thermo | MA1-2022 | |
Goat anti-Mouse IgG DyLight 650 | Abcam | ab96878 | |
10x permeabilization buffer | Fisher | 8408400 | |
4% Formaldehyde solution | Sigma | F1635 | Toxic |
10x blocking buffer | Fisher | 8408500 | |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma | D8537 | |
Hanks' Balanced Salt solution | Sigma | H8264 | |
Staurosporine | Sigma | S4400 | Toxic |
Valinomycin | Sigma | V0627 | Toxic |
Paraquat | Sigma | 36541 | Toxic |
Anisomycin | Sigma | A9789 | Toxic |
Ethacrynic acid | Sigma | E4754 | Toxic |
1-Aminonaphthalene | Sigma | 34390 | Toxic |
2-Nitropropane | Sigma | 130265 | Toxic |
Acetamide | Sigma | 695122 | Toxic |
Acetone | Sigma | 650501 | Toxic |
Acrylamide | Sigma | A9099 | Toxic |
Arsenic (V) | Sigma | A6756 | Toxic |
Benzene | Sigma | 12540 | Toxic |
Chromium (VI) | Sigma | 216623 | Toxic |
Crotonaldehyde | Sigma | 262668 | Toxic |
Methyl ethyl ketone | Sigma | 34861 | Toxic |
Nickel | Sigma | 203866 | Toxic |
Nitrobenzene | Sigma | 48547 | Toxic |
Phenol | Sigma | P5566 | Toxic |
Quinoline | Sigma | 241571 | Toxic |
Toluene | Sigma | 34866 | Toxic |
References
- Rodgman, A., Perfetti, T. A. The chemical components of tobacco and tobacco smoke. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2013).
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. The Principles of Humane Experimental Technique. , Methuen, London. (1959).
- Zock, J. M. Applications of high content screening in life science research combinatorial chemistry & high throughput screening. Comb. Chem. High. Throughput. Screen. 132 (9), 870-876 (2009).
- US Food and Drug Administration. Harmful and potentially harmful constituents in tobacco products and tobacco smoke; established list, federal register. , 20034-20037 (2012).
- Gonzalez-Suarez, I. Systems Biology Approach for Evaluating the Biological Impact of Environmental Toxicants in Vitro. Chem. Res. Toxicol. 27 (3), 367-376 (2014).
- Camilleri-Broet, S., Vanderwerff, H., Caldwell, E., Hockenbery, D. Distinct alterations in mitochondrial mass and function characterize different models of apoptosis. Exp. Cell. Res. 239 (2), 277-292 (1998).
- Li, P., et al. Cytochrome c and dATP-dependent formation of Apaf-1/caspase-9 complex initiates and apoptotic protease cascade. Cell. 91 (4), 479-489 (1997).
- Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. Double strand breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. J. Biol. Chem. 273 (10), 5858-5868 (1998).
- Westwick, J. K., Weitzel, C., Minden, A., Karin, M., Brenner, D. A. Tumor necrosis factor α stimulates AP-1 activity through prolonged activation of the c-jun kinase. J. Biol. Chem. 269 (42), 26396-26401 (1994).
- Bindokas, V. P., Jordán, J., Lee, C. C., Miller, R. J. Superoxide production in rat hippocampal neurons: selective imaging with hydroethidine. J. Neurosci. 16 (4), 1324-1336 (1996).
- Barhoumi, R., Bailey, R. H., Burghardt, R. C. Kinetic analysis of glutathione in anchored cells with monochlorobimane. J. Cytometry. 19 (3), 226-234 (1994).
- Huang, T. C., Lee, J. F., Chen, J. Y. Pardaxin an antimicrobial peptide, triggers caspase-dependent and ROS-mediated apoptosis in HT-1080 Cells. Mar. Drugs. 9 (10), 1995-2009 (2011).
- Bao, S., Knoell, D. L. Zinc modulates cytokine-induced lung epithelial cell barrier permeability. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 291 (6), L1132-L1141 (2006).
- Xia, M., et al. Compound Cytotoxicity Profiling Using Quantitative High-Throughput Screening. Environ Health Perspect. 116 (3), 284-291 (2008).