A través del espejo: Microscopía de lapso de tiempo y de seguimiento longitudinal de las células individuales para el Estudio de la terapéutica contra el cáncer
Summary
Here, we describe a method of long-term time-lapse microscopy to longitudinally track single cells in response to anti-cancer therapeutics.
Abstract
La respuesta de las células individuales a los medicamentos contra el cáncer contribuye de manera significativa en la determinación de la respuesta de la población, y por lo tanto es un factor contribuyente importante en el resultado global. Inmunotransferencia, citometría de flujo y experimentos con células fijas se utiliza a menudo para estudiar cómo las células responden a los fármacos contra el cáncer. Estos métodos son importantes, pero tienen varias deficiencias. La variabilidad en las respuestas de drogas entre el cáncer y las células normales, y entre las células del cáncer de origen diferente, y transitoria y respuestas raras son difíciles de entender utilizando ensayos de promedio de la población y sin ser capaz de rastrear y analizar longitudinalmente directamente. El microscopio está particularmente bien adaptado a las células de imágenes en vivo. Los avances en la tecnología nos permiten rutinariamente celdas de imagen a una resolución que permite no sólo el seguimiento de celda, sino también de la observación de una variedad de respuestas celulares. Se describe un enfoque en el detalle que permite la formación de imágenes continua de lapso de tiempo delas células durante la respuesta a los fármacos para la esencia tanto como se desee, típicamente hasta 96 horas. El uso de variaciones del enfoque, las células pueden ser monitorizados por semana. Con el empleo de biosensores fluorescentes genéticamente codificados procesos numerosas vías, y las respuestas pueden ser seguidos. Mostramos ejemplos que incluyen el seguimiento y la cuantificación del crecimiento celular y la progresión del ciclo celular, dinámica de los cromosomas, daño en el ADN, y la muerte celular. También se discuten las variaciones de la técnica y su flexibilidad, y poner de relieve algunos errores comunes.
Introduction
La microscopía de células vivas y el seguimiento longitudinal de las células individuales no es una técnica nueva. Desde los primeros microscopios, los aficionados y los científicos han observado y estudiado las células individuales y organismos, sus comportamientos y desarrollo 1-3. Un ejemplo famoso de la tarde David Rogers de la Universidad de Vanderbilt, en la década de 1950 muestra una neutrófilos humanos en un frotis de sangre persiguiendo una bacteria Staphylococcus aureus y, finalmente, el proceso de fagocitosis 4. Esta película en vivo de células es un excelente ejemplo de cómo los procesos se pueden observar múltiples y correlacionada en un solo experimento: detección de un gradiente químico, la mecánica y la velocidad de la motilidad celular, célula da forma a la dinámica, la adherencia y la fagocitosis de un patógeno.
El advenimiento de los microscopios totalmente automatizados y cámaras digitales de alta sensibilidad se ha traducido en un número cada vez mayor de investigadores usando microscopía de hacer preguntas fundamentales de la biología celular que van from cómo las células se mueven 5,6 y 7,8 dividen a orgánulos dinámica y el tráfico de membrana 9-11. No fluorescente, la microscopía de campo claro, incluyendo contraste de fase (PC), que obtuvo el Premio Nobel de Frits Zernike en 1953, y el contraste de interferencia diferencial (DIC) permitir la observación de células y núcleos sino también las estructuras subcelulares incluyendo haces de microtúbulos , cromosomas, nucleolos, la dinámica de los orgánulos, y fibras de actina gruesas 12. Genéticamente codificada proteínas fluorescentes y el desarrollo de los tintes fluorescentes contra orgánulos han repercutido notablemente en la microscopía de lapso de tiempo 13-15. Aunque no es el foco de este artículo, las imágenes en esferoides celulares e in situ (microscopía intravital) utilizando confocal y microscopía multifotónica representan otra expansión del enfoque, y hay artículos en circulación que usan y discutir estos enfoques 16-19.
Las respuestas de las células a la lucha contra la cancmedicamentos er o productos naturales se determinan en la escala molecular y celular. Comprensión de las respuestas celulares y los destinos después del tratamiento a menudo implica población ensayos de promedio (por ejemplo., Inmunotransferencia, medidas integrales así), o los puntos de tiempo fijos con la detección de inmunofluorescencia y citometría de flujo, que miden las células individuales. La heterogeneidad en las respuestas de células individuales a los fármacos dentro de una población, en particular en los tumores, puede explicar algunas de la variabilidad en la respuesta visto a través de las líneas celulares y los tumores que se tratan con el mismo fármaco a saturación. A largo plazo enfoques longitudinales para seguir una sola célula dada o una población de células es un enfoque menos común, pero muy poderosa que permite el estudio directo de las vías de respuesta moleculares, diferentes fenotipos (por ejemplo., La muerte celular o la división celular), la observación de la variabilidad de célula a célula dentro de una población, y cómo estos factores contribuyen a la dinámica de respuesta de la población de 20-22. Con optimismo, pudiendopara observar y cuantificar las respuestas de células individuales ayudará a mejorar nuestra comprensión de cómo funcionan las drogas, ¿por qué a veces no, y cómo utilizarlos mejor de ellos.
La técnica de microscopía de largo plazo de lapso de tiempo, el seguimiento longitudinal, y el análisis de las respuestas de drogas está disponible para muchos investigadores y puede ser simple, utilizando únicamente la luz transmitida para observar las respuestas fenotípicas 20,21. Los principales componentes del enfoque incluyen: preparación adecuada de las células de interés, un microscopio automatizado con cámara ambiental, una cámara integrada con un ordenador para adquirir y almacenar las imágenes, y software para revisar el lapso de tiempo y medir y analizar las células y cualquier biosensores fluorescentes. Proporcionamos un protocolo detallado con muchos consejos para llevar a cabo la microscopía de lapso de tiempo de las células cultivadas durante el tiempo que el uso de varios días de campo claro y / o microscopía de epifluorescencia de campo amplio. Este protocolo se puede utilizar para cualquier línea celular que se puede cultivar en cultivopara estudiar sus respuestas a las terapias contra el cáncer. Proporcionamos ejemplos de datos adquiridos y analizados mediante múltiples diferentes biosensores fluorescentes codificadas genéticamente y un ejemplo de la microscopía de contraste de fase, discutir brevemente los diferentes tipos de sondas, las ventajas y desventajas de largo plazo de lapso de tiempo y el seguimiento longitudinal, lo que puede ser aprendido de este enfoque que es difícil de entender desde enfoques no directos, y algunas variaciones que esperamos que sea de interés y utilidad para los investigadores sin experiencia que no han considerado el uso del enfoque, y para los investigadores experimentados.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ventajas de la microscopía de lapso de tiempo y Seguimiento Longitudinal
El microscopio es un instrumento ideal para los estudios longitudinales de respuesta a los fármacos, ya que permite a los investigadores rastrear las células individuales y sus destinos, así como a toda la población. La variabilidad en la respuesta a los fármacos dentro de una población de células es un problema importante para el diseño terapéutica contra el cáncer. seguimiento longitudinal …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Joshua Marcus for technical support and Jolien Tyler, Ph.D., Director of the Richard J. McIntosh Light Microscopy Core Facility, for technical advice. This work was supported by funds from the University of Colorado Boulder and the University of Colorado Boulder Graduate School to J.D.O. R.T.B. is partially supported by pre-doctoral training grant from the NIH (T32 GM008759). We thank Karyopharm Therapeutics, Inc. for selinexor and Merck Serono for Kinesin-5 inhibitor. FUCCI plasmids are from Atsushi Miyawaki (RIKEN, Japan) via MTA. mCherry-BP1-2 was from Addgene. HeLa expressing H2b-mCherry and β-tubulin-EGFP are from Daniel Gerlich (IMBA, Austrian Academy of Sciences, Austria).
Materials
| Taxol (paclitaxel) | Sigma | T7191 | microtubule stabilizing drug |
| etoposide | Selleckchem | S1225 | topoisomerase II inhibitor |
| selinexor | Karyopharm Therapeutics | na | XPO1/CRM1 inhibitor, gift |
| Kinesin-5 inhibitor | Merck Serono | na | gift, also available from American Custom Chemicals Corporation. CAS 858668-07-2 |
| cell growth medium | HyClone (Fisher) or Mediatech | many companies available | |
| 5% CO2/balance air, certified | Airgas | Z03NI7222004379 | |
| 35mm dish, 20mm glass bottom | Cellvis | D35-20-1.5-N | many companies available |
| 35mm 4 well dish, 20mm glass bottom | Cellvis | D35C4-20-1.5-N | many companies available |
| 35mm dish, gridded glass bottom | MatTek | P35G-2-14-CGRD | many companies available |
| multi-well, glass bottom | Cellvis | P12-1.5H-N | many companies available |
| Olympus IX81 inverted epifluorescence microscope | Olympus | ||
| Olympus IX2-UCB controller | Olympus | ||
| PRIOR LumenPro200 | Prior Scientific | Lumen200PRO | |
| PRIOR Proscan III motorized stage | Prio Scientific | H117 | |
| STEV chamber | InVivo Scientific | STEV.ECU.HC5 STAGE TOP | |
| Environmental Controller Unit | InVivo Scientific | STEV.ECU.HC5 STAGE TOP | |
| Hamamatsu ORCA R2 CCD with controller | Hamamatsu | C10600 | |
| Nikon Eclipse Ti | Nikon | ||
| Nikon laser launch | Nikon | ||
| SOLA light engine | lumencor | ||
| iXon Ultra 897 EM-CCD | ANDOR | ||
| TOKAI HIT inclubation chamber | TOKAI HIT | TIZSH |
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