Summary

A través del espejo: Microscopía de lapso de tiempo y de seguimiento longitudinal de las células individuales para el Estudio de la terapéutica contra el cáncer

Published: May 14, 2016
doi:

Summary

Here, we describe a method of long-term time-lapse microscopy to longitudinally track single cells in response to anti-cancer therapeutics.

Abstract

La respuesta de las células individuales a los medicamentos contra el cáncer contribuye de manera significativa en la determinación de la respuesta de la población, y por lo tanto es un factor contribuyente importante en el resultado global. Inmunotransferencia, citometría de flujo y experimentos con células fijas se utiliza a menudo para estudiar cómo las células responden a los fármacos contra el cáncer. Estos métodos son importantes, pero tienen varias deficiencias. La variabilidad en las respuestas de drogas entre el cáncer y las células normales, y entre las células del cáncer de origen diferente, y transitoria y respuestas raras son difíciles de entender utilizando ensayos de promedio de la población y sin ser capaz de rastrear y analizar longitudinalmente directamente. El microscopio está particularmente bien adaptado a las células de imágenes en vivo. Los avances en la tecnología nos permiten rutinariamente celdas de imagen a una resolución que permite no sólo el seguimiento de celda, sino también de la observación de una variedad de respuestas celulares. Se describe un enfoque en el detalle que permite la formación de imágenes continua de lapso de tiempo delas células durante la respuesta a los fármacos para la esencia tanto como se desee, típicamente hasta 96 horas. El uso de variaciones del enfoque, las células pueden ser monitorizados por semana. Con el empleo de biosensores fluorescentes genéticamente codificados procesos numerosas vías, y las respuestas pueden ser seguidos. Mostramos ejemplos que incluyen el seguimiento y la cuantificación del crecimiento celular y la progresión del ciclo celular, dinámica de los cromosomas, daño en el ADN, y la muerte celular. También se discuten las variaciones de la técnica y su flexibilidad, y poner de relieve algunos errores comunes.

Introduction

La microscopía de células vivas y el seguimiento longitudinal de las células individuales no es una técnica nueva. Desde los primeros microscopios, los aficionados y los científicos han observado y estudiado las células individuales y organismos, sus comportamientos y desarrollo 1-3. Un ejemplo famoso de la tarde David Rogers de la Universidad de Vanderbilt, en la década de 1950 muestra una neutrófilos humanos en un frotis de sangre persiguiendo una bacteria Staphylococcus aureus y, finalmente, el proceso de fagocitosis 4. Esta película en vivo de células es un excelente ejemplo de cómo los procesos se pueden observar múltiples y correlacionada en un solo experimento: detección de un gradiente químico, la mecánica y la velocidad de la motilidad celular, célula da forma a la dinámica, la adherencia y la fagocitosis de un patógeno.

El advenimiento de los microscopios totalmente automatizados y cámaras digitales de alta sensibilidad se ha traducido en un número cada vez mayor de investigadores usando microscopía de hacer preguntas fundamentales de la biología celular que van from cómo las células se mueven 5,6 y 7,8 dividen a orgánulos dinámica y el tráfico de membrana 9-11. No fluorescente, la microscopía de campo claro, incluyendo contraste de fase (PC), que obtuvo el Premio Nobel de Frits Zernike en 1953, y el contraste de interferencia diferencial (DIC) permitir la observación de células y núcleos sino también las estructuras subcelulares incluyendo haces de microtúbulos , cromosomas, nucleolos, la dinámica de los orgánulos, y fibras de actina gruesas 12. Genéticamente codificada proteínas fluorescentes y el desarrollo de los tintes fluorescentes contra orgánulos han repercutido notablemente en la microscopía de lapso de tiempo 13-15. Aunque no es el foco de este artículo, las imágenes en esferoides celulares e in situ (microscopía intravital) utilizando confocal y microscopía multifotónica representan otra expansión del enfoque, y hay artículos en circulación que usan y discutir estos enfoques 16-19.

Las respuestas de las células a la lucha contra la cancmedicamentos er o productos naturales se determinan en la escala molecular y celular. Comprensión de las respuestas celulares y los destinos después del tratamiento a menudo implica población ensayos de promedio (por ejemplo., Inmunotransferencia, medidas integrales así), o los puntos de tiempo fijos con la detección de inmunofluorescencia y citometría de flujo, que miden las células individuales. La heterogeneidad en las respuestas de células individuales a los fármacos dentro de una población, en particular en los tumores, puede explicar algunas de la variabilidad en la respuesta visto a través de las líneas celulares y los tumores que se tratan con el mismo fármaco a saturación. A largo plazo enfoques longitudinales para seguir una sola célula dada o una población de células es un enfoque menos común, pero muy poderosa que permite el estudio directo de las vías de respuesta moleculares, diferentes fenotipos (por ejemplo., La muerte celular o la división celular), la observación de la variabilidad de célula a célula dentro de una población, y cómo estos factores contribuyen a la dinámica de respuesta de la población de 20-22. Con optimismo, pudiendopara observar y cuantificar las respuestas de células individuales ayudará a mejorar nuestra comprensión de cómo funcionan las drogas, ¿por qué a veces no, y cómo utilizarlos mejor de ellos.

La técnica de microscopía de largo plazo de lapso de tiempo, el seguimiento longitudinal, y el análisis de las respuestas de drogas está disponible para muchos investigadores y puede ser simple, utilizando únicamente la luz transmitida para observar las respuestas fenotípicas 20,21. Los principales componentes del enfoque incluyen: preparación adecuada de las células de interés, un microscopio automatizado con cámara ambiental, una cámara integrada con un ordenador para adquirir y almacenar las imágenes, y software para revisar el lapso de tiempo y medir y analizar las células y cualquier biosensores fluorescentes. Proporcionamos un protocolo detallado con muchos consejos para llevar a cabo la microscopía de lapso de tiempo de las células cultivadas durante el tiempo que el uso de varios días de campo claro y / o microscopía de epifluorescencia de campo amplio. Este protocolo se puede utilizar para cualquier línea celular que se puede cultivar en cultivopara estudiar sus respuestas a las terapias contra el cáncer. Proporcionamos ejemplos de datos adquiridos y analizados mediante múltiples diferentes biosensores fluorescentes codificadas genéticamente y un ejemplo de la microscopía de contraste de fase, discutir brevemente los diferentes tipos de sondas, las ventajas y desventajas de largo plazo de lapso de tiempo y el seguimiento longitudinal, lo que puede ser aprendido de este enfoque que es difícil de entender desde enfoques no directos, y algunas variaciones que esperamos que sea de interés y utilidad para los investigadores sin experiencia que no han considerado el uso del enfoque, y para los investigadores experimentados.

Protocol

El siguiente protocolo utiliza los parámetros definidos por los experimentos en las Figuras 4 y 6 ajustes de adquisición con respecto a y las condiciones experimentales. Muchos de estos parámetros pueden ser modificados para adaptarse a otros experimentos (es decir, los tiempos de exposición, de agrupación, canales fluorescentes, etc.). Todos los procedimientos deben cumplir con las directrices y normas institucionales y ser aprobados por el comité institucional …

Representative Results

A largo plazo la microscopía de lapso de tiempo y el seguimiento longitudinal directa permite el estudio de muchos efectos contra el cáncer durante la respuesta a los fármacos. Siguiendo el esquema general en la Figura 1, múltiples ejemplos de células se muestran expresión de reporteros fluorescentes validados que trata con fármacos anti-cáncer, orugas, y se analizaron usando diferentes enfoques. Fase …

Discussion

Ventajas de la microscopía de lapso de tiempo y Seguimiento Longitudinal

El microscopio es un instrumento ideal para los estudios longitudinales de respuesta a los fármacos, ya que permite a los investigadores rastrear las células individuales y sus destinos, así como a toda la población. La variabilidad en la respuesta a los fármacos dentro de una población de células es un problema importante para el diseño terapéutica contra el cáncer. seguimiento longitudinal …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank Joshua Marcus for technical support and Jolien Tyler, Ph.D., Director of the Richard J. McIntosh Light Microscopy Core Facility, for technical advice. This work was supported by funds from the University of Colorado Boulder and the University of Colorado Boulder Graduate School to J.D.O. R.T.B. is partially supported by pre-doctoral training grant from the NIH (T32 GM008759). We thank Karyopharm Therapeutics, Inc. for selinexor and Merck Serono for Kinesin-5 inhibitor. FUCCI plasmids are from Atsushi Miyawaki (RIKEN, Japan) via MTA. mCherry-BP1-2 was from Addgene. HeLa expressing H2b-mCherry and β-tubulin-EGFP are from Daniel Gerlich (IMBA, Austrian Academy of Sciences, Austria).

Materials

Taxol (paclitaxel) Sigma T7191 microtubule stabilizing drug
etoposide Selleckchem S1225 topoisomerase II inhibitor
selinexor Karyopharm Therapeutics na XPO1/CRM1 inhibitor, gift
Kinesin-5 inhibitor Merck Serono na gift, also available from American Custom Chemicals Corporation. CAS 858668-07-2
cell growth medium HyClone (Fisher) or Mediatech many companies available
5% CO2/balance air, certified Airgas Z03NI7222004379
35mm dish, 20mm glass bottom Cellvis D35-20-1.5-N many companies available
35mm 4 well dish, 20mm glass bottom Cellvis D35C4-20-1.5-N many companies available
35mm dish, gridded glass bottom MatTek P35G-2-14-CGRD many companies available
multi-well, glass bottom Cellvis P12-1.5H-N many companies available
Olympus IX81 inverted epifluorescence microscope Olympus
Olympus IX2-UCB controller Olympus
PRIOR LumenPro200 Prior Scientific Lumen200PRO
PRIOR Proscan III motorized stage Prio Scientific H117
STEV chamber InVivo Scientific STEV.ECU.HC5 STAGE TOP
Environmental Controller Unit InVivo Scientific STEV.ECU.HC5 STAGE TOP
Hamamatsu ORCA R2 CCD with controller Hamamatsu C10600
Nikon Eclipse Ti Nikon
Nikon laser launch Nikon
SOLA light engine lumencor
iXon Ultra 897 EM-CCD ANDOR 
TOKAI HIT inclubation chamber TOKAI HIT TIZSH

References

  1. Abercrombie, M., Heaysman, J. E., Pegrum, S. M. The locomotion of fibroblasts in culture I. Movements of the leading edge. Exp Cell Res. 59, 393-398 (1970).
  2. Abercrombie, M., Heaysman, J. E. Observations on the social behaviour of cells in tissue culture. I. Speed of movement of chick heart fibroblasts in relation to their mutual contacts. Exp Cell Res. 5, 111-131 (1953).
  3. Landecker, H. Seeing things: from microcinematography to live cell imaging. Nat Methods. 6, 707-709 (2009).
  4. van Roosmalen, W., Le Devedec, S. E., Zovko, S., de Bont, H., Bvan de Water, . Functional screening with a live cell imaging-based random cell migration assay. Methods Mol Biol. 769, 435-448 (2011).
  5. Krueger, E. W., Orth, J. D., Cao, H., McNiven, M. A. A dynamin-cortactin-Arp2/3 complex mediates actin reorganization in growth factor-stimulated cells. Mol Biol Cell. 14, 1085-1096 (2003).
  6. Cluet, D., Stebe, P. N., Riche, S., Spichty, M., Delattre, M. Automated high-throughput quantification of mitotic spindle positioning from DIC movies of Caenorhabditis embryos. PLoS One. 9 (e93718), (2014).
  7. Held, M., et al. Cell Cognition: time-resolved phenotype annotation in high-throughput live cell imaging. Nat Methods. 7, 747-754 (2010).
  8. Orth, J. D., Krueger, E. W., Weller, S. G., McNiven, M. A. A novel endocytic mechanism of epidermal growth factor receptor sequestration and internalization. Cancer Res. 66, 3603-3610 (2006).
  9. Rowland, A. A., Chitwood, P. J., Phillips, M. J., Voeltz, G. K. ER contact sites define the position and timing of endosome fission. Cell. 159, 1027-1041 (2014).
  10. Merrifield, C. J., Feldman, M. E., Wan, L., Almers, W. Imaging actin and dynamin recruitment during invagination of single clathrin-coated pits. Nat Cell Biol. 4, 691-698 (2002).
  11. Centonze Frohlich, V. Phase contrast and differential interference contrast (DIC) microscopy. J Vis Exp. , (2008).
  12. Drummen, G. P. Fluorescent probes and fluorescence (microscopy) techniques–illuminating biological and biomedical research. Molecules. 17, 14067-14090 (2012).
  13. Guan, Y., et al. Live-cell multiphoton fluorescence correlation spectroscopy with an improved large Stokes shift fluorescent protein. Mol Biol Cell. 26, 2054-2066 (2015).
  14. Snapp, E. L. Fluorescent proteins: a cell biologist’s user guide. Trends Cell Biol. 19, 649-655 (2009).
  15. Orth, J. D., et al. Analysis of mitosis and antimitotic drug responses in tumors by in vivo microscopy and single-cell pharmacodynamics. Cancer Res. 71, 4608-4616 (2011).
  16. Brown, E., Munn, L. L., Fukumura, D., Jain, R. K. In vivo imaging of tumors. Cold Spring Harb Protoc. (5452), (2010).
  17. Chittajallu, D. R., et al. In vivo cell-cycle profiling in xenograft tumors by quantitative intravital microscopy. Nat Methods. 12, 577-585 (2015).
  18. Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer. J Vis Exp. (50088), (2013).
  19. Orth, J. D., et al. Quantitative live imaging of cancer and normal cells treated with Kinesin-5 inhibitors indicates significant differences in phenotypic responses and cell fate. Mol Cancer Ther. 7, 3480-3489 (2008).
  20. Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. Cancer cells display profound intra- and interline variation following prolonged exposure to antimitotic drugs. Cancer Cell. 14, 111-122 (2008).
  21. Yang, R., Niepel, M., Mitchison, T. K., Sorger, P. K. Dissecting variability in responses to cancer chemotherapy through systems pharmacology. Clin Pharmacol Ther. 88, 34-38 (2010).
  22. Orth, J. D., McNiven, M. A. Get off my back! Rapid receptor internalization through circular dorsal ruffles. Cancer Res. 66, 11094-11096 (2006).
  23. Li, J., et al. Co-inhibition of polo-like kinase 1 and Aurora kinases promotes mitotic catastrophe. Oncotarget. 6, 9327-9340 (2015).
  24. Orth, J. D., Loewer, A., Lahav, G., Mitchison, T. J. Prolonged mitotic arrest triggers partial activation of apoptosis, resulting in DNA damage and p53 induction. Mol Biol Cell. 23, 567-576 (2012).
  25. Batchelor, E., Loewer, A., Mock, C., Lahav, G. Stimulus-dependent dynamics of p53 in single cells. Mol Syst Biol. 7 (488), (2011).
  26. Purvis, J. E., et al. p53 dynamics control cell fate. Science. 336, 1440-1444 (2012).
  27. Zhang, C. Z., Leibowitz, M. L., Pellman, D. Chromothripsis and beyond: rapid genome evolution from complex chromosomal rearrangements. Genes Dev. 27, 2513-2530 (2013).
  28. Zhang, C. Z., et al. Chromothripsis from DNA damage in micronuclei. Nature. 522, 179-184 (2015).
  29. Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132, 487-498 (2008).
  30. Neggers, J. E., et al. Identifying drug-target selectivity of small-molecule CRM1/XPO1 inhibitors by CRISPR/Cas9 genome editing. Chem Biol. 22, 107-116 (2015).
  31. Gravina, G. L., et al. XPO1/CRM1-Selective Inhibitors of Nuclear Export (SINE) reduce tumor spreading and improve overall survival in preclinical models of prostate cancer (PCa). Journal of hematology and oncology. 7 (46), (2014).
  32. Mendonca, J., et al. Selective inhibitors of nuclear export (SINE) as novel therapeutics for prostate cancer. Oncotarget. 5, 6102-6112 (2014).
  33. Marcus, J. M., Burke, R. T., DeSisto, J. A., Landesman, Y., Orth, J. D. Longitudinal tracking of single live cancer cells to understand cell cycle effects of the nuclear export inhibitor, selinexor. Scientific reports. 5, 14391 (2015).
  34. Senapedis, W. T., Baloglu, E., Landesman, Y. Clinical translation of nuclear export inhibitors in cancer. Semin Cancer Biol. 27, 74-86 (2014).
  35. Dimitrova, N., Chen, Y. C., Spector, D. L., de Lange, T. 53BP1 promotes non-homologous end joining of telomeres by increasing chromatin mobility. Nature. 456, 524-528 (2008).
  36. D’Arpa, P., Beardmore, C., Liu, L. F. Involvement of nucleic acid synthesis in cell killing mechanisms of topoisomerase poisons. Cancer Res. 50, 6919-6924 (1990).
  37. Palmitelli, M., de Campos-Nebel, M., Gonzalez-Cid, M. Progression of chromosomal damage induced by etoposide in G2 phase in a DNA-PKcs-deficient context. Chromosome research : an international journal on the molecular, supramolecular and evolutionary aspects of chromosome biology. , (2015).
  38. Albeck, J. G., Burke, J. M., Spencer, S. L., Lauffenburger, D. A., Sorger, P. K. Modeling a snap-action, variable-delay switch controlling extrinsic cell death. PLoS biology. 6, 2831-2852 (2008).
  39. N’Diaye, E. N., et al. PLIC proteins or ubiquilins regulate autophagy-dependent cell survival during nutrient starvation. EMBO reports. 10, 173-179 (2009).
  40. Xu, J., Liu, Z. F., Wang, J., Deng, P., Jiang, Y. Study of localization and translocation of human high mobility group protein B1 in eukaryotic cells. Zhongguo wei zhong bing ji jiu yi xue = Chinese critical care medicine = Zhongguo weizhongbing jijiuyixue. 18, 338-341 (2006).
  41. Hoppe, G., Talcott, K. E., Bhattacharya, S. K., Crabb, J. W., Sears, J. E. Molecular basis for the redox control of nuclear transport of the structural chromatin protein Hmgb1. Exp Cell Res. 312, 3526-3538 (2006).
  42. Moshfegh, Y., Bravo-Cordero, J. J., Miskolci, V., Condeelis, J., Hodgson, L. A Trio-Rac1-Pak1 signalling axis drives invadopodia disassembly. Nat Cell Biol. 16, 574-586 (2014).
  43. Yu, X., Machesky, L. M. Cells assemble invadopodia-like structures and invade into matrigel in a matrix metalloprotease dependent manner in the circular invasion assay. PLoS One. 7 (e30605), (2012).
  44. Neumann, B., et al. Phenotypic profiling of the human genome by time-lapse microscopy reveals cell division genes. Nature. 464, 721-727 (2010).
  45. Burnette, D. T., et al. A role for actin arcs in the leading-edge advance of migrating cells. Nat Cell Biol. 13, 371-381 (2011).
  46. Matov, A., et al. Analysis of microtubule dynamic instability using a plus-end growth marker. Nat Methods. 7, 761-768 (2010).
  47. Wollman, R., Meyer, T. Coordinated oscillations in cortical actin and Ca2+ correlate with cycles of vesicle secretion. Nat Cell Biol. 14, 1261-1269 (2012).
  48. Day, R. N., Davidson, M. W. The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging. Chemical Society reviews. 38, 2887-2921 (2009).
  49. Kilgore, J. A., Dolman, N. J., Davidson, M. W., Robinson, J. .. . P. a. u. l., et al. A review of reagents for fluorescence microscopy of cellular compartments and structures, Part II: reagents for non-vesicular organelles. Current protocols in cytometry. 66, (2013).
  50. Pittet, M. J., Weissleder, R. Intravital imaging. Cell. 147, 983-991 (2011).
  51. Shi, J., Zhou, Y., Huang, H. C., Mitchison, T. J. Navitoclax (ABT-263) accelerates apoptosis during drug-induced mitotic arrest by antagonizing Bcl-xL. Cancer Res. 71, 4518-4526 (2011).
  52. Tan, N., et al. Navitoclax enhances the efficacy of taxanes in non-small cell lung cancer models. Clin Cancer Res. 17, 1394-1404 (2011).
  53. Ramapathiran, L., et al. Single-cell imaging of the heat-shock response in colon cancer cells suggests that magnitude and length rather than time of onset determines resistance to apoptosis. J Cell Sci. 127, 609-619 (2014).

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Burke, R. T., Orth, J. D. Through the Looking Glass: Time-lapse Microscopy and Longitudinal Tracking of Single Cells to Study Anti-cancer Therapeutics. J. Vis. Exp. (111), e53994, doi:10.3791/53994 (2016).

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