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Immunology and Infection

मेटाबोलिक phenotypes भिन्न के साथ अपरिपक्व, परिपक्व और Tolerogenic वृक्ष के समान कोशिकाओं की पीढ़ी

Published: June 22, 2016 doi: 10.3791/54128
Automatic Translation
1, 1, 2, 1,3
1Translational Immunology, Institute of Molecular and Cell Biology, Agency for Science, Technology and Research, 2Singapore Immunology Network, 3Institute of Biomedical Studies, Baylor University

Abstract

प्रतिजन गैर विशिष्ट सहज प्रतिरक्षा प्रणाली और विशिष्ट प्रतिजन अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली के बीच एक जटिल परस्पर क्रिया से प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का परिणाम है। प्रतिरक्षा प्रणाली आत्म अणुओं को सहिष्णुता बनाए रखने और रोगजनकों के लिए तेजी से प्रतिक्रिया में एक निरंतर संतुलन है। वृक्ष के समान कोशिकाओं (डीसी) शक्तिशाली पेशेवर प्रतिजन कोशिकाओं कि अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली के लिए सहज प्रतिरक्षा प्रणाली से जोड़ने और आत्म और गैर आत्म बीच अनुकूली प्रतिक्रिया को संतुलित कर रहे हैं। परिपक्वता संकेतों पर निर्भर करता है, अपरिपक्व वृक्ष के समान कोशिकाओं चुनिंदा immunogenic या tolerogenic डीसी में अंतर करने के लिए प्रेरित किया जा सकता है। Immunogenic वृक्ष के समान कोशिकाओं क्लोनल विस्तार के लिए विशिष्ट प्रतिजन टी कोशिकाओं को प्रसार संकेतों प्रदान करते हैं; tolerogenic वृक्ष के समान कोशिकाओं प्रतिजन विशेष टी सेल विलोपन या नियामक टी कोशिकाओं की क्लोनल विस्तार से सहिष्णुता को विनियमित करते हैं। इस अनूठी संपत्ति के कारण, वृक्ष के समान कोशिकाओं को अत्यधिक कैंसर और स्व-प्रतिरक्षित डीआईएसई के लिए के रूप में चिकित्सीय एजेंट के बाद की मांग कर रहे हैंases। वृक्ष के समान कोशिकाओं इन विट्रो में विशिष्ट एंटीजन के साथ भरी हुई है और मानव शरीर में इंजेक्शन एक विशिष्ट प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया दोनों immunogenic और tolerogenic माउंट करने के लिए किया जा सकता है। इस काम monocytes, अपरिपक्व monocyte व्युत्पन्न वृक्ष के समान कोशिकाओं (moDCs), tolerogenic और परिपक्व moDCs कि सतह मार्कर अभिव्यक्ति, समारोह और चयापचय phenotypes में अलग से इन विट्रो में उत्पन्न करने के लिए एक साधन प्रस्तुत करता है।

Introduction

डीसी पहले देर से उन्नीसवीं सदी में पॉल आइलेट्स (Langerhans कोशिकाओं) द्वारा वर्णित के रूप में Jolles 1 द्वारा संदर्भित और 1973 के जो उन्हें पेशेवर प्रतिजन कोशिकाओं 2 के रूप में मान्यता में राल्फ Steinman और Zanvil कोहन की विशेषता थी। डीसी परिधीय रक्त में और इस तरह के त्वचा (Langerhans कोशिकाओं के रूप में उपस्थित) के रूप में और नाक, फेफड़े, पेट के अस्तर और आंतों जो सक्षम में शरीर, बाहरी वातावरण के संपर्क में हैं कि ऊतकों में विशेष रूप से प्रचुर मात्रा में से ज्यादातर के ऊतकों में पाया जाता है उन्हें बाह्य एंटीजन मुठभेड़ की। अपरिपक्व डीसी endocytic क्षमता है, लेकिन अपेक्षाकृत कम क्षमता टी कोशिकाओं 3 प्रोत्साहित करने के लिए है। अपरिपक्व डीसी विभिन्न पैटर्न मान्यता रिसेप्टर्स (PRRS) उस पर कब्जा रोगज़नक़ जुड़े आणविक पैटर्न (PAMPs) या क्षति से जुड़े आणविक पैटर्न (damps) 4 व्यक्त करते हैं। को सक्रिय खतरे का संकेत immunogenic डीसी की ओर परिपक्वता ड्राइव करते हुए आत्म अणुओं टी सेल unresponsivene में परिणामएस एस और apoptosis 5। Immunogenic डीसी MHC अणुओं और सह उत्तेजक सतह अणुओं और प्रधानमंत्री भोले टी कोशिकाओं 6.7 करने के लिए अपनी क्षमता का अपरेगुलेशन की विशेषता है।

अपरिपक्व DCs भी विटामिन डी 3 मेटाबोलाइट 1 ए, 25 (ओ) 2 डी से 3 और कुछ immunosuppressive एजेंटों इंटरल्युकिन-10 (आईएल -10) की तरह, dexamethasone और 8-9 rapamycin के जवाब में एक Treg उत्प्रेरण या tolerogenic राज्य की ओर से परिपक्व जा सकता है। Tolerogenic डीसी immunoreceptor tyrosine आधारित निरोधात्मक रूपांकनों (ITIMs) सतह रिसेप्टर्स और ligands युक्त उनकी अभिव्यक्ति की विशेषता है। Tolerogenic डीसी में ILT परिवार के सदस्यों, ILT3 और ILT4 युक्त ITIMs के संकेत पारगमन alloproliferation रोकना और ड्राइव Foxp3 + Treg विस्तार 10,11। Tolerogenic डीसी के इन अद्वितीय गुण विवो में उनकी गहन शक्ति, अर्थात् प्रत्यारोपित एलोजेनिक ग्राफ्ट और suppr करने के लिए टिकाऊ सहिष्णुता के लिए प्रेरित करने की क्षमता के लिए नेतृत्वस्व-प्रतिरक्षित बीमारियों के विकास ईएसएस। Tolerogenic डीसी परिपक्व ध्रुवीकरण DCs जो प्रतिरक्षा सक्रियण के निषेध में समारोह का एक उपप्रकार के रूप में इसलिए देखी जा सकती है।

Plasmacytoid डीसी और माइलॉयड DCs 12: वर्तमान में, वहाँ मानव परिधीय रक्त में वृक्ष के समान कोशिकाओं के दो सामान्य उपसमुच्चय है। परिसंचारी डीसी मानव रक्त में ल्यूकोसाइट्स की 2% से कम करने के लिए दुर्लभ गठन कर रहे हैं और यह उनके immunoregulatory कार्यों का अध्ययन करने के लिए डीसी की एक उचित संख्या के अलगाव के लिए एक कठिनाई बन गया है। इस समस्या को दूर करने के लिए, एककेंद्रकश्वेतकोशिका भेदभाव डीसी वृक्ष के समान सेल समारोह के अध्ययन के लिए इन विट्रो मॉडल के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं। इन विट्रो में डीसी इन विवो डीसी की तुलना में समान रिसेप्टर्स और कार्य किया है। इन विवो डीसी की और इन विट्रो उत्पन्न एककेंद्रकश्वेतकोशिका निकाली गई DCS (moDCs) में विस्तृत तुलना अन्य प्रयोगशालाओं 13, 14, 15 से जांच कर रहे हैं। यह भी बताया जाता है कि moDCs और सीडी-1 सी + डीसी प्रतिजन और टी सेल समारोह 15 उत्प्रेरण पर बराबर थे।

इस पत्र में, हम परिधीय रक्त monocytes से अपरिपक्व moDCs पैदा करने और फिर उन्हें immunogenic और tolerogenic डीसी में फर्क करने की एक विधि का वर्णन है। ये monocyte व्युत्पन्न वृक्ष के समान कोशिकाओं (moDCs) उनकी सतह मार्कर, साइटोकाइन प्रोफाइल, immunoregulatory कार्यों और चयापचय राज्यों की विशेषता है। Immunogenic और tolerogenic वृक्ष के समान कोशिकाओं अलग साइटोकिन्स जो या तो allogenic टी कोशिकाओं या नियामक टी कोशिकाओं के विस्तार में परिणाम का उत्पादन। इस पत्र में, साइटोकाइन प्रोफाइलिंग मल्टीप्लेक्स प्रौद्योगिकी का उपयोग कर सिस्टम के साथ किया जाता है। कोशिकाओं के विकास को मध्यम एंटीबॉडी स्थिर रंग कोडित मोतियों के साथ incubated और एक कॉम्पैक्ट विश्लेषक में पढ़ रहे हैं। डीसी के चयापचय राज्यों बाह्य प्रवाह एनालाइजर कि मापने ऑक्सीजन की खपत दर, सेलुलर श्वसन का सूचक है, और बाह्य अम्लीकरण दर जो glycolytic दर्शाता का उपयोग कर विश्लेषण कर रहे हैंवृक्ष के समान कोशिकाओं में प्रवाह। इन बायोइनरजेटिक्स दरों का मापन सेलुलर चयापचय में परिवर्तन जो वृक्ष के समान सेल के विकास और समारोह में महत्वपूर्ण हैं ट्रैक करने के लिए एक साधन प्रदान करता है।

Protocol

इस शोध संस्थागत समीक्षा बोर्ड (एनयूएस-आईआरबी 10-250) द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear के अलगाव (PBMCs)

  1. अभिकर्मक की तैयारी
    1. तैयार पीबीएस / EDTA: फॉस्फेट बफर नमकीन घोल (पीबीएस) और 2 मिमी ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) के साथ पूरक। 0.2 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से निस्पंदन द्वारा इस समाधान जीवाणुरहित। 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस / EDTA स्टोर करने के लिए ध्यान दें और उपयोग करने से पहले कमरे के तापमान को गर्म है।
    2. फॉस्फेट बफर नमकीन घोल (पीबीएस) 2% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ पूरक, 10 मिमी 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic एसिड (HEPES) और 2 मिमी ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA): बफर धुंधला तैयार करें। 0.2 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से निस्पंदन द्वारा इस समाधान जीवाणुरहित।
  2. रक्त कोन से रक्त एकत्र
    नोट: रक्त शंकु सफेद रक्त कोशिका घटकों प्लेट के बाद एकत्र होते हैंअस्पताल से letpheresis। रक्त हेपरिन या EDTA ट्यूबों में एकत्र किया जाता है, तो 1 में पीबीएस के साथ खून पतला: 1 के अनुपात में और कदम करने के लिए 1.3 आगे बढ़ना; यदि बफी कोट प्राप्त होता है, 1 में पीबीएस के साथ बफी कोट पतला: 2 अनुपात और कदम करने के लिए 1.3 आगे बढ़ें।
    1. शंकु के दोनों सिरों में कटौती एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में बाहर प्रवाह के लिए रक्त की अनुमति है। ध्यान दें कि कोन आमतौर पर रक्त के 10 मिलीलीटर होता है।
    2. पीबीएस / EDTA के 30 मिलीग्राम से युक्त कोन धोने और एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में इकट्ठा करने के लिए एक कुंद अंत सिरिंज का प्रयोग करें।
    3. 80 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा करने के लिए पीबीएस / EDTA के साथ आगे खून पतला।
  3. घनत्व centrifugation 16 से PBMCs का अलगाव
    1. अशेष 15 मिलीलीटर 4 ताजा 50 मिलीलीटर ट्यूबों के लिए प्रत्येक Ficoll।
    2. Ficoll परत पर पतला रक्त के 20 मिलीलीटर जोड़ने के लिए एक 25 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक pipet का प्रयोग करें। एक 45 कोण पर 50 मिलीलीटर ट्यूब पकड़ और देखभाल अंतरावस्था को परेशान नहीं करने के लिए ध्यान रखना।
    3. 30 मिनट, 20 डिग्री सेल्सियस के लिए ब्रेक के बिना 805 XG पर ट्यूबों अपकेंद्रित्र।
    4. हटाएप्लाज्मा परत और सिर्फ एक पाश्चर pipet के साथ प्लाज्मा परत के नीचे झूठ बोल रही है PBMCs की अंगूठी इकट्ठा। दो 50 मिलीलीटर ट्यूब में PBMCs के चार ट्यूबों का मिश्रण। नोट PBMCs नीचे पारदर्शी परत संग्रह से बचने के लिए।
    5. 10 मिनट, 20 डिग्री सेल्सियस के लिए ब्रेक के साथ 548 XG पर PBMCs की ट्यूब और सेंट्रीफ्यूज प्रति 50 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा को पीबीएस / EDTA जोड़ें।
    6. महाप्राण सतह पर तैरनेवाला और धुंधला बफर के 25 मिलीग्राम और साथ प्रत्येक ट्यूब में resuspend गोली से एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में गठबंधन।
    7. 5 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस के लिए ब्रेक के साथ 367 XG पर अपकेंद्रित्र।
    8. महाप्राण सतह पर तैरनेवाला और धुंधला बफर के 10 मिलीलीटर के साथ resuspend गोली।

2. Monocyte संवर्धन चुंबकीय जुदाई 17 से

  1. निर्धारित बनाने के लिए सेल नंबर
    1. PBMC सेल निलंबन के 20 μl ले लो और trypan नीले रंग के 20 μl के साथ मिश्रण कोशिकामापी का उपयोग कर जीवित कोशिकाओं की संख्या की गिनती करने के लिए।
    2. ब्रेक के साथ 367 XG पर अपकेंद्रित्र सेल निलंबन10 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस के लिए।
    3. धुंधला बफर के 80 μl प्रति 10 7 कोशिकाओं की एकाग्रता के लिए महाप्राण पूरी तरह से सतह पर तैरनेवाला और resuspend सेल गोली।
  2. चुंबकीय लेबलिंग
    1. 10 7 कोशिकाओं प्रति CD14 microbeads के 20 μl जोड़ें, मिश्रण अच्छी तरह से और 2 पर 15 मिनट के लिए सेते हैं - 8 डिग्री सेल्सियस।
    2. 10 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस के लिए ब्रेक के साथ 367 XG पर 10 7 कोशिकाओं प्रति धुंधला बफर और सेंट्रीफ्यूज के 1 मिलीलीटर जोड़कर कोशिकाओं को धो लें।
    3. धुंधला बफर के 50 μl प्रति 10 7 कोशिकाओं के एक एकाग्रता में महाप्राण पूरी तरह से सतह पर तैरनेवाला और resuspend सेल गोली।
  3. चुंबकीय जुदाई
    1. 2 एक्स 10 8 कुल कोशिकाओं की एक अधिकतम के लिए मध्यम आकार के स्तंभ का प्रयोग करें।
      नोट: कुल कोशिकाओं की संख्या और डेटा पत्रक में सिफारिश की CD14 + कोशिकाओं की संख्या के अनुसार एक उपयुक्त स्तंभ और विभाजक चुनें।
    2. चुंबकीय क्षेत्र ओ में कॉलम की जगहएफए उपयुक्त विभाजक और धुंधला बफर के 500 μl के साथ rinsing द्वारा स्तंभ तैयार करते हैं।
    3. स्तंभ पर पिपेट सेल निलंबन और लेबल हटाया गया कोशिकाओं है कि एक 15 मिलीलीटर ट्यूब के साथ स्तंभ के माध्यम से पारित इकट्ठा।
    4. स्तंभ के तहत एक नया 15 मिलीलीटर ट्यूब की जगह और धुंधला बफर के 500 μl के साथ स्तंभ 3 बार धोएं। यकीन स्तंभ जलाशय washes के बीच नई धुंधला बफर जोड़ने से पहले खाली है।
    5. विभाजक से स्तंभ निकालें और एक ताजा 15 मिलीलीटर ट्यूब पर जगह है।
    6. पिपेट स्तंभ पर धुंधला बफर के 1 मिलीलीटर। इसके तत्काल बाद मजबूती से कॉलम में (किट में प्रदान की) सवार धक्का द्वारा चुंबकीय लेबल कोशिकाओं को बाहर निकलवाने।
    7. दोहराएँ एक नया स्तंभ पर eluted अंश का उपयोग कर CD14 + कोशिकाओं की शुद्धता बढ़ाने के लिए 2.3.6 के लिए 2.3.2 कदम। ध्यान दें कि मोती 3.2 कदम दौरान संस्कृति में स्वचालित रूप से कोशिकाओं से जारी किया जाएगा।

विभिन्न एक्टिवेशन एस के वृक्ष के समान कोशिकाओं 3. भेदभावTATES

  1. अभिकर्मक की तैयारी (endotoxin लेवल सभी अभिकर्मकों में कम से कम 0.1 यूरोपीय संघ / मिलीलीटर हो गया है)
    1. सेल संस्कृति के माध्यम से तैयार: RPMI 1640 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 1% गैर आवश्यक अमीनो एसिड (NEAA) और 0.05 मिमी 2-मर्केप्टोइथेनाल (2me) के साथ पूरक। 0.2 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से निस्पंदन द्वारा इस समाधान जीवाणुरहित।
    2. साइटोकिन्स तैयार: 0.25 मिलीग्राम की एक एकाग्रता के लिए आईएल 4 और सेल संस्कृति ग्रेड पानी में जीएम-सीएसएफ पुनर्गठित / मिलीलीटर क्रमश मम्मियाँ शर्तों के अधीन। 200 μl microcentrifuge ट्यूबों में अशेष साइटोकिन्स और दुकान -80 डिग्री सेल्सियस पर।
    3. विटामिन डी 3 शेयर तैयार: सड़न रोकनेवाला की शर्तों के तहत 100 मिमी की एकाग्रता के लिए सेल संस्कृति ग्रेड पानी में विटामिन डी 3 पुनर्गठित। 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों में अशेष विटामिन डी 3 और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
    4. dexamethasone शेयर तैयार: सड़न रोकनेवाला की शर्तों के तहत 10 मिमी की एकाग्रता के लिए सेल संस्कृति ग्रेड पानी में dexamethasone पुनर्गठित। अशेष dexamet1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में hasone और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
    5. एलपीएस तैयार: सड़न रोकनेवाला की शर्तों के तहत 1 मिलीग्राम / एमएल की एकाग्रता के लिए सेल संस्कृति ग्रेड पानी में Lipopolysaccharides (LPS) पुनर्गठित। 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों में अशेष LPS और दुकान -20 डिग्री सेल्सियस पर।
  2. विभिन्न moDCs सृजन
    1. बीज 0.3 की एकाग्रता में CD14 + monocytes के 4 सेट - 0.5 x 10 6 / सेल संस्कृति के माध्यम से जीएम-सीएसएफ के 200 एनजी / एमएल और 6 अच्छी तरह प्लेटें में आईएल -4 के 200 एनजी / एमएल के साथ पूरक की मिलीलीटर। ध्यान दें कि यह दिवस 0 और प्रत्येक 6 कुएं में मध्यम की मात्रा है 2 मिलीलीटर है।
    2. 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को सेते हैं।
    3. मध्यम के 850 μl 5 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस के लिए 300 XG पर 4 दिन और सेंट्रीफ्यूज पर संस्कृति से निकालें। महाप्राण सतह पर तैरनेवाला और (जीएम-सीएसएफ के 200 एनजी / एमएल और आईएल -4 के 200 एनजी / एमएल) की 2x युक्त सेल संस्कृति के माध्यम से 1 मिलीलीटर में resuspend गोली। इस सेल मिश्रण वापस जोड़ेंसंस्कृति के लिए। कि 2x एकाग्रता जीएम- CSF और आईएल -4 के लिए जोड़ा गया 1x हो जाएगा जब माध्यम के 1 मिलीलीटर संस्कृति में वापस जोड़ा जाता है।
    4. tolerogenic moDCs उत्पन्न करने के लिए 5 दिन पर सेट में से दो को विटामिन डी 3 शेयर और माध्यम के प्रति मिलीलीटर dexamethasone शेयर की 1μl की 1 μl जोड़ें। ध्यान दें कि विटामिन डी 3 के अंतिम एकाग्रता 100 एनएम है और dexamethasone 10 एनएम है; जीएम- CSF और आईएल -4 के अलावा दिन 5 पर आवश्यकता नहीं है।
    5. दिन 6 पर सभी सेट करने के लिए जीएम-सीएसएफ के 200 एनजी / एमएल और आईएल -4 के 200 एनजी / एमएल जोड़ें।
    6. सेट 6 दिन में केवल जीएम- CSF और आईएल -4 के साथ इलाज किया परिपक्व moDCs उत्पन्न करने से एक के लिए LPS के 1 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर जोड़ें।
    7. दिन 6 पर tolerogenic moDCs का एक सेट करने के लिए LPS के 1 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर जोड़ें LPS-tolerogenic moDCs उत्पन्न करते हैं।
    8. से फ्लो या अन्य अध्ययनों के लिए पीबीएस, EDTA के साथ संस्कृति डिश निस्तब्धता से 7 दिवस पर moDCs के विभिन्न प्रकार हार्वेस्ट। ध्यान दें कि केवल गैर पक्षपाती कोशिकाओं काटा जाता है। ध्यान रखना है CD14 + monoc से कि प्रतिशत उपजअपरिपक्व moDCs, परिपक्व moDCs, tolerogenic moDCs और LPS-tolerogenic DCS के लिए ytes के बारे में 90%, 50%, 60% और 60% क्रमशः रहे हैं और रक्त दाताओं और FBS बहुत कुछ के बीच होती है।

4. से फ्लो

  1. MoDCs पर कोशिका की सतह मार्कर विशेषता
    1. pipetting द्वारा संस्कृति पकवान से कोशिकाओं को अलग करें। 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में धुंधला बफर के 50 μl प्रति 5 एक्स 5 10 कोशिकाओं के एक एकाग्रता में पीबीएस / EDTA और resuspend कोशिकाओं के साथ एक बार कोशिकाओं को धो लें।
    2. PerCP संयुग्मित HLADR (1: 100) के साथ 0.5 x 10 6 सेल aliquots सेते हैं, पीई संयुग्मित CD80 (1:50), पीई संयुग्मित CD83 (1:25), पीई संयुग्मित CD86 (1:50), APC- संयुग्मित CD11c (1:50), पीई संयुग्मित CD14 (1:50) और पीई संयुग्मित BDCA3 (1:50) और 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए एपीसी संयुग्मित ILT3 (1:25) अंधेरे में। Isotype मिलान PerCP संयुग्मित MAb (1:20), पीई संयुग्मित MAb (1:11), एपीसी संयुग्मित MAb (1:11) के रूप में नकारात्मक नियंत्रण में काम करेंगे।
    3. 18 कोशिकामापी एक प्रवाह का उपयोग कर सतह मार्कर की अभिव्यक्ति के स्तर का पता लगाने।
  2. MoDCs के माइटोकॉन्ड्रिया झिल्ली क्षमता का विश्लेषण
    1. प्रति lyophilized लाल CMXRos की 50 ग्राम डाइमिथाइल sulfoxide (DMSO) की 94.1 μl जोड़कर 1 मिमी लाल Chloromethyl-X-rosamine (CMXRos) के शेयर समाधान तैयार है।
    2. 15 मिलीलीटर ट्यूब में 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए हांक बैलेंस्ड नमक समाधान (HbSS) के 1 मिलीलीटर में 100 एनएम लाल CMXRos के साथ 2 x 10 5 moDCs सेते हैं।
    3. 5 मिनट, कमरे के तापमान के लिए 300 XG पर कोशिकाओं और सेंट्रीफ्यूज के लिए पीबीएस / EDTA के 2 मिलीलीटर जोड़ें। 2 बार दोहराएँ। महाप्राण सतह पर तैरनेवाला और प्रवाह cytometry विश्लेषण के लिए पीबीएस, EDTA, 2% एफसीएस के 300 μl में resuspend सेल गोली। पीई चैनल का उपयोग करने के लिए लाल CMXRos संकेत विश्लेषण करने के लिए ध्यान रखना।
  3. मार्कर विशेषता टी कोशिकाओं की
    1. 1.2 के 50 μl सेते x 10 सीडी 4+ टी कोशिकाओं Allo 6 CFSE लेबल (से उत्पन्नकदम 5.6) PerCP संयुग्मित CD3 (1: 200), पीई / Cy7 संयुग्मित सीडी 4 (1: 400) और एपीसी / Cy7 संयुग्मित CD25 (1: 100) 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए अंधेरे में। दाग टी-कोशिकाओं को कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए एक वाणिज्यिक अंधेरे में Foxp3-एलेक्सा स्त्राव 647 (1:50) के साथ किट का उपयोग।

5. Alloreaction अध्ययन

  1. निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार, CFSE lyophilized को DMSO के 18 μl जोड़कर Carboxyfluorescein succinimidyl एस्टर (CFSE) 5 मिमी शेयर समाधान तैयार है।
  2. शुद्ध PBMCs से सीडी 4+ टी कोशिकाओं
    1. PBMC सेल निलंबन के 20 μl लेने के द्वारा सेल नंबर का निर्धारण और trypan नीले रंग के 20 μl के साथ मिश्रण एक कोशिकामापी का उपयोग कर जीवित कोशिकाओं की संख्या की गिनती करने के लिए।
    2. 10 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस के लिए ब्रेक के साथ 367 XG पर अपकेंद्रित्र सेल निलंबन।
    3. एक 5 मिलीलीटर polysty में धुंधला बफर के 1 मिलीलीटर प्रति 5 10 x 7 कोशिकाओं के एक एकाग्रता में महाप्राण पूरी तरह से सतह पर तैरनेवाला और resuspend सेल गोलीरेने ट्यूब।
    4. 50 μl / एमएल कोशिकाओं को मानव सीडी 4 + टी सेल संवर्धन कॉकटेल जोड़ें। अच्छी तरह मिक्स और कमरे के तापमान पर सेते - 10 मिनट के लिए (15 से 25 डिग्री सेल्सियस)।
    5. 30 सेकंड के लिए और 100 μl / एमएल कोशिकाओं में चुंबकीय कणों को जोड़ने के भंवर चुंबकीय कणों। अच्छी तरह मिक्स और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं।
    6. 2.5 मिलीलीटर की कुल मात्रा के लिए सेल निलंबन को धुंधला बफर जोड़ें। 3 बार - धीरे नीचे 2 ऊपर pipetting और ट्यूब में कोशिकाओं मिक्स। ट्यूब चुंबक में रखें और 5 मिनट के लिए सेते हैं।
    7. ट्यूब के साथ चुंबक पलटना और एक नया 5 मिलीलीटर polystyrene ट्यूब में निलंबन (टी कोशिकाओं में शामिल है) छानना।
  3. सेल नंबर का निर्धारण और 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए पीबीएस के 1 मिलीलीटर में 5 माइक्रोन के CFSE के साथ 1.2 x 10 6 सीडी 4+ टी कोशिकाओं सेते हैं, प्रकाश से रक्षा की।
  4. सेल संस्कृति के माध्यम से (कदम 3.1.1 के अनुसार तैयार) कोशिकाओं के पांच बार मूल धुंधला मात्रा में जोड़ें और 5 मिनट के लिए सेते हैं।
  5. Centrif75 μl प्रति 2 एक्स 10 5 की एकाग्रता में 5 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस और सेल संस्कृति माध्यम में resuspend गोली के लिए 300 XG पर uge।
  6. 0 के साथ सेल संस्कृति के माध्यम से 75 μl युक्त प्रत्येक moDC संस्कृति के लिए 2 एक्स 10 5 CFSE लेबल सीडी 4+ टी कोशिकाओं के 75 μl जोड़ें, 2.5 x 10 3, 5 एक्स 10 3, 10 x 10 3, 20 x 10 3 और 96 अच्छी तरह से यू-नीचे प्लेटों में 40 x 10 3 moDCs। 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में 6 दिनों के लिए संस्कृति।
  7. 5 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस के लिए 300 XG पर 15 मिलीलीटर ट्यूब और अपकेंद्रित्र में सीडी 4+ टी कोशिकाओं pipetting द्वारा हार्वेस्ट। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 XG पर पीबीएस / EDTA के 2 मिलीलीटर और सेंट्रीफ्यूज में साइटोकाइन विश्लेषण और resuspend सेल गोली के लिए सतह पर तैरनेवाला लीजिए।

6. साइटोकाइन विश्लेषण 19

  1. 5.5 कदम के रूप में वर्णित alloreaction अध्ययनों से supernatants लीजिए।
  2. मानव साइटोकाइन / Chemokin के लिए अभिकर्मक की तैयारीई चुंबकीय पैनल विश्लेषण
    1. मोतियों की अलग-अलग शीशियों के लिए एंटीबॉडी स्थिर मोतियों की बोतल मिश्रण की तैयारी के लिए (किट में शामिल है), 1 मिनट के लिए भंवर। मिश्रण बोतल (किट में शामिल है) के लिए प्रत्येक एंटीबॉडी मनका शीशी से 60 μl जोड़ें और मनका मंदक के साथ 3 मिलीलीटर के अंतिम मात्रा को लाने (प्रदान)।
    2. गुणवत्ता नियंत्रण की तैयारी के लिए, पुनर्गठित गुणवत्ता नियंत्रण 1 और गुणवत्ता नियंत्रण 2 250 μl विआयनीकृत पानी के साथ (किट में शामिल है)।
    3. धो बफर की तैयारी के लिए, 10x धो बफर (किट में शामिल है) विआयनीकृत पानी की 270 मिलीलीटर के साथ की 30 मिलीलीटर पतला।
    4. मानव साइटोकाइन स्टैंडर्ड की तैयारी के लिए, मानव साइटोकाइन मानक (किट में शामिल है) 250 μl विआयनीकृत पानी एक 10,000 स्नातकोत्तर / एमएल एकाग्रता देने के साथ पुनर्गठित।
      1. 2,000 स्नातकोत्तर / एमएल काम कर मानक बनाने के लिए एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में परख बफर (किट में प्रदान की) के 200 μl के लिए 10,000 स्नातकोत्तर / एमएल मानव साइटोकाइन मानक के 50 μl जोड़े। स्थानांतरण 2,000 स्नातकोत्तर / एमएल मानव साइटोकाइन एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में परख बफर (किट में प्रदान की) के 200 μl करने के लिए मानक के 50 μl 400 स्नातकोत्तर / एमएल काम कर मानक बनाने के लिए।
      2. स्थानांतरण एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में 400 स्नातकोत्तर / एमएल मानव साइटोकाइन परख बफर (किट में प्रदान की) के 200 μl करने के लिए मानक के 50 μl 80 स्नातकोत्तर / एमएल काम कर मानक बनाने के लिए। स्थानांतरण एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में 80 स्नातकोत्तर / एमएल मानव साइटोकाइन परख बफर (किट में प्रदान की) के 200 μl करने के लिए मानक के 50 μl 16 स्नातकोत्तर / एमएल काम कर मानक बनाने के लिए।
      3. स्थानांतरण 3.2 स्नातकोत्तर / एमएल काम कर मानक बनाने के लिए एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में परख बफर (किट में प्रदान की) के 200 μl के लिए 16 स्नातकोत्तर / एमएल मानव साइटोकाइन मानक के 50 μl। 0 स्नातकोत्तर / एमएल काम कर मानक एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में परख बफर के केवल 200 μl है।
  3. पूर्व गीला फिल्टर प्लेट (किट में शामिल) फिल्टर के प्रत्येक कुएं में परख बफर (प्रदान) के 200 μl pipetting द्वाराथाली। सील और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए एक थाली प्रकार के बरतन पर फिल्टर प्लेट जगह है।
  4. महाप्राण परख बफर और उचित कुओं में प्रत्येक मानक या गुणवत्ता नियंत्रण के 25 μl जोड़ें।
  5. सेल संस्कृति के माध्यम से 25 μl जोड़े पृष्ठभूमि, मानकों और नियंत्रण कुओं के लिए (कदम 3.1.1 के अनुसार तैयार)।
  6. नमूना कुओं को परख बफर के 25 μl जोड़ें और उचित नमूना कुओं में नमूने के 25 μl जोड़ें।
  7. भंवर मिश्रण बोतल एंटीबॉडी स्थिर मोती युक्त और अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए मिश्रित मोतियों की 25 μl जोड़ें। प्लेट को सील करने और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर एक थाली प्रकार के बरतन पर आंदोलन के साथ सेते हैं।
  8. महाप्राण तरल पदार्थ और धोने प्लेट 2 बार बफर 200 μl / धो की अच्छी तरह से जोड़ने और तरल पदार्थ aspirating द्वारा।
  9. प्रत्येक कुएं में पता लगाने के एंटीबॉडी (प्रदान) का 25 μl जोड़ें। सील और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए एक थाली प्रकार के बरतन पर आंदोलन के साथ सेते हैं।
  10. (नीति Streptavidin- phycoerythrin का 25 μl जोड़ेided) अच्छी तरह से पता लगाने के एंटीबॉडी के 25 μl युक्त प्रत्येक के लिए। सील और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए एक थाली प्रकार के बरतन पर आंदोलन के साथ सेते हैं।
  11. महाप्राण तरल पदार्थ और धोने प्लेट कदम 6.8 में वर्णित है।
  12. 5 मिनट के लिए एक थाली प्रकार के बरतन पर 150 म्यान के सभी कुओं और resuspend मोती μl / द्रव जोड़ें।
  13. एक 3 डी प्रणाली का उपयोग करते हुए 20 मोतियों की प्रतिदीप्ति तीव्रता का पता लगाने। नमूने 21 में गणना के साइटोकाइन / chemokines सांद्रता के लिए एक पांच पैरामीटर लॉग-रसद वक्र ढाले विधि का उपयोग मंझला फ्लोरोसेंट तीव्रता डेटा का विश्लेषण।

7. वास्तविक समय ऑक्सीजन की खपत दर (ओसीआर) और बाह्य अम्लीकरण दर (ECAR) माप

  1. अभिकर्मक की तैयारी / सामग्री
    1. ओसीआर मध्यम तैयार: परख माध्यम से 25 मिमी ग्लूकोज और 1 मिमी सोडियम पाइरूवेट (पीएच 7.35) के साथ पूरक। 0.2 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से निस्पंदन द्वारा इस समाधान जीवाणुरहित। नोट लेने के लिए इस माध्यम है कि पीआरFBS बिना epared क्योंकि FBS में घटकों जटिल हैं और परागकोश बहुत कुछ करने के लिए एक बहुत से बदलती हैं।
    2. ECAR मध्यम तैयार: आधार माध्यम 2 मिमी एल glutamine (पीएच 7.35) के साथ पूरक। 0.2 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से निस्पंदन द्वारा इस समाधान जीवाणुरहित। ध्यान रखना है कि इस माध्यम बाइकार्बोनेट, ग्लूकोज, पाइरूवेट और FBS के बिना तैयार किया जाता है। नोट FBS बफरिंग क्षमता है और ECAR पढ़ने के साथ हस्तक्षेप करेगा कि।
    3. ओसीआर मापन के लिए यौगिकों तैयार: ओसीआर माध्यम के 630 μl के साथ oligomycin Resuspend 100 माइक्रोन के शेयर समाधान बनाने के लिए और 16 कार्य एकाग्रता सुक्ष्ममापी ओसीआर माध्यम के साथ कमजोर करने के लिए। Resuspend कार्बोनिल साइनाइड 4- (trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) ओसीआर माध्यम के 720 μl के साथ 100 माइक्रोन के शेयर समाधान बनाने के लिए और 4.5 से काम कर रहा एकाग्रता सुक्ष्ममापी ओसीआर माध्यम के साथ कमजोर करने के लिए। Resuspend rotenone / ओसीआर माध्यम के 540 μl के साथ antimycin एक 50 माइक्रोन के शेयर समाधान बनाने के लिए और 10 कार्य एकाग्रता सुक्ष्ममापी ओसीआर माध्यम के साथ कमजोर करने के लिए।
    4. तैयार करनाECAR मापन के लिए यौगिकों: ECAR माध्यम के 3 मिलीलीटर के साथ Resuspend ग्लूकोज 100 मिमी शेयर समाधान बनाने के लिए और काम कर रहा एकाग्रता 80 मिमी को कमजोर करने के लिए। ECAR माध्यम के 720 μl के साथ oligomycin Resuspend 100 माइक्रोन के शेयर समाधान बनाने के लिए और काम कर रहा एकाग्रता 18 मिमी को कमजोर करने के लिए। ECAR माध्यम की 1.5 मिलीलीटर के साथ Resuspend 2-Deoxy-डी ग्लूकोज 1000 मिमी शेयर समाधान बनाने के लिए।
    5. Pipet माप से पहले कोई सीओ 2 एक दिन के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर कारतूस और दुकान के प्रत्येक कुएं में calibrant के 200 μl।
  2. वास्तविक समय माप ओसीआर
    1. हार्वेस्ट moDCs और 60 x 10 3 ओसीआर माध्यम के 150 μl प्रति की एकाग्रता में ओसीआर माध्यम में moDCs के प्रत्येक प्रकार के resuspend।
    2. बीज 60 x 10 3 कोशिकाओं / अच्छी तरह से एक पाली डी lysine लेपित 96 अच्छी तरह से फ्लैट नीचे की थाली में और 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए एक गैर-सीओ 2 इनक्यूबेटर में सेते हैं। 1 घंटे के लिए कोट करने के लिए पाली डी lysine के 50 एनजी / एमएल प्लेट के 50 μl का उपयोग करें और साथ धोने के लिए ध्यान रखना हैजीवाणुरहित जल। उपयोग करने से पहले कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए प्लेट सूखा रखें।
    3. सभी कुओं के लिए इंजेक्शन बंदरगाह में पिपेट 25 μl ओसीआर मध्यम; 25 μl ओसीआर सभी कुओं के लिए इंजेक्शन बंदरगाह बी में oligomycin के 16 माइक्रोन से युक्त मध्यम; 25 μl ओसीआर सभी कुओं के लिए इंजेक्शन बंदरगाह सी में (FCCP) के 4.5 माइक्रोन के और 25 μl ओसीआर 10 मिमी rotenone / सभी कुओं के लिए इंजेक्शन बंदरगाह विकास में antimycin ए युक्त मध्यम युक्त मध्यम। ध्यान दें कि oligomycin के लिए अंतिम अच्छी तरह से एकाग्रता 2 माइक्रोन है, FCCP 0.5 सुक्ष्ममापी और rotenone है / antimycin एक 1 माइक्रोन है।
    4. प्लेट बाह्य प्रवाह विश्लेषक में रखें और लगातार चार चरणों में एक साथ सभी moDCs के साथ एक पूर्ण ओसीआर अध्ययन चलाने: बेसल श्वसन mitochondrial परिसर वी निषेध (बंदरगाह बी से दवा इंजेक्शन के बाद), अधिक से अधिक श्वसन प्रेरण (बंदरगाह से मध्यम इंजेक्शन के बाद) (के बाद पोर्ट सी से दवा इंजेक्शन) और इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला निषेध (पोर्ट डी से दवा), 22 के बाद। ध्यान दें देखते हैं कि 3 सी लोइंजेक्शन और माप के बीच 6 मिनट के अंतराल के बीच में ycles।
  3. वास्तविक समय माप ECAR
    1. हार्वेस्ट moDCs और 60 x 10 3 150 प्रति ECAR माध्यम की μl की एकाग्रता में ECAR माध्यम में moDCs के प्रत्येक प्रकार के resuspend।
    2. बीज 6 एक्स 10 4 कोशिकाओं / अच्छी तरह से एक पाली डी lysine लेपित 96 अच्छी तरह से फ्लैट नीचे की थाली में और 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए एक गैर-सीओ 2 इनक्यूबेटर में सेते हैं।
    3. सभी कुओं के लिए इंजेक्शन बंदरगाह में पिपेट 25 μl ECAR मध्यम; 25 μl ECAR सभी कुओं के लिए इंजेक्शन बंदरगाह बी में ग्लूकोज की 10 मिमी युक्त मध्यम; 25 μl ECAR मध्यम सभी कुओं के लिए इंजेक्शन बंदरगाह सी में oligomycin के 18 माइक्रोन के और 25 μL ओसीआर युक्त 1000 मिमी इंजेक्शन बंदरगाह विकास में सभी कुओं के लिए 2-Deoxy-डी ग्लूकोज युक्त मध्यम। ध्यान दें कि ग्लूकोज के लिए अंतिम अच्छी तरह से एकाग्रता 10 माइक्रोन है, oligomycin 2 माइक्रोन और 2-Deoxy-डी ग्लूकोज 100 मिमी है।
    4. प्लेट बाह्य प्रवाह विश्लेषक में रखें और एक रनएक साथ लगातार चार चरणों में सभी moDCs के साथ पूरा ECAR अध्ययन: बेसल श्वसन (पोर्ट एक से मध्यम इंजेक्शन के बाद), ग्लाइकोलाइसिस प्रेरण (बंदरगाह बी से दवा इंजेक्शन के बाद), अधिक से अधिक ग्लाइकोलाइसिस प्रेरण और ग्लाइकोलाइसिस निषेध (पोर्ट सी से दवा इंजेक्शन के बाद) (के बाद पोर्ट डी), 22 से दवा।
    5. एक Tukey कई तुलना के बाद परीक्षण के साथ एक तरह से एनोवा का उपयोग कर सांख्यिकीय अंतर का विश्लेषण।

Representative Results

Monocyte शोधन और वृक्ष के समान सेल भेदभाव

Monocytes, परिधीय रक्त (चित्रा 1 ए) के घनत्व centrifugation द्वारा PBMCs से शुद्ध कर रहे थे CD14 + जीएम- CSF और आईएल -4 की उपस्थिति अपरिपक्व वृक्ष के समान कोशिकाओं को प्राप्त करने में सकारात्मक चयन चुंबकीय जुदाई (चित्रा 1 बी) और पूरा मध्यम में संवर्धित (द्वारा पीछा किया 2A चित्रा)। विटामिन डी 3 और dexamethasone पद जीएम- CSF और आईएल -4 के अलावा tolerogenic moDCs (चित्रा 2 बी) में अपरिपक्व moDCs के भेदभाव में हुई। एलपीएस अपरिपक्व moDCs की परिपक्वता के लिए प्रेरित करने moDCs (चित्रा -2) और tolerogenic moDCs परिपक्व करने के लिए परिपक्वता (चित्रा 2 डी) के लिए प्रतिरोध सत्यापित करने के लिए LPS साथ प्रेरित किया गया जोड़ा गया है। रक्त इस काम में इस्तेमाल नमूने सूचित पिछले के साथ स्वस्थ दानदाताओं से प्राप्त किया गयासहमति।

moDC विशेषता

भूतल से फ्लो द्वारा मार्कर विशेषता

डीसी सतह मार्कर के विश्लेषण से पता चला है कि परिपक्व moDCs परिपक्वता मार्करों एचएलए डॉ, CD83 और CD86 LPS इलाज tolerogenic moDCs, tolerogenic moDCs और अपरिपक्व moDCs (चित्रा 3) की तुलना के उच्चतम स्तर को व्यक्त किया। ये परिणाम दिखा दिया है कि tolerogenic moDCs LPS उत्तेजना के बाद अपरिपक्व moDCs की तुलना में परिपक्वता के लिए प्रतिरोधी थे। इसके अलावा, tolerogenic moDCs LPS का इलाज और tolerogenic moDCs CD14, BDCA3 (CD141) और इम्यूनोग्लोबिन-तरह प्रतिलेख (ILT) 3 की अभिव्यक्ति वृद्धि हुई अपरिपक्व और परिपक्व moDCs की तुलना में दिखाया गया है। Tolerogenic moDCs है कि हम यहाँ उत्पन्न पिछली रिपोर्टों 23 के अनुरूप है।

moDCs के कार्यात्मक विशेषताओं

परिपक्वता के लिए प्रेरित moDCs immunogenic बनने और रिलीज साइटोकिन्स कि सीडी 4+ टी कोशिकाओं के प्रसार को बढ़ावा देने के। हम सह सुसंस्कृत टी कोशिकाओं के प्रसार को मापने के द्वारा विभिन्न moDC उपप्रकार के प्रतिरक्षाजनकता का आकलन किया। Tolerogenic moDCs के रूप में सीडी 4+ टी कोशिकाओं की कम alloproliferation (चित्रा 4 ए) द्वारा दिखाए गए, परिपक्व moDCs के साथ तुलना में खराब immunogenic थे। Tolerogenic moDCs उनके कम IFN-Γ, कम आईएल 12p40, और सीडी 4+ टी कोशिकाओं (चित्रा 4 बी) के साथ alloreaction सह संस्कृतियों में उच्च आईएल -10 साइटोकाइन उत्पादन की विशेषता है। इसके अलावा, परिपक्व moDCs में tolerogenic moDCs की संख्या बढ़ रही सह संस्कृतियों प्रेरित allospecific सीडी 4+ टी कोशिकाओं CD25 उच्च Foxp3 + विनियामक टी-कोशिकाओं (चित्रा 4C) की आवृत्ति में वृद्धि हुई।

Mitochondrial गतिविधि का विश्लेषण

लाल CMXRos moDCs में mitochondrial झिल्ली क्षमता स्तर का विश्लेषण करने के लिए mitochondrial गतिविधि प्रतिबिंबित करने के लिए प्रयोग किया जाता है। Tolerogenic moDCs अन्य moDC भेदभाव उपप्रकार (चित्रा 5 ए) के साथ तुलना में उच्च mitochondrial गतिविधि है मनाया गया। अगले, mitochondrial ऑक्सीजन की खपत की दर (ओसीआर) एक bioanalyzer का उपयोग कर विभिन्न moDC उपप्रकार के लिए मूल्यांकन किया है। ओसीआर माप सहित, लेकिन बेसल श्वसन, स्पेयर श्वसन क्षमता, प्रोटॉन रिसाव और गैर-mitochondrial श्वसन तक ही सीमित नहीं जानकारी प्रदान करने, चयापचय प्रोफ़ाइल के लिए उच्च संकल्प अंतर्दृष्टि अनुमति देते हैं। ओसीआर की माप तनाव के लिए प्रतिक्रिया करने के लिए कोशिकाओं की क्षमता का आकलन करने के लिए एक साधन प्रदान करता है। कोशिकाओं पाचन उत्तराधिकार में तीन अलग-अलग यौगिकों के अलावा द्वारा आनाकानी कर रहे हैं। पहले इंजेक्शन राजभाषा हैigomycin (एटीपी युग्मक) जो इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला (ईटीसी) के परिसर वी रोकता है, एटीपी संश्लेषण बाधा। यह कदम एटीपी संश्लेषण के लिए भस्म ऑक्सीजन का प्रतिशत और भीतरी mitochondrial झिल्ली भर में प्रोटॉन रिसाव पर काबू पाने के लिए भस्म ऑक्सीजन का प्रतिशत अलग करता है। दूसरे इंजेक्शन FCCP (ईटीसी त्वरक) कि mitochondrial झिल्ली भर के बजाय परिसर वी mitochondrial झिल्ली क्षमता के पतन ऊर्जा और ऑक्सीजन की एक तेजी से खपत की ओर जाता है की प्रोटॉन चैनल के माध्यम से हाइड्रोजन आयनों के परिवहन के द्वारा एटीपी संश्लेषण को बाधित, बिना है एटीपी की पीढ़ी। FCCP उपचार कोशिकाओं के स्पेयर सांस की क्षमता की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। तनाव की स्थिति के तहत अतिरिक्त सांस की क्षमता के रखरखाव सेल अस्तित्व के लिए महत्वपूर्ण है। यह क्षमता सब्सट्रेट की उपलब्धता और आदि में शामिल एंजाइमों की कार्य क्षमता सहित कई कारकों द्वारा निर्धारित किया जाता है तीसरे इंजेक्शन Rotenone, एक compl का एक संयोजन हैपूर्व मैं अवरोध करनेवाला, और Antimycin एक, एक जटिल III अवरोध करनेवाला। इस संयोजन mitochondrial श्वसन नीचे बन्द हो जाता है और ओसीआर बिगड़ा mitochondrial समारोह (चित्रा 5C) का एक परिणाम के रूप में कम करने के लिए मनाया जाता है। Tolerogenic moDCs परिपक्व moDCs (चित्रा 5 डी) की तुलना में अधिक बेसल ओसीआर स्तरों का प्रदर्शन किया। इसके अलावा, tolerogenic, LPS-tolerogenic, और अपरिपक्व moDCs अतिरिक्त श्वसन क्षमता परिपक्व moDCs (चित्रा 5E) के साथ तुलना में वृद्धि हुई दिखाया।

MoDCs के चयापचय विशेषता

क्योंकि लैक्टिक एसिड और प्रोटॉन ग्लाइकोलाइसिस के दौरान कोशिकाओं से जारी कर रहे हैं, हम बाह्य अम्लीकरण (ECAR) (चित्रा 6B) की दर की एक वास्तविक समय विश्लेषण प्रदर्शन से moDCs की glycolytic गतिविधि का विश्लेषण किया। ग्लूकोज की उपस्थिति में, सभी moDCs की glycolytic दर बेसल चरण के साथ तुलना में वृद्धि हुई है, के साथपरिपक्व अपरिपक्व moDCs (चित्रा 6D) की तुलना में अधिक glycolytic दर का प्रदर्शन करते moDCs। Tolerogenic और अपरिपक्व moDCs LPS इलाज moDCs (चित्रा 6B) के साथ तुलना में अधिक अधिक से अधिक ग्लाइकोलाइसिस (ग्लूकोज की उपस्थिति में oligomycin से प्रेरित) का प्रदर्शन किया। Tolerogenic और अपरिपक्व moDCs की glycolytic क्षमता परिपक्व moDCs (चित्रा 6E) की तुलना में अधिक था। उनके उच्च glycolytic दर के विपरीत, glycolytic रिजर्व परिपक्व moDCs (चित्रा 6F) में सबसे कम था।

आकृति 1
चित्रा 1:। परिधीय रक्त से Monocyte शोधन (ए) रक्त के 25 मिलीलीटर ध्यान centrifugation से पहले प्रति 50 मिलीलीटर ट्यूब Ficoll के 15 मिलीलीटर पर स्तरित है। PBMCs घनत्व centrifugation के बाद प्लाज्मा के नीचे एक परत में केंद्रित कर रहे हैं। (बी) PBMCs microbeads कि conj हैं साथ incubated हैं मानव CD14 एंटीबॉडी (निर्धारण: माउस IgG2a) मोनोक्लोनल को ugated। और फिर एक स्तंभ है जो एक विभाजक के चुंबकीय क्षेत्र में रखा गया है CD14 + monocytes को अलग करने पर लादा यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: moDCs की रूपात्मक विशेषता। (ए) जीएम- CSF और आईएल -4 के 200 एनजी / एमएल अपरिपक्व moDCs उत्पन्न करने दिवस 0, 4 और 6 के आधार पर शुद्ध CD14 + monocytes में जोड़ा जाता है; और (बी) 100 एनएम विटामिन डी 3 और 5 दिन पर 10 एनएम dexamethasone के साथ उत्तेजना के एक अतिरिक्त कदम tolerogenic moDCs उत्पन्न करता है। अपरिपक्व moDCs और tolerogenic moDCs (सी) उत्पन्न करने के लिए moDCs परिपक्व और (डी) LPS-tolerogenic moDCs दिन 6 पर 1 माइक्रोग्राम / एमएल LPS के साथ प्रेरित कर रहे हैं।ttps: //www.jove.com/files/ftp_upload/54128/54128fig2large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3:। द्वारा फ्लो का सतह मार्कर एचएलए डॉ, CD80, CD83, CD86, CD11, CD14, BDCA3 और LT3 tolerogenic में की अभिव्यक्ति के स्तर (हरा), LPS-tolerogenic (काला), अपरिपक्व (लाल) सतह मार्कर विशेषता, परिपक्व (नीला) moDCs। निर्धारण नियंत्रण ग्रे में दिखाया जाता है। प्रत्येक कोशिका प्रकार के लिए अलग-अलग हिस्टोग्राम fluorophore तीव्रता और मढ़ा की एक्स अक्ष लॉग खिलाफ वाई अक्ष सेल गिनती के साथ साजिश रची है। सभी histograms चार स्वतंत्र प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं। 10.4049 / jimmunol.1303316 (1 जून, 2015): यह आंकड़ा जम्मू Immunol 194 (11), 5174-5186, दोई से संशोधित किया गया है। Reproduced और कॉपीराइट अनुमति के साथ पुनर्प्रकाशित। Copyright 2015 के अमेरिकन एसोसिएशनImmunologists, इंक यहां यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4: moDCs के कार्यात्मक विशेषताओं। (ए) सीडी 4+ टी कोशिकाओं tolerogenic की बढ़ती संख्या के साथ सह-संस्कृति से प्रेरित का alloproliferation आवृत्ति की मात्रा (सहने, हरा), LPS-tolerogenic (एल सहने; काला), अपरिपक्व (आई एम एम, लाल) और परिपक्व (मैट ; नीला) moDCs। डेटा चार स्वतंत्र प्रयोगों से जमा किया गया था; परिपक्व moDCs Dunnett एकाधिक तुलना के बाद परीक्षण के साथ दो तरह से एनोवा द्वारा विश्लेषण किया गया बनाम सभी moDCs के बीच + SEM सांख्यिकीय मतभेद मतलब है। (बी) IFN-Γ (बाएं पैनल), आईएल 12p40 (मध्यम पैनल) और Il- की साइटोकाइन विश्लेषण 10 (दाएँ फलकएल) सीडी 4+ टी कोशिकाओं या तो tolerogenic (हरा), अपरिपक्व (लाल) या परिपक्व (नीला) moDCs की बढ़ती संख्या के साथ सह-सुसंस्कृत बीच alloreactions से supernatants में। डेटा छह स्वतंत्र प्रयोगों से जमा थे; मतलब ± SEM (सी) सीडी 4+ टी सेल alloproliferation और विनियामक टी कोशिकाओं विस्तार tolerogenic moDCs की बढ़ती संख्या की उपस्थिति में परिपक्व moDCs के साथ सह-संस्कृति से प्रेरित किया। वाम वाई अक्ष, सीडी 4+ टी सेल प्रसार की आवृत्ति। सही वाई अक्ष, CD25 उच्च Foxp3 + proliferative सीडी 4+ टी कोशिकाओं पर gated कोशिकाओं की आवृत्ति। डेटा तीन स्वतंत्र प्रयोगों से जमा थे; मतलब ± SEM tolerogenic moDCs Dunnett एकाधिक तुलना के बाद परीक्षण के साथ एक तरह से एनोवा द्वारा विश्लेषण किया गया की अनुपस्थिति बनाम उपस्थिति के बीच सांख्यिकीय मतभेद। (डी) सीडी 4+ टी सेल alloproliferation (बाएं) और CD25highFoxP3 + कोशिकाओं की आवृत्ति (सही) सह से प्रेरित tolerogenic moDCs के साथ संस्कृतिपरिपक्व moDCs की बढ़ती संख्या की उपस्थिति में। डेटा दो से तीन स्वतंत्र प्रयोगों से जमा थे; ± SEM मतलब उपस्थिति के बीच मतभेद सांख्यिकीय बनाम परिपक्व moDCs के अभाव Dunnett एकाधिक तुलना के बाद परीक्षण के साथ दो तरह से एनोवा द्वारा विश्लेषण किया गया। 10.4049 / jimmunol.1303316 (1 जून, 2015): यह आंकड़ा जम्मू Immunol 194 (11), 5174-5186, दोई से संशोधित किया गया है। Reproduced और कॉपीराइट अनुमति। कॉपीराइट 2015. The American प्रतिरक्षाविज्ञानी के संघ के साथ पुनर्प्रकाशित, इंक यहां यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5: moDCs की Mitochondrial गतिविधि का विश्लेषण। (ए) moDCs में mitochondrial झिल्ली क्षमता का स्तर (लाल CMXRos) एफ द्वारा प्राप्त किया गयाकम cytometric विश्लेषण। चार स्वतंत्र प्रयोगों के डेटा जमा थे। ± SEM (बी) के एक वास्तविक समय mitochondrial श्वसन की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व मतलब है। ओसीआर विश्लेषण बेसल श्वसन से और oligomycin के अलावा (जटिल वी निषेध), FCCP (अधिक से अधिक श्वसन प्रेरण), और rotenone / एक मिश्रण antimycin (इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला [आदि] निषेध) के बाद शुरू। Mitochondrial एसआरसी (अधिक से अधिक अधिक से अधिक श्वसन से घटाया बेसल) ओसीआर की अवस्था से प्राप्त होता है। (सी) tolerogenic में माइटोकॉन्ड्रिया ओसीआर (pmol / मिनट) (सहने, हरा) के प्रतिनिधि गतिज अध्ययन, LPS-tolerogenic (एल सहने, काला) अपरिपक्व (आई एम एम, लाल) और परिपक्व (मैट, नीला) oligomycin के अनुक्रमिक अलावा (OLIG), FCCP, और rotenone / antimycin एक (सड़ो-एए)। (डी) ओसीआर moDCs और के बेसल श्वसन की मात्रा का ठहराव का उपयोग करके moDCs ( ई) moDCs के श्वसन क्षमता छोड़ेंगे। डेटा पांच स्वतंत्र प्रयोगों से जमा थे। मतलब ± एसई10.4049 / jimmunol.1303316 (1 जून, 2015): एम यह आंकड़ा जम्मू Immunol 194 (11), 5174-5186, दोई से संशोधित किया गया है। Reproduced और कॉपीराइट अनुमति। कॉपीराइट 2015. The American प्रतिरक्षाविज्ञानी के संघ के साथ पुनर्प्रकाशित, इंक यहां यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा 6: moDCs के चयापचय विशेषता। (ए) वास्तविक समय ग्लाइकोलाइसिस की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। oligomycin (जो अधिक से अधिक सेल ग्लाइकोलाइसिस और जटिल वी निषेध लाती) ECAR विश्लेषण बेसल ECAR, जो कोशिकाओं में ग्लूकोज मुक्त मीडिया ग्लूकोज (ग्लाइकोलाइसिस प्रेरण) के अलावा द्वारा पीछा में incubated रहे थे से शुरू होता है, और अंत में 2-Deoxy-डी शर्करा(ग्लाइकोलाइसिस निषेध)। Glycolytic दर (ग्लाइकोलाइसिस प्रेरण बेसल ECAR के लिए घटाया), glycolytic क्षमता (अधिकतम ग्लाइकोलाइसिस बेसल ECAR के लिए घटाया), और glycolytic रिजर्व (अधिक से अधिक ग्लाइकोलाइसिस ग्लाइकोलाइसिस शामिल करने के लिए घटाया) ECAR वक्र से निकाली गई है। (बी) के प्रतिनिधि गतिज अध्ययन ग्लाइकोलाइसिस पर निर्भर tolerogenic में ECAR (मील प्रति घंटे / मिनट) (सहने, हरा), LPS-tolerogenic (एल सहने, काला), अपरिपक्व (आई एम एम, लाल), और परिपक्व (मैट, नीला) ग्लूकोज (gluc) के अनुक्रमिक इसके उपयोग करके moDCs, oligomycin (OLIG), और 2-डीजी। (सी) बार बेसल ECAR स्तर (डी) glycolytic दर (ई) glycolytic क्षमता है, और (एफ) moDCs की glycolytic रिजर्व दिखा। डेटा तीन स्वतंत्र प्रयोगों से जमा थे; मतलब 6 SEM। सांख्यिकीय मतभेद एक Tukey कई तुलना के बाद परीक्षण के साथ एक तरह से एनोवा द्वारा विश्लेषण किया गया। 10.4049 / jimmunol: यह आंकड़ा जम्मू Immunol 194 (11), 5174-5186, दोई से संशोधित किया गया है.1303316 (1 जून, 2015)। Reproduced और कॉपीराइट अनुमति। कॉपीराइट 2015. The American प्रतिरक्षाविज्ञानी के संघ के साथ पुनर्प्रकाशित, इंक यहां यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

Discussion

इस पत्र monocytes अपरिपक्व moDCs, tolerogenic moDCs और परिपक्व moDCs से उत्पन्न करने के लिए एक विधि का वर्णन है। इस प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम निम्नलिखित पैराग्राफ में विस्तार से चर्चा की गई है। यह ध्यान रखें कि मानव परिधीय रक्त इस प्रोटोकॉल और मानव रक्त से निपटने अभ्यास किया जाना चाहिए के लिए सार्वभौमिक सावधानियों में एक प्रारंभिक सामग्री के रूप में प्रयोग किया जाता है महत्वपूर्ण है। हालांकि यह मनुष्यों के 24 में अस्थि मज्जा से डीसी प्राप्त करने के लिए तकनीकी रूप से संभव है, परिधीय रक्त में पाया कोशिकाओं से इन विट्रो डीसी भेदभाव अस्थि मज्जा की तुलना में परिधीय रक्त की उपलब्धता की वजह से पसंद किया जाता है। कोशिकाओं परिधीय रक्त में पाया बीच, hematopoietic CD34 + स्टेम कोशिकाओं और monocytes आमतौर पर डीसी की इन विट्रो पीढ़ी के लिए उपयोग किया जाता है। Hematopoietic CD34 + स्टेम कोशिकाओं जीएम- CSF और TNF-α के साथ सुसंस्कृत CD1a + और ​​CD14 + सबसेट जो फिर आगे आइलेट्स में भेदभाव कर रहे हैं प्राप्त करने के लिए कर रहे हैंकोशिकाओं और वृक्ष के समान कोशिकाओं की तरह। इसके विपरीत, monocytes जीएम- CSF और आईएल -4 में संवर्धित अपरिपक्व moDCs उत्पन्न करने के लिए कर रहे हैं। कई प्रोटोकॉल परिधीय रक्त से monocytes के संवर्धन के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं; उदाहरण के लिए, प्लास्टिक के बर्तन, धावन और अलगाव किट 25, 26 के पालन से पालन प्रोटोकॉल के फायदे कोशिकाओं को कम से कम नुकसान कर रहे हैं और अपेक्षाकृत हालांकि सेल शुद्धता से समझौता किया जा सकता है लागत प्रभावी। और एक अतिरिक्त कदम आगे के प्रयोगों के लिए कोशिकाओं को अलग करने के लिए आवश्यक है। धावन एक तकनीक है कि उनके आकार और घनत्व के आधार पर कोशिकाओं को अलग करती है। धावन के फायदे सेल व्यवहार्यता हैं और monocytes आसानी से आगे के प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है; हालांकि इस तकनीक का एक elutriator की उपलब्धता और अक्षमता समान अवसादन मानकों के साथ कोशिकाओं के विभिन्न आबादी (टी कोशिकाओं और monocytes) को अलग करने के द्वारा सीमित है। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध अलगाव किट चुंबकीय microbeads का उपयोग या तो सकारात्मक चयन करने के लिए यानकारात्मक monocytic आबादी का चयन करें। कुछ प्रोटोकॉल नकारात्मक चयन का उपयोग एककेंद्रकश्वेतकोशिका अलगाव के प्रति पक्षपाती रहे हैं के रूप में अलग-थलग monocytes "अछूता" (मार्करों या microbeads से बाध्य नहीं) रहते हैं। इस प्रोटोकॉल में, CD14 मोतियों PBMCs से सकारात्मक चुनिंदा मानव monocytes करने के लिए इस्तेमाल किया गया। CD14 एक cytoplasmic डोमेन का अभाव है और CD14 के लिए एंटीबॉडी के बंधन संकेत पारगमन ट्रिगर नहीं करता है। इसके अलावा, microbeads संस्कृति के बाद monocytes से अलग और इसलिए भेदभाव की प्रक्रिया में बाधा नहीं करता है। इसके अलावा, CD14 दृढ़ता से सबसे monocytes पर और कमजोर न्यूट्रोफिल और कुछ माइलॉयड वृक्ष के समान कोशिकाओं, इसलिए अन्य तरीकों 17 से अधिक सेल पवित्रता में अलगाव परिणामों की इस पद्धति पर व्यक्त की है।

रक्त monocytes डीसी या मैक्रोफेज में भेदभाव किया जा सकता है और monocytes के भाग्य का बहुत साइटोकाइन पर्यावरण पर निर्भर करता है। इस पत्र में, moDCs granulocyte बृहतभक्षककोशिका कॉलोनी उत्तेजक कारक (जोड़ने जीएम द्वारा उत्पन्न कर रहे हैं-CSF) और मानव परिधीय रक्त monocytes के लिए इंटरल्युकिन 4 (आईएल 4)। जीएम- CSF एककेंद्रकश्वेतकोशिका अस्तित्व और आईएल 4 बृहतभक्षककोशिका भेदभाव पर निरोधात्मक गतिविधि डालती लिए आवश्यक है; और monocytes जीएम-SCSF और आईएल -4 के मिश्रित इसके अलावा अलग-अलग साइटोकाइन 27 की तुलना में अपरिपक्व moDCs के एक उच्च प्रतिशत उपज। वहाँ अन्य प्रोटोकॉल है कि परिधीय रक्त monocytes 28, 29, 30 के लिए ट्यूमर परिगलन कारक अल्फा (TNF-α), इंटरफेरॉन अल्फा (IFN-α) और इंटरल्युकिन 13 (आईएल -13) जोड़कर moDCs उत्पन्न कर रहे हैं। जीएम- CSF और आईएल -4 के संयोजन से 1990 के दशक में एक स्वीकृत प्रोटोकॉल है कि immunogenic या tolerogenic moDCs में भेदभाव और Th1, Th2 या Th17 को बढ़ावा देने moDCs में ध्रुवीकरण प्लास्टिक अपरिपक्व डीसी उत्पन्न अनुकूलित किया गया था और अब।

अपरिपक्व moDCs विटामिन डी 3 और dexamethasone के अलावा द्वारा tolerogenic moDCs में भेदभाव कर रहे हैं। वहाँ कई प्रोटोकॉल उदाहरण के लिए tolerogenic डीसी उत्पन्न करने के लिए कर रहे हैं, के माध्यम सेपरमाणु कारक-कापा बी (एनएफ-kB) निषेध, β-catenin सक्रियण, विटामिन डी 3, Dexamethasone और rapamycin 31, 32, 33, 34, 35, 9, 36, 37। हालांकि दोनों विटामिन डी 3 और dexamethasone अकेले डीसी, जब व्यक्ति दवाओं का इस्तेमाल कर रहे हैं की तुलना में विटामिन डी 3 और alloproliferation का एक बड़ा दमन में dexamethasone परिणाम के संयोजन पर एक tolerogenic प्रभाव प्रेरित करने के लिए सूचित किया गया है। इसलिए, tolerogenic डीसी की पीढ़ी के लिए मौजूदा प्रोटोकॉल विटामिन डी 3 और dexamethasone के संयोजन के लिए संशोधित किया गया था। इस विधि वर्तमान में एक चिकित्सीय उपयोगिता के साथ मानव tolerogenic डीसी के लिए एक मॉडल के रूप में स्वीकार किया जा रहा है। यह भी ध्यान दें कि पुनर्गठन विटामिन डी 3 और dexamethasone एक छोटी शैल्फ जीवन है महत्वपूर्ण है।

इस प्रोटोकॉल में, Lipopolysaccharides (एलपीएस) एक डीसी परिपक्वता inducer के रूप में जोड़ा गया है। अपरिपक्व moDCs भी समर्थक भड़काऊ कॉकटेल का उपयोग परिपक्वता के लिए प्रेरित किया जा सकता है:(TNF-α), इंटरल्युकिन 1 बीटा (आईएल 1β), इंटरल्युकिन 6 (आईएल -6) और प्रोस्टाग्लैंडीन E2) या समर्थक भड़काऊ साइटोकिन्स (TNF-α और इंटरफेरॉन गामा (IFN-Γ))। समर्थक भड़काऊ कॉकटेल उच्च सह उत्तेजक और प्रवासी कार्यों के साथ परिपक्व moDCs उत्पन्न करता है, लेकिन वे आईएल 12 38 की अपेक्षाकृत कम स्तर का उत्पादन। TNF-α या IFN-Γ अकेले एक स्थिर वृक्ष के समान phenotype 39 के लिए प्रेरित करने में सक्षम नहीं है। एलपीएस टोल की तरह रिसेप्टर 4 (TLR4) को उत्तेजित करता है, डीसी परिपक्वता प्रेरित करने के लिए एनएफ-केबी और माइटोजन सक्रिय प्रोटीन kinases (MAPKs) की सक्रियता के मध्यस्थता करता है। डीसी परिपक्वता LPS से प्रेरित डीसी परिपक्वता मार्कर (CD83, CD86, एचएलए डीआर) की एक अप-विनियमन पता चलता है और यह भी आईएल 12p70 का उत्पादन करने के लिए नेतृत्व किया। इसके अलावा, इस कदम आगे TLR3 एगोनिस्ट साथ LPS जोड़ी के लिए नैदानिक ​​कैंसर के टीके के लिए परिपक्व डीसी उत्पादन करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। इस पत्र में, tolerogenic डीसी LPS उपचार पर परिपक्वता के लिए प्रतिरोधी हो दिखाए जाते हैं। ये अर्द्ध परिपक्व तरह DCs immunogenic नहीं हैं और relea नहीं हैएसई समर्थक भड़काऊ साइटोकिन्स 40।

इस प्रोटोकॉल की सीमाओं भेदभाव प्रक्रिया में झूठ बोलते हैं। प्रक्रिया दिवस 0 से 8 दिन 7 जो एक कठिनाई उच्च throughput विश्लेषण में रूपांतरित किया जा करने के लिए बन गया है लेता है। प्रोटोकॉल में एक संशोधन भेदभाव प्रक्रिया को कम अभी तक अलग-अलग राज्यों में व्यवहार्य डीसी की उच्च संख्या उपज के लिए आवश्यक है। दूसरे, डीसी इस प्रोटोकॉल में साइटोकिन्स के अलावा द्वारा उत्पन्न कर रहे हैं और इन साइटोकिन्स समय की लंबी अवधि के लिए डीसी आबादी को बनाए रखने के लिए नहीं है। इसके अलावा, साइटोकिन्स सांद्रता में विवो में बहुत अधिक से अधिक उपयोग किया जाता है और रास्ते कि physiologically इन विवो डीसी के समान नहीं हैं की पक्षपातपूर्ण विकास में परिणाम सकता है। डीसी व्यापारियों की इन विट्रो संस्कृतियों में उदाहरण के लिए GM-सीएसएफ, जो विवो 41 में सामान्य डीसी भेदभाव के लिए एक आवश्यक साइटोकाइन नहीं है पर प्रतिक्रिया के लिए दिखाया गया है। फिर भी, साइटोकाइन उत्तेजना जीन के लिए एक उपयोगी तरीका हो सकता हैप्रयोग के लिए इन विट्रो में डीसी के उच्च संख्या दर। , ये ऐसे immunofluorescence धुंधला के रूप में अन्य विश्लेषण करने के लिए इस प्रोटोकॉल से उत्पन्न कोशिकाओं के अधीन प्रवाह cytometry करने की क्षमता, Allo प्रतिक्रिया के अध्ययन और चयापचय के अध्ययन के लिए इस विधि की उपयोगिता बढ़ जाती है। इन विट्रो में डीसी डीसी विकास, परिपक्वता और प्रतिजन प्रस्तुति का ज्ञान है जो इन विवो डीसी की दुर्लभ संख्या के साथ क्या करने के लिए पहले से मुश्किल है सुधार करने के लिए एक अच्छा मॉडल के रूप में सेवा करते हैं।

डीसी 'सहिष्णुता बनाम प्रतिरक्षा प्रतिरक्षा को विनियमित करने की क्षमता उनमें कैंसर और स्व-प्रतिरक्षित बीमारियों 42, 43, 44, 45 के खिलाफ चिकित्सा विज्ञान में आकर्षक उम्मीदवारों बनाता है। Immunogenic इस प्रोटोकॉल में उत्पन्न डीसी संक्रामक रोगों और ट्यूमर के खिलाफ टीकाकरण प्रभावकारिता में सुधार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है; tolerogenic डीसी अवांछित टी सेल प्रतिक्रिया को नियंत्रित करने और प्रत्यारोपण के बाद rejections को रोकने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। जटिलप्रतिरक्षा और सहिष्णुता के बीच संतुलन डीसी भेदभाव की स्थिति पर काफी निर्भर करता है। डीसी भेदभाव एक समन्वित सेलुलर कार्यक्रम है कि कई संकेत दे रास्ते और चयापचय भाग्य द्वारा नियंत्रित किया जाता है। डीसी के विभिन्न राज्यों भेदभाव bioenergetic और जैव संश्लेषण जरूरतों में मतभेद है; उदाहरण के लिए, सक्रिय डीसी राज्य आराम कर रही है पर डीसी की तुलना में अधिक ऊर्जावान चयापचय अस्तित्व और प्रवास के लिए महत्वपूर्ण रूपांतरों की आवश्यकता होती है। यह ध्यान रखें कि विटामिन डी 3, dexamethasone और rapamycin tolerogenic DCs के लिए प्रेरित करने की क्षमता के लिए जाना जाता है के लिए महत्वपूर्ण है, डीसी चयापचय को प्रभावित करने में वर्णित किया गया है। इस पत्र में, अलग-अलग राज्यों से भेदभाव moDCs के ऊर्जावान चयापचय बाह्य प्रवाह एनालाइजर का उपयोग कर विशेषता थे और tolerogenic moDCs उच्चतम चयापचय प्लास्टिसिटी और LPS प्रेरित परिपक्वता इस प्लास्टिसिटी में कमी आई प्रदर्शन किया। जबकि catabolic चयापचय को प्रभावित करती है tolerogenic डीसी में कार्य 46 उपचय चयापचय डीसी परिपक्वता का समर्थन करता है। डीसीइस प्रोटोकॉल से उत्पन्न आकलन करने के लिए चिकित्सा विज्ञान में प्रतिरक्षा और सहिष्णुता को संशोधित करने के लिए महत्वपूर्ण है कि क्या पकड़ डीसी की चयापचय राज्य में फेरबदल किया जा सकता है। अंत में, हम अपरिपक्व, tolerogenic और परिपक्व moDCs की पीढ़ी DCs 'immunoregulatory कार्यों के अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया।

Acknowledgments

इस काम के विज्ञान, प्रौद्योगिकी और रिसर्च कोर अनुदान (जे ई सी) के लिए एजेंसी द्वारा समर्थित किया गया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ficoll GE Healthcare 17-1440-03 PBMC isolation
Syringe Becton, Dickinson 302832 PBMC isolation
1.5 ml centrifuge tube Axygen MCT-150-C PBMC isolation
15 ml falcon tube Falcon 352096 PBMC isolation
50 ml falcon tube Falcon 352070 PBMC isolation
Centrifuge Eppendorf 5810R PBMC isolation
0.2 µm filter Sartorius stedim biotech 17597 PBMC isolation
MACs kit Miltenyi biotec 130-042-201 Monocyte enrichment
MiniMACS Separator Miltenyi biotec 130-042-102 Monocyte enrichment
Cell culture grade water Invitrogen, Life Technologies Cell culture
RPMI Gibco, Life Technologies 11875-093 Cell culture
FBS Hyclone SH30070103 Cell culture
Penicillin-streptomycin Gibco, Life Technologies 15140 Cell culture
Phosphate
Buffered Saline		 Gibco, Life Technologies 10010-031 Cell culture
NEAA Gibco, Life Technologies 11140-040 Cell culture
EDTA Gibco, Life Technologies 15575 Cell culture
HEPES Gibco, Life Technologies 15630-080 Cell culture
Sodium Pyruvate Gibco, Life Technologies 11360-070 Cell culture
GM-CSF Miltenyi biotec 130-093-868 Cell culture
IL-4 Miltenyi biotec 130-093-924 Cell culture
Vitamin D3 Sigma D1530 Cell culture
Dexamethasone Sigma D2915 Cell culture
LPS Sigma l2755 Cell culture
trypan blue Gibco, Life Technologies 15250-061 Cell culture
PerCP-conjugated HLADR  BioLegend 307628 Cytometry
PE-conjugated CD80 BD Biosciences 557227 Cytometry
PE-conjugated CD83  BD Biosciences 556855 Cytometry
PE-conjugated CD86  BD Biosciences 555665 Cytometry
APC-conjugated CD11c BD Biosciences 340544 Cytometry
PE-conjugated CD14  Miltenyi biotec 130-091-242 Cytometry
PE-conjugated BDCA3  Miltenyi biotec 130-090-514 Cytometry
APC-conjugated ILT3  eBioscience 12-5139-73 Cytometry
Isotype matched
PerCP- conjugated Mab		 BioLegend 400250 Cytometry
Isotype matched
PE- conjugated Mab		 Miltenyi biotec 130-091-835 Cytometry
Isotype matched
APC- conjugated Mab		 Miltenyi biotec 130-091-836 Cytometry
BD LSR II Flow Cytometer BD Pharmingen BD LSR II  Cytometry
cytofix/cytoperm BD Biosciences 554714 Cytometry
APC/CY7-conjugated CD25 BD pharmingen 557753 Cytometry
PE/CY7-conjugated CD4 Biolegend 300512 Cytometry
PerCP-conjugated CD3 Biolegend 300428 Cytometry
EasySep Human CD4+ T cell enrichment kit STEMCELL Technologies 19052 Alloreaction study
EasySep magnet  STEMCELL Technologies 18000 Alloreaction study
Cell Trace CFSE cell proliferation kit Molecular probes C34554 Alloreaction study
HBSS Gibco, Life Technologies 14025092 Alloreaction study
Alexa Fluor 647-conjugated FoxP3 BD Biosciences 560889
Milliplex MAP Human
Cytokine/Chemokine
magnetic bead panel		 Millipore HCYTOMAG-60K Cytokine analysis
5 ml Polystyrene tube Falcon 352058 Cytokine analysis
Luminex Sheath Fluid  Millipore SHEATHFLUID Cytokine analysis
FLEXMAP 3D system with xPONENT software Luminex Corporation FLEXMAP 3D Cytokine analysis
MitoTracker Red CMXRos Cell Signalling 9082 Mitochondrial activity
DMSO Sigma Aldrich D2650 Mitochondrial activity
XF Assay Medium (OCR) Seahorse Bioscience 102352-000 Metabolic adaptation
Glucose  Sigma Aldrich G8769 Metabolic adaptation
XF Base Medium (ECAR) Seahorse Bioscience 102353-100 Metabolic adaptation
L-glutamine Gibco, Life Technologies 25030-081 Metabolic adaptation
Calibrant Seahorse Bioscience 100840-000  Metabolic adaptation
XF Cell Mito Stress kit Seahorse Bioscience 103015-100 Metabolic adaptation
XF Glycolysis Stress kit Seahorse Bioscience 103020-100 Metabolic adaptation
Seahorse  Seahorse Bioscience XFe96 Metabolic adaptation

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इम्यूनोलॉजी अंक 112 Tolerogenic moDCs परिपक्व moDCs अपरिपक्व moDCs प्रतिरक्षण सहिष्णुता चयापचय
मेटाबोलिक phenotypes भिन्न के साथ अपरिपक्व, परिपक्व और Tolerogenic वृक्ष के समान कोशिकाओं की पीढ़ी
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Sim, W. J., Malinarich, F.,… More

Sim, W. J., Malinarich, F., Fairhurst, A. M., Connolly, J. E. Generation of Immature, Mature and Tolerogenic Dendritic Cells with Differing Metabolic Phenotypes. J. Vis. Exp. (112), e54128, doi:10.3791/54128 (2016).

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