Summary
זיהוי מדויק ומיקום של תאי אפיתל לאורך רירית רירית המעי חיוני להגדיר שושלות תאים שונות. הדמיה תקינה של רקמות מעי היא קריטית לזיהוי דפוסי ביטוי חלבון עם רזולוציה מקסימלית. מחקר זה נועד להתוות שיטות האופטימליות ותנאי רקמות מעי עכבר עיבוד.
Introduction
אפיתל יונקי המעי מהווה שכבת תאים אחת עמודים. במעי הדק, תאי שגשוג מתוחמי המאורות בעוד תאים ממוינים לכבוש באזור הסיסי. עם זאת, כי אין villi ב המעי הגס, תאי השגשוג הם נקודה לחלק התחתון של המאורות ותאי בדיל לכבוש את האזור העליון של המאורות. אפיתל המעי עובר חידוש מהיר (כ 3 - 5 ימים), כי הוא מונע על ידי חלוקה רציפה של תאי השגשוג בתוך המאורות. תאי השגשוג של המאורות אינם אוכלוסייה הומוגנית מחולקים נוסף לתוך תאי גזע הגברה במעבר (ת"א) תאים 1. תאי הגזע מתגוררים בתחתית הקריפטה, בתוך 4 הראשונים - התאים 5 מן מאוד תחתון 2. המודל הנוכחי תומך בקיומו של שני סוגים של תאי גזע: עמודי בסיס הקריפטה תאים גזע (CBC) ותאי גזע שקטים מילואים. ה- CBC sתאים TEM הם מתרבים באופן פעיל מסומנים על ידי G- חלבון בשילוב המכילים חוזרים לאוצין עשיר קולטן 5 (Lgr5) 3, 4 Olfactomedin (Olfm4) 4 ו Achaete scute דמוי 2 (Ascl2) 5. מצד שני, תאי גזע שקט מילואים מסומנים על ידי אתר אינטגרציה וירוס לוקמיה בעכברים תא ספציפי B Moloney 1 (Bmi1) 6, טלומרז העכבר הפוכה transcriptase (mTert) 7, HOP Homeobox (Hopx) 8, Doublecortin דמוי קינאז CAM כמו ב- 1 (Dclk1) 9, ו לאוצין-ריץ 'שחוזר אימונוגלובולין-כמו תחומים 1 (Lrig1) 10. תאי הגזע מתרבים באופן פעיל להצמיח תאי ת"א ואז לעבור התמיינות נוספת לתאים קליטים (enterocytes) ותאי הפרשה (enteroendocrine, גביע, פנט, ותאי Tuft). חלוקת תא רציפה באזור שגשוג תוצאת מהלך עליות של תאי אפיתל לאורך ציר מרתף השליה עד שהם מגיעים עליונים של villi, שם הם עוברים אפופטוזיס והםהשליך מעליו מפני השטח של האפיתל. הסוגים השונים של תאי האפיתל במעי מסומנים על ידי הביטוי של חלבונים נפרדים (לדוגמא, תאי גביע במעי יכולים להיות מוכרים על ידי צביעה עם נוגדן נגד תאי Muc2 ו פנט עם נוגדן נגד ליזוזים). אנו ללמוד את התפקיד של Krüppel דמויי גורמים (KLFs) ב הומאוסטזיס pathobiology של האפיתל במעי 11-13. התוצאות המוצגות כאן לתמוך את הכדאיות של טכניקת Swiss-מתגלגל שונה מבוססות על מחקרים קודמים של התפקיד של גורם Krüppel הדמוי 5 (KLF5) בשמירה על תאי הגזע אפיתל במעי מתרבים באופן פעיל 14. KLF5 הוא גורם שעתוק אבץ אצבעות כי מבוטא בכמות גבוהה בגזע המעיים הפעיל ותא ת"א 12. מחקרים קודמים הראו כי KLF5 הוא שיתוף הביע עם Ki-67, סמן שגשוג ידוע מאורות המעיים.
Tr העיכול מעשה אינו רקמות מבנית או תפקודית הומוגנית. המעי הדק מחולק תריסריון, מְעִי צָם, ואת מעי ואת המעי הגס לתוך cecum ומעי גס, עם האחרון נוסף מחולק הפרוקסימלי, אמצע חלקים דיסטלי. לכל אחד מהחלקים הללו תכונות היסטולוגית ייחודיות והיא ממלאת תפקידים ברורים 15. ככזה, את ההשפעות של עלבונות ואת מידת התגובה של האפיתל במעי תלויה באזור של רקמה למדה 16. בנוסף, זני עכברים שונים להפגין מגוון של התגובה ברמה היסטולוגית בהתאם לסוג של עלבון השתמש במחקרים 16. לכן, כיאה הכנת רקמה יש צורך להתיר היסטולוגית מתאים וניתוח מולקולרי של רקמות מעי. ככזה, ניתוח מענקי טכניקה-רולדה של האורך המלא של האפיתל במעי בבת אחת ובכך הוכיח מסקנות מושכלות על בסיס מידע רחב.
e_content "> הטכניקה-רולדה הוזכר לראשונה על ידי מגנוס 17, ותיאר בפרוטרוט על ידי Moolenbeck ו Ruitenberg ופארק et al. כשיטה להכנת רקמות וביצוע היסטולוגית מנתח של המעי מכרסם 18,19, בהתאמה. הפרוטוקול שמסומן בפרסום זה מציג גרסה משופרת של השיטה המקורית המאפשרת עבור הכנת הרקמה עדכני ואמין למטרות אבחון. טכניקה שונה זה מאפשר אוספים והכנת יעיל של האפיתל במעי טכניקות בשימוש אוניברסלית, כגון אימונוהיסטוכימיה, immunofluorescence, כמו גם כמו כלאה באתרו (פלורסנט 20 chromogenic). יתר על כן, הרקמה השונה דגימת שיטת הכנה מנצלת זמינים וזולים יחסית ריאגנטים תוך שהיא מציעה שיטה של קיבעון רקמות מהירה מאפשרת התאוששות של החלבון, DNA, RNA להערכה נוספת. תפוס יחד, תיהטכניקה של מצוין הערכה מקיפה של histopathological, פתולוגי, ומולקולרית תכונות של האפיתל במעי.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. עכברים
- כל מחקרים שכללו עכברים אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים אוניברסיטת סטוני ברוק ועדת שימוש (IACUC). העכברים היו מתוחזקים על מחזור אור חשוך שעות 12:12.
- מסחרי להשיג C57BL / 6 עכברים. השג C57BL / 6 עכברים שנשאו אללים Klf5 מוקף אתרים loxP (L f Klf5 / f l). עכברים אלו תוארו בעבר 21 ובתנאים באדיבות ד"ר Ryozo נגאי.
- לרכוש C57BL / 6 עכברים נושאים את גן recombinase Cre מושרה לפי תקנה של אמרגן Lgr5 (עכברי Lgr5-EGFP / CreERT2).
- כדי להקים Lgr5-EGFP / קואל T2 / Klf5 עכברים f l / f l, לחצות Klf5 fl / f עכברים l עם Lgr5-EGFP / עכברים קואל T2 ואז הכלאה לאחור הצאצא Klf5 fl / f l עכברים.
- עכברים Treat עם טמוקסיפן לפי הפרוטוקול שתואר לעיל 22. להזריק בן 8 שבועות עכברי הניסוי והבקרה intraperitoneally (IP) עם 1 מ"ג טמוקסיפן (10 מ"ג / מ"ל), מומס בשמן תירס סטרילי, במשך 5 ימים רצופים.
- ביום 14 לאחר הזרקת טמוקסיפן הראשונה, להקריב בעכברים באמצעות מחנק CO 2 על ידי הצבת בתא המחובר ל- CO מקור גז 2. אפשר הגז לזרום לתוך התא עד העכברים הם לא מודעים וכל התנועה נפסקת. כדי להבטיח המתת חסד לבצע פריקה צוואר הרחם.
2. רקמות הכנה שוויצרי רולינג
- שימוש לנתיחת מלקחיים ומספריים, לחתוך חתך בעור של צד הבטן. עם זוג מלקחיים, להחזיק את העור על החתך ומשוך בעדינות מן הרקמה שרירי הבטן. השתמש זוג מספריים כדי לחתוך את העור בטן ולחשוף את שרירי הבטן.
- חזק ולמשוך את PEritoneum עם מלקחיים. הקפד לא להיות מחזיק ומושך את המעיים. בזהירות עושים חתך ברקמת הצפק ולהמשיך חיתוך משם את העור כדי לחשוף את שרירי הבטן. בזהירות עושים חתך את שרירי הבטן ולהמשיך חיתוך משם להם לחשוף את המעיים.
- זהה את המעי הגס ואת עקבות אל הקצה הדיסטלי במקום בו נמצא החיבור החלחולת / פי הטבעת. עם זוג מספרי, לחתוך קרוב ככל לפתיחה האנאלית ככל האפשר.
- זהה את הקיבה ואת העקבות שבו הוא מצטרף עם המעי הדק. עם זוג מספריים, שניתקה המעי על 1 ס"מ מן הבטן. מעבירים את אורכו של המעי הדק והמעי הגס משוחררים לצלחת נקייה פטרי המכילות בופר פוספט (PBS).
- ביד אחת או זוג מלקחיים, להחזיק את הקצה הדיסטלי של המעי הגס ולהשתמש מצד שני לפענח את אורכו בעדינות של המעי הגס מכל רקמת החיבור ו / או שומן mesenteric.
- זהה את cecum(כיס קטן בין המעי הקטן וגדול) וחותך שבו cecum ואת המעי הגס להצטרף (סוף הפרוקסימלי של המעי הגס) כדי לשחרר את המעי הגס.
- ביד אחת או זוג מלקחיים, להחזיק את המעי הדק ולהשתמש מצד שני לפענח את אורכו בעדינות של המעי הדק מכל רקמת החיבור ו / או שומן mesenteric. לחתוך את cecum וזורק אם אין צורך בכך.
הערה: התהליך יכול להיפסק כאן על ידי דוגרים המעיים גזור החוצה מקבע שונה של Bouin (50% אתנול / 5% חומצה אצטית ב O DH 2) לילה ולהמשיך בהליך למחרת. - טיפול קטע אחד של המעי (מעי או מעי גס קטנים), למלא מזרק 10 מיליליטר עם המקבע השונה של Bouin ולצרף מחט gavage אליו. הכנס את המחט כחצי סנטימטר בפתיחה הקדמית של קטע המעי.
- החזק את מחט gavage בתוך קטע המעי על ידי הפעלת לחץ משרד עם מכשירעל קטע המעי. בעזרת היד השנייה מחזיקה את המזרק, להפעיל לחץ עדין אך עקבי כדי לשטוף את התוכן של קטע המעי באמצעות המקבע השונה של Bouin. שלב זה מאפשר ניקוי סימולטני של קטע מעי קיבעון מיידי. השתמש בצלחת פטרי כדי לאסוף את פסולת זרימת דרך. קיבוע ניתן להבחין לפי צבע הנקודות ההפיכים אטום.
הערה: ודא שלא להפעיל לחץ רב מדי במהלך שטיפה או קטע המעי עלול נפרץ. - בעזרת מספריים, לחתוך את קטע המעי longitudinally לאורך קו mesenteric. תחזיק את זה עם זוג מלקחיים ולשטוף אותו בקצרה בצלחת פטרי המכילות PBS.
- חותכים את המעי הדק לתוך 3 חלקים שווים: הפרוקסימלי, באמצע, ואת דיסטלי. מגזר הפרוקסימלי הוא אחד מיד לאחר הקיבה, ומגזר דיסטלי הוא אחד שערב המעי הגס. המגזר הפרוקסימלי שווה אל התריסריון, אמצע אל מְעִי צָם, ואת דיסטליהמעי.
- לכל מגזר לציון הפרוקסימלי ואת הקצה הדיסטלי. סוף הפרוקסימלי הוא זה במקור הצביע לכיוון הבטן, ואת דיסטלי הצביע לעבר המעי הגס.
- השתמש גבי צלחת פטרי למקם את קטע המעי ניקה ופתח. מניחים את קטע המעי עם הצד luminal פונה כלפי מעלה.
- עבור המעי הגס, לזהות את הצד luminal ידי רבגוניות / רכסים לרוץ על פני רוחב שלה נמצאים בסוף הפרוקסימלי. האזורים באמצע הדיסטלי יש כמה רבגוניות שמופעלים longitudinally. עבור המעי הדק, לזהות את הצד luminal ידי משטח המופיעים-מחוספס, אשר מסמן את villi.
הערה: המעי הדק, אין תיחום אנטומיים מקרוסקופית חיצוני של הפרוקסימלי, באמצע ואזורי דיסטלי. עם זאת באזורים אלו ניתן יכולים מזוהים בסעיפים תחת מיקרוסקופ. Villi הם הארוך ביותר באזור הפרוקסימלי ולהיות בהדרגה קצר distally היכן הם נמצאיםהקצר באורך. מיקרוסקופי, המאורות הגסים הם קצרים ביותר באזור הפרוקסימלי אשר יכול גם להיות מזוהה על ידי הנוכחות של רכסים. המאורות הגסים הם גבוהים במותנים וקצרים באזור דיסטלי ועדיין גבוהים באזור הפרוקסימלי.
- עבור המעי הגס, לזהות את הצד luminal ידי רבגוניות / רכסים לרוץ על פני רוחב שלה נמצאים בסוף הפרוקסימלי. האזורים באמצע הדיסטלי יש כמה רבגוניות שמופעלים longitudinally. עבור המעי הדק, לזהות את הצד luminal ידי משטח המופיעים-מחוספס, אשר מסמן את villi.
- המשך עם השוויצרי לגלגל את המעי הגס:
- שמור את המעי הגס שטוח פתוח ולמשוך אותו עם מלקחיים מהקצה הפרוקסימלי שלה לעבר הקצה של צלחת פטרי.
- שמור בצד לומינל פונה כלפי מעלה ומחזיק את הקצה הפרוקסימלי עם המלקחיים ביד אחת ועם היד השנייה חזק קיסם.
- עוטף את הקצה של הקצה הפרוקסימלי ברחבי הקיסם באמצעות המלקחיים מעט לצבוט את הקצה העטוף נגד הקיסם כדי להחזיקו במקום.
- בעדינות ולאט לאט מתחילים לגלגל את הקיסם עם האצבעות כדי לגלגל את המעי הגס ברחבי קיסם ליצירת רולדה.
- לאחר אורך המעי הגס כולו כבר מופשלים, להשתמש זוג מלקחיים כדי להחליק את ג בזהירותOlon רולדה את הקיסם לתוך קלטת רקמות עיבוד / -embedding. מניחים את קלטת בפורמלין 10% שנאגרו הלילה בטמפרטורת החדר.
- המשך עם השוויצרי לגלגל את המעי הדק:
- טיפול קטע אחד בכל פעם, לשמור על הפלח שטוח פתוח עם צד luminal עד ולמשוך אותו עם מלקחיים מהקצה הפרוקסימלי שלה לעבר הקצה של צלחת פטרי.
- המשך עם גלגול שוויצרי כמתואר עבור המעי הגס.
- המשך עם עיבוד רקמות קבוע פורמלין להטבעת פרפין. פעל באופן הבא:
הערה: השתמש מעבד אוטומטי (ראו חומרים וציוד של לפרטים נוספים).- בעוד רקמות נמצאות את הקלטת, לשטוף רקמה עם PBS עד המקבע נמחק לחלוטין.
- מייבשי רקמות באמצעות אתנול לפי הסדר הבא: אתנול 50% במשך 10 דקות, 70% אתנול למשך 10 דקות, 80% אתנול למשך 10 דקות, 95% אתנול למשך 10 דקות, אתנול 100% במשך 10 דקות, אתנול 100% במשך 10 דקות , ו 100% אתנול למשך 10 דקות.
- המרת אתנול עם קסילן לפי הסדר הבא: 2: 1 אתנול: קסילן במשך 10 - 15 דקות, 1: 1 אתנול: קסילן במשך 10 - 15 דקות, 1: 2 אתנול: קסילן במשך 10 - 15 דקות, 100% קסילן במשך 10 - 15 דק ', קסילן 100% במשך 10 - 15 דקות, ו -100 קסילן% במשך 10 - 15 דקות. זהירות: קסילן הוא מפגע בריאותי, וכך במקום העבודה צריכה להיות מצויד אוורור יניקה מקומי עם ברדס ראוי לבין ציוד המגן הנכון צריך להיות לבש ידי אדם.
- המרת קסילן עם פרפין. בצע את השלבים הבאים בוואקום להגדיר בתנור 54 - 58 ° C: 2: פרפין למשך 30 דקות, 1:: קסילן 1 1 קסילן: פרפין למשך 30 דקות, 1: 2 קסילן: פרפין למשך 30 דקות, 100% פרפין 1 - 2 שעות, פרפין 100% עבור 1 - 2 שעות או למשך הלילה.
הערה: אל תתנו פרפין יעלה על 60 מעלות צלזיוס במשך תקופות ממושכות של זמן, כי זה יהיה לבזות את הפולימרים פרפין ולהפוך אותו קשה ופריך. - שבץ רקמה חדשה פרפין אוריינט טרי כמו דההוליד לפני פרפין מתקשה. עבור הלחמניות השויצריות, בעקבות רקמות paraffinization, חשוב למקם כל גליל על צידו במהלך הטבעת פרפין. הדבר מבטיח כי במהלך חיתוך, קטעי האורך של כל גליל יופקו.
- עבור מכתים, לחתוך חלקים עבים 5 מיקרומטר באמצעות microtome. אסוף בסעיפים בשקופיות טעונים ומייבשים אותם (לאפות) בתוך 65 ° C בתנור למשך הלילה; ומצננים לטמפרטורת החדר ולאחר מכן השתמשו בהם מכתים.
הערה: זמן האפייה יכול להתקצר 1 - 2 שעות תלוי כמה טרי חתוך השקופיות. אם פחות מחודש מאז חתך, אז רצוי לאפות לילה. אם זה כבר יותר מחודש, אז 1 - 2 שעות של אפייה מספיקה כדי לחסוך זמן. אם הולך ואוזל הזמן, גיבוי לילה תמיד ניתן להשתמש.
3. ניתוח היסטולוגית ו Immunofluorescence מכתים
ביצוע ניתוח היסטולוגית immunofluמכתים orescence כפי שתואר לעיל 23,24, עם שינויים. עבור חלבון פלואורסצנטי ירוק משופרת (EGFP) immunofluorescence:
- אופים את השקופיות בתנור C 65 מעלות במשך שעה 1 כדי להשבית פעילות phosphatase אלקליין אנדוגני ובהמשך deparaffinize קסילן.
- סעיפים דגירה באמבט של מי חמצן 3% מתנול לחסום peroxidases רקמות אנדוגני; אז רעננותם על ידי הדגירה בסדרה אמבטיה אלכוהול ירידה (100%, 95%, 70%) ואחריו אחזור אנטיגן בתמיסה חיץ ציטראט (10 מ"מ נתרן ציטרט, 0.05% Tween-20, pH 6.0) ב 125 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות באמצעות תא decloaking.
- צייר עיגול סביב סעיפי רקמות באמצעות סימון בעט מספק מחסום הידרופובי דגירת קטעים עם חסימת חיץ (אלבומין בסרום שור 2.5% [BSA] ב-Tween TBS) למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ואז עם נוגדן ראשוני נגד EGFP (דילול 1 : 500) בשעה 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה בתא humidified תוך רעד בעדינות.
- לשטוף סעיפי דגירה עם נוגדנים משני ניאון מתויג בריכוז המתאים למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
- לשטוף שקופיות לאחר גרעיני טיפול כתם נוגדנים משני עם Hoechst ו הר עם תקשורת גוברת.
- לקבלת Klf5 / EGFP / Ki-67 שיתוף מכתים, מגלשות תהליך כמתואר בשלבים 3.1 - 3.3 ו לבצע מכתים Klf5 ידי דוגרים עם נוגדן Klf5 (דילול 1: 150) לילה.
- החל איתור פולימר ארנב AP לשקופיות לפי פרוטוקול.
- לחשוף Klf4 מכתים באמצעות מכתים immunohistochemical אַב צֶבַע לפי פרוטוקול של היצרן.
- בצע elution נוגדן באמצעות פרוטוקול שתואר לעיל 25. דגירה השקופיות ב 50 מעלות צלזיוס גליצין-SDS (pH 2.0) פתרון עם תסיסה במשך שעה 1.
- לשטוף מחליק היטב במים מזוקקים דגירה עם חסימת חיץ (BSA 2.5% ב-Tween TBS) למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
- להוסיף Ki-67 (דילול 1: 500) ו EGFP (דילול 01:500) נוגדנים זמנית ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
- בצע זיהוי ניאון עם נוגדנים משני המתאים לפני צביעה עם Hoechst (מידע לא מוצג) ואת הר עם הרכבה בינונית.
- שימו מורפולוגיה היסטולוגית של הרקמות על מכתים סעיפים 5-מיקרומטר עם hematoxylin ו eosin (H & E) 26. לקבלת תמונות ניאון, להשתמש אורכי גל הפליטה של 535, 646, ו -700 לדמיין EGFP, Klf5, ו קי-67 מכתים, בהתאמה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הטכניקה מתגלגלת השויצרית בשילוב עם מכתים immunohistochemical מאפשרת ניתוח מקיף של רקמת מעי קטנה או גדולה. הדוגמא של צביעת H & E של מעי גס של עכבר C57BL / 6 (איור 1) היא המחשה של ההיתכנות ואת האפקטיביות של הטכניקה הזו. כפי שניתן לראות בתרשים 1, התמונה היא מסוגלת לתפוס את כל חלקי המעי הגס: הפרוקסימלי, אמצע דיסטלי. לפיכך, היא מאפשרת ערכה היסטולוגית מקיפה. הרידוד השוויצרי לבין היכולת ללכוד את אורכו של רקמה קטנה או גדולה מעיים הוא מאוד מועיל עבור ביטוי גנים הטרוגנית סמן מכתים או תגובה משתנה של רקמת המעי על העלבון.
דוגמה לכך היא דפוס מכתים EGFP ב Lgr5-EGFP / עכברים קואל T2. במודל עכבר זה, הביטוי של EGFP הוא מונע על ידיאמרגן Lgr5, הפועל רק מאורות המעיים מתרבים באופן פעיל. בנוסף, במודל עכבר סדרה זו מתאפיינת באי נמוך (כ 5 - 10%) penetrance הביטוי transgene. כפי שניתן לראות בתרשים 2, את דפוס הביטוי EGFP ברקמת המעי משתנה. כתוצאה מכך, את היכולת ללכוד נוף גדול של הרקמה מסייעת לזהות את האזור של עניין.
הטכניקה המתוארת כאן היא חזקה במיוחד עם יישום של מכתים multifluorophore. כאן, אנו מציגים דוגמה trifluorophore הכתמה של רקמת המעי אשר הוכן בטכניקת-רולדה. המטרה העיקרית של מחקר זה הייתה לבדוק את תפקידו של Klf5 בשמירה על תאי גזע מעיים להביע Lgr5 סמן. לכן, מחקנו Klf5 מתאי גזע מעי Lgr5-חיובי Lgr5-EGFP / עכברי קואל T2 ואספנו רקמות מעי ביום 14 לאחר הזרקת טמוקסיפן הראשונה. לניתוח immunohistological, הרקמות הוכנו על פי כללי הפרוטוקול המובא בכתב היד הזה, ואת מכתים עבור EGFP (Lgr5 סמן), Klf5, ו קי-67 בוצע. ב העכברים השליטים, מסומנים כמו Lgr5-EGFP / קואל T2, הן EGFP חיובית (מסומן בחצים כחולים) מאורות EGFP-שלילי (מסומן בחצים לבנים) הציג שיתוף מכתים עבור Klf5 ו קי-67 בשניים בחן מועדים לפי שעון , כפי שמוצג באיור 3D. לעומת זאת, Lgr5-EGFP / קואל T2 / Klf5 fl / fl רקמת המעי הדק, Klf5 / Ki-67 שיתוף מכתים היה חסר מתאי גזע CBC EGFP חיובי (מסומן על ידי החצים הכחולים) אבל נוכח EGFP-שלילי מאורות סמוכים המאורות הירוקים (מסומן על ידי חצים לבנים), כפי שמוצג באיור 3H. זוהי דוגמא מצוינת כי הטכניקות הכנה רקמות המוצג כאן אינה להשפיע לרעה איכות מכתימה.
-page = "1"> 
איור 1. H & E המכתים של מעי גס מתוך C57B L / 6 עכבר. מוצג הוא התמונה המורכבת של האורך של המעי הגס. החלק בין החץ השחור הקו שחור מציין את החלק הפרוקסימלי, בין השורות השחורות וכתום מסמנת באמצע, בין הקו הכתום ואת החץ כתום מסמנות את החלק הדיסטלי של המעי הגס. סרגל קנה מידה = 1,000 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. Immunofluorescence מכתים של קטנים המעי של עכבר Lgr5-EGFP / קואל T2. תמונה מורכבת של EGFP (תיוג לתאי האפיתל Lgr5 חיובי) מכתים סעיפים במעי הדק של עכבר Lgr5-EGFP / קואל T2. דוגמה מכתים immunofluorescence הטרוגנית של סמן חלבון (EGFP) כי תוויות בתאי האפיתל Lgr5-postive מאורות של העכבר Lgr5-EGFP / קואל T2. גרעינים הם דמיינו עם Hoechst. חיצים לבנים לסמן מאורות חיוביים עבור ביטוי EGFP. סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Klf5 איור 3. מחיקת ב Lgr5-EGFP / קואל T2 / Klf5 fl / fl עכברים נמשכים לזמן ארוך מאורות Lgr5-EGFP חיובי. T2 ו- Lgr5-EGFP / קואל T2 / Klf5 fl / fl עכברים ביום 14 יום לאחר ההזרקה טמוקסיפן הראשון, בהתאמה. לוחות לספירה מייצגת מכתים מרקמות שנאספו Lgr5-EGFP / קואל T2 מלא בעכברים, בעוד נציג מכתים לוחות EH הפגנת Lgr5-EGFP / קואל T2 / Klf5 fl / fl עכברים. לוחות A ו- E התצוגה Klf5 immunofluorescent מכתים באדום; B לוחות ו- F להראות מכתים EGFP בירוק; C לוחות G Show Ki-67 מכתים בצהוב; והפנלים D ולהראות H התמזגו תמונות של Klf5, EGFP ו קי-67 כתמים. חצים כחולים מצביעים על מאורות ירוקים; חצי לבנים מצביעים על מאורות nongreen בתמונות הממוזגות. Lgr5-EGFP / קואל T2 / Klf5 fl / fעכברים הראו פסד לטווח הארוך של Klf5 רק בתאי CBC שכותרתו EGFP 14. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הטכניקה מתגלגלת השויצרית היא שיטה חזקה להכנת רקמת מעי להערכה היסטולוגית וצורנית בקנה מידה גדול. בניגוד לטכניקת Swiss-מתגלגלת שתוארה לעיל, אשר פותחה במקור עבור הכנת החלקים קפואים 18,19, הנוהל שהוצג כאן מאפשר הכנת רקמת מעי ללא דיחוי וללא קיבעון קיבעון פורמלין והטבעת פרפין (FFPE). לעומת רקמה קפוא, רקמות FFPE יש הרבה חיי מדף ארוכים יותר והוא הסוג המועדף של רקמות לניתוח היסטולוגית בגלל שלמות רקמות טובה יותר. חלקים קריטיים של פרוטוקול מגלגל שוויצרי לערב גמישות הרקמה עבור מתגלגל ושמירה על שלמות Swiss-רול ואיכות רקמה postfixation מכתים. טכניקת Swiss-רול תקן FFPE של רקמת מעי היא בדרך כלל מייגע זמן רב (2 ימים) 18,19. בנוסף, שיטה סטנדרטית זה בדרך כלל מניבת רקמת מעי כי הוא relatively נוקשה ולא קל להיווצר רולדה. הסיבה לכך היא כי דגירת הלילה של רקמת המעי הגזורה בפורמלין 10% שנאגר נדרשה לפני מתגלגל רקמות. שינויים אחרים של הטכניקה למטרות FFPE פותחו גם, אבל יש להם בעיה רצינית של הנטייה של רקמת המעי לפרוש ו / או עבור במרכז רול להיות מעוות. הסיבה לכך היא רקם בשימוש בטכניקות אלה היא רקמה מבולבלת טריה, שהוא חלקלק מן הריר המיוצר על ידי המעי. הטכניקה השונה החדשה המוצגת כאן מתגברת על בעיות אלה באמצעות צורה שונה של המקבע של Bouin. מקבע של מקורי Bouin מורכב מתערובת של חומצה אצטית, אתנול, חומצה picric ו paraformaldehyde (או פורמלין). שני המרכיבים המסוכנים ביותר, חומצת picric ו paraformaldehyde (או פורמלין), בוטלו כדי לאפשר שימוש הרבה יותר בטוח של מקבע עם תערובת חומצה אצטית / אתנול. חומצת picric קיימת סכנת פיצוץ, paraformaldehyde (או פורמלין) הוא מפגע סרטן. המשמעות של שימוש מקבע השונה של Bouin היא שזה (1) הוא פחות מסוכן לעומת הנוסחא המקורית, (2) קל להכין עם ריאגנטים nonexpensive יחסית אשר זמינים ברוב המעבדות, ו (3) מאפשר מהיר, כמעט מיידית, קיבעון של הרקמה בעת שימוש להדחה. למיטב, אין מגבלות ידועות באמצעות טכניקה זו שונה. בנוסף, הקיבעון המהיר בתערובת זו מאוד מפחית את החלקלקות של רקמת המעי, המאפשר הרבה יותר מהר וקל יותר מתגלגל רקמות. מקבע זה מאפשר גם עבור שימור מעולה של שלמות רקמות תאים לניתוח היסטולוגית ו immunostaining. לפיכך, בהשוואה לשיטות אחרות של הכנת רקמת מעי, טכניקה משופרת זה מתגברת כמה בעיות טכניות ומענקים משפרים מהירות וקלות שימוש.
כמו כן, מקבעים שונה זה כדאי להשתמש עם אחרים עביםרקמות הדורשים קיבוע מהיר. בגלל האופי של חומצה אצטית של אתנול, כי יש את היכולת של חדירה מהירה של רקמות עבות בעוד באותו קיבעון עוברת זמן. השתמשנו בו בהצלחה לתקן עבות רקמות במהירות כגון כבד, טחול וכליות. לדוגמא, קיבוע של כבד כולו עכבר בוגר באמצעות המקבע השונה של Bouin מושגת בדרך כלל תוך 15 - 20 דקות. זה יכול להישפט בקלות על ידי חיתוך חתך לתוך הכבד וההתבוננות אם האזורים העמוקים של הכבד השתנו צבע אדום דם לאפור. השינוי בצבע מעיד על קיבעון. קיבעון זה אז ואחריו crosslinking באמצעות פורמלין שנאגר במשך 24 - 48 שעות ללא חשש רכב הסלולר / רקמות שהשתנה, כמו הרקמה הוא קבוע כבר בשלב זה.
לשם השוואה, שיטת הקיבוע שנאגר פורמלין המסורתית השימוש לבד על כבד כולו עכבר בוגר תדרוש 24 - 48 שעות כדי להשיג fixati רקמות עמוקותעל, עם הסיכון של רכב הסלולר שינה של רקמות עמוקות. שיטות הקיבוע המהירות של רקמות עבות יש יתרון המעולה של צמצום עד למינימום את השינוי של מרכיבים תאיים בתגובה למצבי לחץ, כגון היפוקסיה, לאחר הסרת רקמת האיבר / מהגוף. אנו צופים כי מקבעים השונים ניתן להשתמש זלוף חיה כדרך אפילו מהר לתקן איברים עבים רקמה / הוא רצויים. לכן, לסיכום, בשיטה זו מקבעת שונה לספק יתרונות רבים על פני שיטות מסורתיות בשימוש לקציר רקמת מעי קיבעון ואת המקבע השונה ניתן להשתמש כדי לתקן במהירות רקמות / איברים עבים אחרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stainless Steel Dissecting Kits | VWR | 25640-002 | |
| Decloaking Chamber | Biocare Medical | DC2012 | |
| Syringe 10 ml | VWR | 89215-218 | |
| Swingsette Tissue embedding/processing cassette with lid | Simport | M515 | |
| Superfrost Plus Slides [size: 25 x 75 x 1 mm] | VWR | 48311-703 | |
| Manual Slide Staining Set | Tissue-Tek/Sakura | 4451 | |
| Staining Dish Green | Tissue-Tek/Sakura | 4456 | |
| Staining Dish White | Tissue-Tek/Sakura | 4457 | |
| 24-Slide Slide Holder with Detachable Handle | Tissue-Tek/Sakura | 4465 | |
| Oven | Thermo Scientific | 6243 | for baking slides at 65 degree |
| Dissection microscope | Zeiss | Stemi 2000C | |
| Fluorescence Microscope | Nikon | Eclipse 90i | Bright and fluoerescent light, with objectives: 10X, 20X |
| PAP Pen Super-Liquid Blocker Mini | Fisher Scientific | DAI-PAP-S-M | |
| Ethanol 200 proof | AAPR | 111000200 | |
| Methanol | VWR | BDH1135-4LP | |
| Glacial acetic acid | AAPR | 281000ACS | |
| Xylene | Fisher Scientific | X5P-1GAL | |
| Hydrogen peroxide 25% solution in water | ACROS | 202465000 | |
| 10% bufered formalin | Fisher Scientific | 22-026-213 | |
| Bovine serum fraction V, heat shock | Roche | 3116956001 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P7949 | |
| Sodium citrate | Fisher Scientific | S279 | |
| Gavage needle | VWR | 20068-624 | |
| Rabbit anti Klf5 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-22797 | Dilution 1:150 |
| Chicken anti EGFP antibody | Millipore | AB16901 | Dilution 1:500 |
| Rabbit anti Ki67 antibody | Biocare Medical | CRM325B | Dilution 1:500 |
| Mach3 rabbit AP polymer detection kit | Biocare Medical | M3R533L | |
| Warp red chromogen kit | Biocare Medical | WR806 H | |
| Lgr5-EGFP/CreERT2 mice | Jackson labs | 008875 | |
| Automated processor | Leica | Leica TP1020 |
References
- van der Flier, L. G., Clevers, H. Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium. Annu Rev Physiol. 71, 241-260 (2009).
- Bjerknes, M., Cheng, H. Methods for the isolation of intact epithelium from the mouse intestine. Anat Rec. 199, 565-574 (1981).
- Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449 (7165), 1003-1007 (2007).
- van der Flier, L. G., Haegebarth, A., Stange, D. E., van de Wetering, M., Clevers, H. OLFM4 is a robust marker for stem cells in human intestine and marks a subset of colorectal cancer cells. Gastroenterology. 137 (1), 15-17 (2009).
- van der Flier, L. G., et al. Transcription factor achaete scute-like 2 controls intestinal stem cell fate. Cell. 136 (5), 903-912 (2009).
- Sangiorgi, E., Capecchi, M. R. Bmi1 is expressed in vivo in intestinal stem cells. Nat Genet. 40 (7), 915-920 (2008).
- Montgomery, R. K., et al. Mouse telomerase reverse transcriptase (mTert) expression marks slowly cycling intestinal stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (1), 179-184 (2011).
- Takeda, N., et al. Interconversion between intestinal stem cell populations in distinct niches. Science. 334 (6061), 1420-1424 (2011).
- May, R., et al. Identification of a novel putative gastrointestinal stem cell and adenoma stem cell marker, doublecortin and CaM kinase-like-1, following radiation injury and in adenomatous polyposis coli/multiple intestinal neoplasia mice. Stem Cells. 26 (3), 630-637 (2008).
- Powell, A. E., et al. The pan-ErbB negative regulator Lrig1 is an intestinal stem cell marker that functions as a tumor suppressor. Cell. 149 (1), 146-158 (2012).
- Pearson, R., Fleetwood, J., Eaton, S., Crossley, M., Bao, S. Kruppel-like transcription factors: a functional family. Int J Biochem Cell Biol. 40 (10), 1996-2001 (2008).
- McConnell, B. B., Yang, V. W. Mammalian Kruppel-like factors in health and diseases. Physiol Rev. 90 (4), 1337-1381 (2010).
- McConnell, B. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. The diverse functions of Kruppel-like factors 4 and 5 in epithelial biology and pathobiology. Bioessays. 29 (6), 549-557 (2007).
- Nandan, M. O., Ghaleb, A. M., Bialkowska, A. B., Yang, V. W. Kruppel-like factor 5 is essential for proliferation and survival of mouse intestinal epithelial stem cells. Stem Cell Res. 14 (1), 10-19 (2015).
- Gelberg, H. B. Comparative anatomy, physiology, and mechanisms of disease production of the esophagus, stomach, and small intestine. Toxicol Pathol. 42 (1), 54-66 (2014).
- De Robertis, M., et al. The AOM/DSS murine model for the study of colon carcinogenesis: From pathways to diagnosis and therapy studies. J Carcinog. 10 (9), (2011).
- Magnus, H. A. Observations on the presence of intestinal epithelium in the gastric mucosa. The Journal of Pathology and Bacteriology. 44 (2), 389-398 (1937).
- Moolenbeek, C., Ruitenberg, E. J. The "Swiss roll": a simple technique for histological studies of the rodent intestine. Lab Anim. 15 (1), 57-59 (1981).
- Park, C. M., Reid, P. E., Walker, D. C., MacPherson, B. R. A simple, practical 'swiss roll' method of preparing tissues for paraffin or methacrylate embedding. J Microsc. 145, Pt 1 115-120 (1987).
- Summersgill, B., Clark, J., Shipley, J. Fluorescence and chromogenic in situ hybridization to detect genetic aberrations in formalin-fixed paraffin embedded material, including tissue microarrays. Nat Protoc. 3 (2), 220-234 (2008).
- Takeda, N., et al. Cardiac fibroblasts are essential for the adaptive response of the murine heart to pressure overload. J Clin Invest. 120 (1), 254-265 (2010).
- el Marjou, F., et al. Tissue-specific and inducible Cre-mediated recombination in the gut epithelium. Genesis. 39 (3), 186-193 (2004).
- McConnell, B. B., et al. Kruppel-like factor 5 is important for maintenance of crypt architecture and barrier function in mouse intestine. Gastroenterology. 141 (4), 1302-1313 (2011).
- Nandan, M. O., et al. Kruppel-like factor 5 is a crucial mediator of intestinal tumorigenesis in mice harboring combined ApcMin and KRASV12 mutations. Mol Cancer. 9 (63), (2010).
- Pirici, D., et al. Antibody elution method for multiple immunohistochemistry on primary antibodies raised in the same species and of the same subtype. J Histochem Cytochem. 57 (6), 567-575 (2009).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. CSH Protoc. 2008, pdb prot4986 (2008).
