Summary
Nøjagtig identificering og lokalisering af epitelceller langs tarmslimhinde foring er afgørende for at definere forskellige cellelinier. Korrekt billeddannelse af tarmvæv er afgørende for identifikation af protein ekspressionsmønstre med maksimal opløsning. Denne undersøgelse har til formål at afgrænse de optimale metoder og betingelser for forarbejdning mus tarm væv.
Introduction
Pattedyrs intestinale epithel omfatter et enkelt lag af søjleformede celler. I tyndtarmen, er de proliferative celler begrænset til krypterne mens differentierede celler besætte villus region. Men fordi der er ingen villi i tyktarmen, er de proliferative celler lokaliseret til bunden af krypterne og differentierede celler optager det øvre område af krypterne. Tarmepitelet undergår hurtig genopfyldning (ca. 3 - 5 dage), der er drevet af kontinuert fordeling af de proliferative celler i krypterne. De proliferative celler i krypter er ikke en homogen befolkning og er yderligere opdelt i stamceller og transit-forstærke (TA) celler 1. Stamcellerne opholde nederst krypten, inden for de første 4 - 5 celler fra selve bunden 2. Den nuværende model understøtter eksistensen af to typer stamceller: krypt basis søjleformede (CBC) stamceller og reserve hvilende stamceller. CBC stem celler er aktivt prolifererende og er markeret med leucin-rige repeat-holdige G-protein koblet receptor 5 (Lgr5) 3, Olfactomedin 4 (Olfm4) 4 og Achaete Scute-lignende 2 (Ascl2) 5. På den anden side er reserve hvilende stamceller mærkes ved B-celle-specifik Moloney leukæmivirus integration site 1 (Bmi1) 6, mus telomerase revers transkriptase (mTERT) 7, HOP homeobox (Hopx) 8, Doublecortin-lignende og CAM kinase -lignende 1 (Dclk1) 9, og leucin-rige gentagelser og immunglobulin-lignende domæner 1 (Lrig1) 10. De aktivt prolifererende stamceller giver anledning til TA celler derefter gennemgå yderligere differentiering i absorberende celler (enterocytter) og sekretoriske celler (enteroendocrine, bæger, Paneth, og Tuft celler). Kontinuerlig celledeling i den proliferative zone resulterer i opadgående bevægelse af epitelceller langs krypten-villus aksen indtil de når toppen af villi, hvor de gennemgår apoptose og erløsnes fra overfladen af epitelet. De forskellige typer af intestinale epitelceller er præget af ekspressionen af distinkte proteiner (f.eks kan intestinale slimceller anerkendes ved farvning med antistof mod MUC2 og Paneth celler med antistof mod lysozym). Vi studerer rolle Krüppel-lignende faktorer (KLFs) i homeostase og patobiologien af tarmepitelet 11-13. Resultaterne præsenteres her støtter muligheden for en modificeret schweizisk-rullende teknik er baseret på tidligere undersøgelser af den rolle, Krüppel-lignende faktor 5 (KLF5) i vedligeholdelse af aktivt prolifererende intestinale epitelceller stamceller 14. KLF5 er en zink-finger transkriptionsfaktor, i høj grad udtrykkes i den aktive intestinal stamme og TA celler 12. Tidligere undersøgelser viste, at KLF5 co-udtrykkes med Ki-67, en kendt proliferativ markør i de intestinale krypter.
Den gastrointestinale tr handling er ikke en strukturelt eller funktionelt homogen væv. Tyndtarmen er opdelt i duodenum, jejunum og ileum og tyktarmen i coecum og colon, idet sidstnævnte yderligere opdelt i proksimal, midterste og distale dele. Hver af disse sektioner har unikke histologiske træk og spiller forskellige roller 15. Som sådan kan virkningen af fornærmelser og graden af respons tarmepitelet afhænge regionen studerede væv 16. Derudover forskellige mus stammer demonstrere mangfoldighed af svaret på det histologiske niveau baseret på den type fornærmelse anvendt i undersøgelserne 16. Således sømmer forberedelse væv er nødvendigt at tillade passende histologiske og molekylære analyse af de intestinale væv. Som sådan er den schweizisk-roll teknik tilskud analyse af hele længden af tarmepitelet på én gang og dermed konstaterer velinformerede konklusioner baseret på omfattende information.
e_content "> Den schweiziske-roll teknik blev først nævnt af Magnus 17, og beskrevet i detaljer af Moolenbeck og Ruitenberg og Park et al., som en metode til fremstilling af væv og udføre histologiske analyser af gnaver tarmen 18,19 henholdsvis. Protokollen afgrænset i denne publikation præsenterer en forbedret version af den oprindelige metode, der tillader for rettidig og pålidelig forberedelse væv til diagnostiske formål. denne modificerede teknik gør det muligt for effektive samlinger og udarbejdelse af tarmepitelet for universelt anvendte teknikker, såsom immunhistokemi, immunfluorescens, samt in situ hybridisering (fluorescerende og chromogene 20). Endvidere modificerede vævsprøven fremstillingsmetode anvender let tilgængelige og forholdsvis billige reagenser samtidig med en fremgangsmåde til hurtig vævsfiksering og tillader genvinding af protein, DNA og RNA til yderligere evaluering. taget sammen, this teknik er fremragende til omfattende vurdering af histopatologiske, patologiske, og molekylære funktioner i tarmens epitel.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Mus
- Alle undersøgelser med mus blev godkendt af Stony Brook University Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC). Musene blev holdt på en 12:12 timers lys-mørke-cyklus.
- Kommercielt få C57BL / 6-mus. Opnå C57BL / 6 mus, der bærer Klf5 alleler flankeret af loxP sites (Klf5 f l / f l). Disse mus blev beskrevet tidligere 21 og nådigt fra Dr. Ryozo Nagai.
- Køb C57BL / 6 mus, der bærer den inducerbare Cre rekombinase genet under regulering af Lgr5 promotor (Lgr5-EGFP / CreERT2 mus).
- At etablere Lgr5-EGFP / Creer T2 / Klf5 f l / f l mus, krydse Klf5 fl / f l mus med Lgr5-EGFP / Creer T2 mus og derefter tilbagekrydsning at afkommet Klf5 fl / f l mus.
- Behandl mus med tamoxifen som pr protokollen beskrevet tidligere 22. Injicer 8 uger gamle eksperimentel og kontrol mus intraperitonealt (IP) med 1 mg tamoxifen (10 mg / ml), opløst i sterilt majsolie, 5 dage i træk.
- På dag 14 efter første tamoxifen injektion, ofrer mus under anvendelse af CO 2 kvælning ved at placere dem i et kammer forbundet til CO2 gaskilde. Så gassen kan strømme ind i kammeret, indtil musene er bevidstløse og al bevægelse ophører. At sikre eutanasi udføre cervikal dislokation.
2. Tissue Forberedelse og schweiziske Rolling
- Brug af dissektion pincet og saks, klippe et snit i huden på den abdominale side. Med et par pincet, holde huden på snittet og træk forsigtigt væk fra den abdominale muskelvæv. Brug en saks til at klippe den abdominale hud og udsætte de abdominale muskler.
- Hold og trække op i peritoneum med pincetten. Sørg for ikke at være i besiddelse af og trække på tarmene. gøre omhyggeligt et snit i peritoneal væv og fortsætte afskæring huden for at blotlægge de abdominale muskler. gøre omhyggeligt et snit i bugmuskulaturen og fortsætte skære dem væk for at blotlægge tarmene.
- Identificer tyktarmen og spore til den distale ende, hvor den slutter sig til endetarmen / anus. Med en saks, skåret så tæt på den anale åbning som muligt.
- Identificer maven og spore, hvor det slutter med tyndtarmen. Med en saks, skåret fri tarmen ca. 1 cm væk fra maven. Overfør hele længden af den frigjorte tyndtarmen og tyktarmen til en ren petriskål indeholdende phosphatbufret saltvand (PBS).
- Med den ene hånd eller en pincet, holde den distale ende af tyktarmen og bruge den anden hånd til forsigtigt at optrævle hele længden af tyktarmen fra enhver mesenteriske bindevæv og / eller fedtvæv.
- Identificer coecum(Lille pose mellem tynd- og tyktarm) og skæres, hvor coecum og colon slutte (den proximale ende af tyktarmen) for at frigøre tyktarmen.
- Med den ene hånd eller en pincet, holde tyndtarmen og bruge den anden hånd til forsigtigt at optrævle hele længden af tyndtarmen fra enhver mesenteriske bindevæv og / eller fedtvæv. Skær væk coecum og kassér hvis der ikke er behov for det.
Bemærk: Processen kan stoppes her ved at inkubere dissekerede ud tarme i modificeret Bouins fiksativ (50% ethanol / 5% eddikesyre i dH2O) natten over og fortsætte proceduren den følgende dag. - Håndtering et segment af tarmen (tyndtarmen eller colon), fylde en 10 ml sprøjte med modificeret Bouins fiksativ og vedlægge en gavagenål til den. Stik nålen omkring en halv centimeter i den forreste åbning af den intestinale segment.
- Hold gavagenål inde i intestinale segment ved at anvende et fast tryk med et instrumentpå den intestinale segment. Med den anden hånd, der holder sprøjten, forsigtigt, men konsekvent pres for at skylle indholdet af intestinale segment brug af modificeret Bouins fiksativ. Dette trin muliggør samtidig rengøring af intestinale segment og øjeblikkelig fiksering. Brug en petriskål til at indsamle gennemstrømningen affald. Fiksering kan observeres ved tyktarmen farve dreje uigennemsigtig.
Bemærk: Sørg for ikke at anvende for meget pres under skylning eller tarm segment kan briste åben. - Med en saks, skar den intestinale segment i længderetning langs mesenteriske linje. Hold den med en tang og skyl det kort i en petriskål indeholdende PBS.
- Skær tyndtarmen i 3 lige store segmenter: proximal, midt og distal. Det proximale segment er den, umiddelbart efter maven, og det distale segment er den, umiddelbart før tyktarmen. Det proximale segment svarer til tolvfingertarmen, midten til jejunum, og den distale tilileum.
- For hvert segment markeres den proximale og den distale ende. Den proximale ende er den, der oprindeligt blev peger mod maven, og den distale pegede mod tyktarmen.
- Brug toppen af en petriskål til at placere den rensede og åbnet intestinal segment. Placer intestinale segment med den luminale side vendende opad.
- For colon, identificere den luminale side af variegations / kamme løber tværs af dets bredde og er til stede ved den proximale ende. I midten og distale regioner har nogle variegations, der kører langs. For tyndtarmen, identificerer den luminale side af den ru forekommende overflade, som markerer villi.
Bemærk: tyndtarmen, er der ingen ekstern makroskopisk anatomisk afgrænsning af proksimal, midterste og distale regioner. Men disse regioner kan kan identificeres i afsnit under lup. Villi er længst i den proximale region og bliver gradvist kortere distalt hvor de erden korteste længde. Mikroskopisk de colonic krypter er kortest i den proximale region, som også kan identificeres ved tilstedeværelsen af kamme. Colon krypter er højeste i midtersektionen og kortere i det distale område og stadig højere end i det proximale område.
- For colon, identificere den luminale side af variegations / kamme løber tværs af dets bredde og er til stede ved den proximale ende. I midten og distale regioner har nogle variegations, der kører langs. For tyndtarmen, identificerer den luminale side af den ru forekommende overflade, som markerer villi.
- Fortsæt med Swiss rullende kolon:
- Hold tyktarmen flade åbne og trække det med pincet fra dens proximale ende mod kanten af petriskålen.
- Hold luminale side opad, og hold den proksimale ende med pincet med den ene hånd og med den anden hånd holder en tandstikker.
- Wrap kanten af den proksimale ende omkring tandstikker ved hjælp af pincet og lidt klemme indpakkede kant mod tandstik til at holde det på plads.
- Forsigtigt og langsomt begynder at rulle tandstikker med fingrene at rulle tyktarmen omkring tandstik til dannelse af en roulade.
- Når hele tyktarmen længden er blevet rullet op, bruge et par pincet til forsigtigt skubbe cOlon schweiziske roll off tandstikker og ind i et væv-behandling / -embedding kassette. Placer kassetten i 10% bufret formalin natten over ved stuetemperatur.
- Fortsæt med Swiss rullende tyndtarmen:
- Håndtering ét segment ad gangen, holde segmentet flade åbne med luminale side op og træk den med pincet fra sin proksimale ende mod kanten af petriskålen.
- Fortsæt med Swiss rullende som beskrevet for colon.
- Fortsæt med behandling af formalin-fikserede væv for paraffin indlejring. Gør som følger:
BEMÆRK: Brug en automatiseret processor (se materialer og udstyr er for detaljer).- Mens væv er i kassetten, skylles væv med PBS, indtil fixativ er helt fjernet.
- Dehydrere væv ved anvendelse af ethanol i følgende rækkefølge: 50% ethanol i 10 minutter, 70% ethanol i 10 minutter, 80% ethanol i 10 minutter, 95% ethanol i 10 minutter, 100% ethanol i 10 minutter, 100% ethanol i 10 min og 100% ethanol i 10 min.
- Exchange ethanol med xylen i følgende rækkefølge: 2: 1 ethanol: xylen i 10 - 15 min, 1: 1 ethanol: xylen i 10 - 15 min, 1: 2 ethanol: xylen i 10 - 15 min, 100% xylen i 10 - 15 min, 100% xylen i 10 - 15 min, og 100% xylen i 10 - 15 min. ADVARSEL: Xylen er en sundhedsfare, og dermed arbejdspladsen bør være udstyret med en lokal udsugning med en ordentlig hætte og korrekt beskyttelsesudstyr skal bar af personale.
- Exchange xylen med paraffin. Udføre følgende trin i en vakuumovn indstillet for 54 - 58 ° C: 2: 1 xylen: paraffin i 30 min, 1: 1 xylen: paraffin i 30 min, 1: 2 xylen: paraffin i 30 minutter, 100% paraffin for 1 - 2 ud h, og 100% paraffin til 1 - 2 timer eller natten over.
Bemærk: Lad ikke paraffin overstige 60 ° C i længere tid, da dette vil forringe de paraffin polymerer og gøre det svært og skør. - Integrer i frisk ny paraffin og orientere væv som defar før paraffin hærder. For de schweiziske ruller, efter væv paraffinization, er det vigtigt at repositionere hver rulle på siden under paraffinindlejring. Dette sikrer, at under skæring, vil dele af hele længden af hver rulle skal fremstilles.
- For farvning, skåret 5-um tykke sektioner ved hjælp mikrotom. Saml afsnittene på ladede dias og tør dem (bage) i en 65 ° C ovn natten over; lad afkøle til stuetemperatur og efterfølgende anvendt dem til farvning.
Bemærk: Bagetiden kan afkortes til 1 - 2 timer afhængigt af, hvor nyslået dias er. Hvis mindre end en måned siden sektionering, så er det tilrådeligt at bage natten over. Hvis der er gået mere end en måned, nu 1 - 2 timer af bagning er tilstrækkelig til at spare tid. Hvis løbe tør for tid, kan natten opbakning altid bruges.
3. Histologisk analyse og immunfluorescensfarvning
Udfør histologisk analyse og immunofluorescence farvning som tidligere beskrevet 23,24, med modifikationer. Til forbedret grønt fluorescerende protein (EGFP) immunofluorescens:
- Bag dias i en 65 ° C varm ovn i 1 time for at inaktivere endogen alkalisk fosfatase aktivitet og efterfølgende afparaffiniser i xylen.
- Inkuber sektioner i et bad af 3% hydrogenperoxid i methanol for at blokere endogene væv peroxidaser; derefter rehydrere ved inkubering i en faldende alkoholbad serie (100%, 95%, 70%) efterfulgt af antigen-genvinding i citratbufferopløsning (10 mM natriumcitrat, 0,05% Tween-20, pH 6,0) ved 125 ° C i 10 minutter ved anvendelse af en decloaking kammer.
- Tegn en cirkel omkring vævssnit under anvendelse markeringspen der giver hydrofob barriere og inkuberes sektioner med blokerende buffer (2,5% bovint serumalbumin [BSA] i TBS-Tween) i 30 minutter ved 37 ° C og derefter med primært antistof mod EGFP (fortynding 1 : 500) ved 4 ° C natten over i et fugtigt kammer under omrystning forsigtigt.
- Vask sektioner og inkuberes med fluorescerende-mærket sekundært antistof i den rigtige koncentration i 30 minutter ved 37 ° C.
- Vask slides efter sekundære antistof behandling og pletter kerner med Hoechst og montere med montering medier.
- For Klf5 / EGFP / Ki-67 co-farvning, proces objektglas som beskrevet i trin 3.1 - 3.3 og udfør Klf5 farvning ved inkubation med Klf5 antistof (fortynding 1: 150) natten over.
- Påfør kanin AP polymer detektion til dias som pr protokol.
- Afslører Klf4 farvning under anvendelse chromogen immunhistokemisk farvning i henhold til producentens protokol.
- Udfør antistof eluering under anvendelse af den tidligere beskrevne protokol 25. Inkuber slides ved 50 ° C i Glycin-SDS (pH 2,0) opløsning under omrøring i 1 time.
- Vask glider grundigt med destilleret vand og inkuberes med blokerende buffer (2,5% BSA i TBS-Tween) i 30 minutter ved 37 ° C.
- Tilføj Ki-67 (fortynding 1: 500) og EGFP (fortynding 1:500) antistoffer samtidigt og inkuberes ved 37 ° C i 1 time.
- Udfør fluorescerende detektion med passende sekundære antistoffer før farvning med Hoechst (data ikke vist) og montere med montering medium.
- Observere histologisk morfologi af vævene på farvning 5 um sektioner med hematoxylin og eosin (H & E) 26. For fluorescerende billeder, bruge emissionsbølgelængder af 535, 646, og 700 til at visualisere EGFP, Klf5, og Ki-67 farvning hhv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den schweiziske rullende teknik i kombination med immunhistokemisk farvning muliggør omfattende analyse af små eller store tarm væv. Eksemplet med H & E-farvning af en tyktarmen af en C57BL / 6 mus (figur 1) er en illustration af gennemførligheden og effektiviteten af denne teknik. Som vist i figur 1, er billedet i stand til at indfange alle dele af tyktarmen: proksimale, midterste og distale. Således giver det mulighed for omfattende histologisk vurdering. Den schweiziske rullende og evnen til at fange hele længden af den lille eller stor tarmvæv er yderst nyttigt for heterogen genekspression og markør-farvning eller en variabel reaktion af tarmvævet til spot.
Et eksempel er EGFP farvningsmønster i Lgr5-EGFP / Creer T2-mus. I denne musemodel, er ekspression af EGFP drevet afLgr5 promotor, der er kun aktiv i de aktivt prolifererende tarm krypter. Derudover er denne musemodel karakteriseret ved lav (ca. 5 - 10%) penetrans af transgen ekspression. Som vist i figur 2, EGFP ekspressionsmønsteret i tarmvævet er variabel. Følgelig evnen til at fange en stor visning af vævet hjælper med at identificere området af interesse.
Den her beskrevne teknik er kraftfuld især med anvendelse af multifluorophore farvning. Her viser vi et eksempel på trifluorophore farvning af det intestinale væv, der blev fremstillet under anvendelse af Swiss-roll teknik. Hovedformålet med denne undersøgelse var at undersøge den rolle, Klf5 i opretholdelsen af intestinale stamceller udtrykker Lgr5 markør. Derfor vi slettede Klf5 fra Lgr5-positive tarm stamceller i Lgr5-EGFP / Creer T2 mus og indsamlet tarm væv på dag14 efter første tamoxifen injektion. For immunhistologisk analyse blev vævene fremstillet ifølge protokollen fremlagt i dette håndskrift, og farvning for EGFP (Lgr5 markering), Klf5, og Ki-67 blev udført. I kontrolmusene, benævnt Lgr5-EGFP / Creer T2, både EGFP-positive (markeret med blå pile) og EGFP-negative krypter (markeret med hvide pile) udviste co-farvning for Klf5 og Ki-67 ved to undersøgte tidspunkter som vist i figur 3D. I modsætning hertil Lgr5-EGFP / Creer T2 / Klf5 fl / fl tyndtarmen væv, Klf5 / Ki-67 co-farvning manglede fra EGFP-positive CBC stamceller (markeret med blå pile), men til stede i EGFP-negative krypter tilstødende de grønne krypter (markeret med hvide pile), som vist i figur 3H. Dette er et glimrende eksempel på, at præparatet væv teknikker præsenteres her ikke negativ indflydelse farvning kvalitet.
Figur 1. H & E Farvning af et tyktarmen fra en C57B L / 6 mus. Vist er det sammensatte billede af hele længden af tyktarmen. Den del mellem den sorte pil og sorte linje markerer den proksimale del, mellem de sorte og orange linjer markerer midten, og mellem den orange linje og orange pil markerer den distale del af tyktarmen. Scale bar = 1000 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Immunofluorescens Farvning af en lille tarm af et Lgr5-EGFP / Creer T2 Mouse. Sammensat billede af EGFP (mærkning Lgr5-positive epitelceller) farvning af tyndtarmen sektioner af en Lgr5-EGFP / Creer T2 mus. Eksempel på heterogene immunfluorescensfarvning af protein markør (EGFP) som mærker Lgr5-postive epitelceller i krypter i Lgr5-EGFP / Creer T2 mus. Kerner visualiseres med Hoechst. Hvide pile markerer krypter positive for EGFP-ekspression. Scale bar = 500 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Klf5 Sletning i Lgr5-EGFP / Creer T2 / Klf5 fl / fl Mus Persistente Long Term i Lgr5-EGFP-positive Cryptocoryner. T2 kontrol og Lgr5-EGFP / Creer T2 / Klf5 fl / fl mus på dag 14 dag efter første tamoxifen injektion hhv. Paneler AD er repræsentative for farvning fra væv indsamlet fra Lgr5-EGFP / Creer T2 kontrol mus, mens paneler EH show farvning repræsentant for Lgr5-EGFP / Creer T2 / Klf5 fl / fl mus. Paneler A og E display Klf5 immunfluorescensfarvning med rødt; paneler B og F viser EGFP farvning i grøn; paneler C og G viser Ki-67 farvning i gul; og paneler D og H viser fusionerede billeder af Klf5, EGFP og Ki-67 pletter. Blå pile peger på grønne krypter; hvide pile peger på nongreen krypter i de fusionerede billeder. Lgr5-EGFP / Creer T2 / Klf5 fl / fl mus viste langsigtet tab af Klf5 kun i EGFP-mærkede CBC-celler 14. Scale bar = 50 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den schweiziske rullende teknik er en kraftfuld metode til fremstilling af intestinal væv til histologisk og morfologisk vurdering i stor skala. I modsætning til den tidligere beskrevne Swiss-rullende teknik, som oprindeligt blev udviklet til fremstilling af frosne snit 18,19, proceduren præsenteres her muliggør hurtig tarmvæv forberedelse og fiksering til formalin fiksering og paraffinindlejring (FFPE). Sammenlignet med frosset væv, FFPE væv har meget længere holdbarhed og er den foretrukne form for væv til histologisk analyse på grund af bedre vævsintegritet. Kritiske dele af den schweizisk-rullende protokol indebærer væv fleksibilitet for at rulle og vedligeholdelse af schweizisk-roll integritet og væv kvalitet til farvning postfiksering. Standarden Swiss-roll teknik til FFPE af tarmvæv er typisk besværlig og tidskrævende (2 dage) 18,19. Desuden er denne standardmetode giver normalt tarm væv, der er relatively stiv og ikke let at danne i en roulade. Dette skyldes, inkubation natten over det dissekerede tarmvæv i 10% pufret formalin er påkrævet, før vævet rullende. Andre modifikationer af teknikken for FFPE formål er også udviklet, men de har et stort problem med tendens tarmvæv at udrulle og / eller til midten af rullen, der skal forvrænges. Dette skyldes, at væv, der anvendes i disse teknikker er friske ikke-fikserede væv, som er glat fra slim produceret af tarmen. Den nye modificerede teknik vist her overvinder disse problemer ved anvendelse af en modificeret form af Bouins fiksativ. Original Bouins fiksativ består af en blanding af eddikesyre, ethanol, picrinsyre og paraformaldehyd (eller formalin). De to mest farlige komponenter, picrinsyre og paraformaldehyd (eller formalin), er blevet fjernet for at tillade meget sikrere brug af fiksativ med en eddikesyre / ethanol mix. Pikrinsyre præsenterer en eksplosionsfare, og paraformaldehyde (eller formalin) er en kræft fare. Betydningen af at anvende den modificerede Bouins fiksativ er, at det (1) er mindre farligt i forhold til sin oprindelige formel, (2) er let at fremstille med forholdsvis nonexpensive reagenser, som er let tilgængelige i de fleste laboratorier, og (3) giver mulighed for hurtig, næsten øjeblikkelig, fiksering af vævet, når det anvendes til skylning. Til viden, er der ingen kendte begrænsninger for at bruge denne ændrede teknik. Derudover hurtig fiksering med denne blanding reducerer uhyre glatheden af tarmvævet, tillader meget hurtigere og nemmere væv rullende. Denne fiksativ giver også mulighed for fremragende bevarelse af væv og celler integritet for histologiske og immunfarvning analyse. Således, i forhold til andre metoder til tarm forberedelse væv, denne forbedrede teknik overvinder flere tekniske spørgsmål og tilskud stærkt forbedrede hastighed og brugervenlighed.
Også denne ændrede fiksativ er nyttigt at bruge med andre tykkevæv, der kræver hurtig fiksering. På grund af karakteren af eddikesyre og ethanol, som har kapacitet til hurtig gennemtrængning af tykke væv, mens på samme tid undergår fiksering. Vi har brugt det med succes til hurtigt lave tykt væv, såsom lever, milt og nyrer. For eksempel er fiksering af en voksen mus hel lever anvendelse af den modificerede Bouins fiksativ normalt opnås inden for 15 - 20 min. Dette kan let bedømmes ved at skære et tværsnit i leveren og observere, om de dybe områder af leveren havde ændret farve fra blodrød til grå. Den ændring i farve er indikativ for fiksering. Denne fiksering efterfølges af tværbinding under anvendelse bufret formalin i 24 - 48 timer uden frygt for ændrede cellulære / væv sammensætning, som vævet allerede er fastsat til dette punkt.
Til sammenligning ville anvendelsen traditionelle buffer-formalin fiksering metode alene på en voksen mus hele leveren kræver 24-48 timer for at opnå dybe væv fixatipå, med risiko for ændrede cellulære sammensætning af dyb væv. Den hurtige fiksering metoder til tykke væv har den overordnede fordel at reducere til et minimum ændringen af cellulære komponenter som reaktion på stress-tilstande, såsom hypoksi, efter fjernelse af organer / væv fra kroppen. Vi forventer, at den modificerede fikseringsmiddel kan anvendes i dyr perfusion som en endnu hurtigere metode til at fastlægge tykke væv / organer er ønsket. Således afslutningsvis denne fremgangsmåde og modificerede fiksativ giver flere fordele i forhold til traditionelle metoder inden for tarmvæv høst og fiksering og den modificerede fiksativ kan anvendes til hurtigt lave andre tykke væv / organer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stainless Steel Dissecting Kits | VWR | 25640-002 | |
| Decloaking Chamber | Biocare Medical | DC2012 | |
| Syringe 10 ml | VWR | 89215-218 | |
| Swingsette Tissue embedding/processing cassette with lid | Simport | M515 | |
| Superfrost Plus Slides [size: 25 x 75 x 1 mm] | VWR | 48311-703 | |
| Manual Slide Staining Set | Tissue-Tek/Sakura | 4451 | |
| Staining Dish Green | Tissue-Tek/Sakura | 4456 | |
| Staining Dish White | Tissue-Tek/Sakura | 4457 | |
| 24-Slide Slide Holder with Detachable Handle | Tissue-Tek/Sakura | 4465 | |
| Oven | Thermo Scientific | 6243 | for baking slides at 65 degree |
| Dissection microscope | Zeiss | Stemi 2000C | |
| Fluorescence Microscope | Nikon | Eclipse 90i | Bright and fluoerescent light, with objectives: 10X, 20X |
| PAP Pen Super-Liquid Blocker Mini | Fisher Scientific | DAI-PAP-S-M | |
| Ethanol 200 proof | AAPR | 111000200 | |
| Methanol | VWR | BDH1135-4LP | |
| Glacial acetic acid | AAPR | 281000ACS | |
| Xylene | Fisher Scientific | X5P-1GAL | |
| Hydrogen peroxide 25% solution in water | ACROS | 202465000 | |
| 10% bufered formalin | Fisher Scientific | 22-026-213 | |
| Bovine serum fraction V, heat shock | Roche | 3116956001 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P7949 | |
| Sodium citrate | Fisher Scientific | S279 | |
| Gavage needle | VWR | 20068-624 | |
| Rabbit anti Klf5 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-22797 | Dilution 1:150 |
| Chicken anti EGFP antibody | Millipore | AB16901 | Dilution 1:500 |
| Rabbit anti Ki67 antibody | Biocare Medical | CRM325B | Dilution 1:500 |
| Mach3 rabbit AP polymer detection kit | Biocare Medical | M3R533L | |
| Warp red chromogen kit | Biocare Medical | WR806 H | |
| Lgr5-EGFP/CreERT2 mice | Jackson labs | 008875 | |
| Automated processor | Leica | Leica TP1020 |
References
- van der Flier, L. G., Clevers, H. Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium. Annu Rev Physiol. 71, 241-260 (2009).
- Bjerknes, M., Cheng, H. Methods for the isolation of intact epithelium from the mouse intestine. Anat Rec. 199, 565-574 (1981).
- Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449 (7165), 1003-1007 (2007).
- van der Flier, L. G., Haegebarth, A., Stange, D. E., van de Wetering, M., Clevers, H. OLFM4 is a robust marker for stem cells in human intestine and marks a subset of colorectal cancer cells. Gastroenterology. 137 (1), 15-17 (2009).
- van der Flier, L. G., et al. Transcription factor achaete scute-like 2 controls intestinal stem cell fate. Cell. 136 (5), 903-912 (2009).
- Sangiorgi, E., Capecchi, M. R. Bmi1 is expressed in vivo in intestinal stem cells. Nat Genet. 40 (7), 915-920 (2008).
- Montgomery, R. K., et al. Mouse telomerase reverse transcriptase (mTert) expression marks slowly cycling intestinal stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (1), 179-184 (2011).
- Takeda, N., et al. Interconversion between intestinal stem cell populations in distinct niches. Science. 334 (6061), 1420-1424 (2011).
- May, R., et al. Identification of a novel putative gastrointestinal stem cell and adenoma stem cell marker, doublecortin and CaM kinase-like-1, following radiation injury and in adenomatous polyposis coli/multiple intestinal neoplasia mice. Stem Cells. 26 (3), 630-637 (2008).
- Powell, A. E., et al. The pan-ErbB negative regulator Lrig1 is an intestinal stem cell marker that functions as a tumor suppressor. Cell. 149 (1), 146-158 (2012).
- Pearson, R., Fleetwood, J., Eaton, S., Crossley, M., Bao, S. Kruppel-like transcription factors: a functional family. Int J Biochem Cell Biol. 40 (10), 1996-2001 (2008).
- McConnell, B. B., Yang, V. W. Mammalian Kruppel-like factors in health and diseases. Physiol Rev. 90 (4), 1337-1381 (2010).
- McConnell, B. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. The diverse functions of Kruppel-like factors 4 and 5 in epithelial biology and pathobiology. Bioessays. 29 (6), 549-557 (2007).
- Nandan, M. O., Ghaleb, A. M., Bialkowska, A. B., Yang, V. W. Kruppel-like factor 5 is essential for proliferation and survival of mouse intestinal epithelial stem cells. Stem Cell Res. 14 (1), 10-19 (2015).
- Gelberg, H. B. Comparative anatomy, physiology, and mechanisms of disease production of the esophagus, stomach, and small intestine. Toxicol Pathol. 42 (1), 54-66 (2014).
- De Robertis, M., et al. The AOM/DSS murine model for the study of colon carcinogenesis: From pathways to diagnosis and therapy studies. J Carcinog. 10 (9), (2011).
- Magnus, H. A. Observations on the presence of intestinal epithelium in the gastric mucosa. The Journal of Pathology and Bacteriology. 44 (2), 389-398 (1937).
- Moolenbeek, C., Ruitenberg, E. J. The "Swiss roll": a simple technique for histological studies of the rodent intestine. Lab Anim. 15 (1), 57-59 (1981).
- Park, C. M., Reid, P. E., Walker, D. C., MacPherson, B. R. A simple, practical 'swiss roll' method of preparing tissues for paraffin or methacrylate embedding. J Microsc. 145, Pt 1 115-120 (1987).
- Summersgill, B., Clark, J., Shipley, J. Fluorescence and chromogenic in situ hybridization to detect genetic aberrations in formalin-fixed paraffin embedded material, including tissue microarrays. Nat Protoc. 3 (2), 220-234 (2008).
- Takeda, N., et al. Cardiac fibroblasts are essential for the adaptive response of the murine heart to pressure overload. J Clin Invest. 120 (1), 254-265 (2010).
- el Marjou, F., et al. Tissue-specific and inducible Cre-mediated recombination in the gut epithelium. Genesis. 39 (3), 186-193 (2004).
- McConnell, B. B., et al. Kruppel-like factor 5 is important for maintenance of crypt architecture and barrier function in mouse intestine. Gastroenterology. 141 (4), 1302-1313 (2011).
- Nandan, M. O., et al. Kruppel-like factor 5 is a crucial mediator of intestinal tumorigenesis in mice harboring combined ApcMin and KRASV12 mutations. Mol Cancer. 9 (63), (2010).
- Pirici, D., et al. Antibody elution method for multiple immunohistochemistry on primary antibodies raised in the same species and of the same subtype. J Histochem Cytochem. 57 (6), 567-575 (2009).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. CSH Protoc. 2008, pdb prot4986 (2008).
