Summary
التحديد الدقيق والمكان من الخلايا الظهارية على طول بطانة مخاطية الأمعاء ضرورية لتحديد الأنساب مختلفة من الخلايا. التصوير السليم للأنسجة الأمعاء هو أمر حاسم لتحديد أنماط التعبير البروتين مع قرار الحد الأقصى. وتهدف هذه الدراسة لتحديد الأساليب والظروف المثلى لأنسجة الأمعاء معالجة الماوس.
Introduction
وتتألف ظهارة الأمعاء الثدييات طبقة واحدة من الخلايا عمودية. في الأمعاء الدقيقة، تقتصر الخلايا التكاثري إلى الخبايا في حين تحتل خلايا متمايزة منطقة زغابة. ومع ذلك، بسبب عدم وجود الزوائد في الأمعاء الغليظة، يتم ترجمة الخلايا التكاثري إلى الجزء السفلي من الخبايا والخلايا المتمايزة تحتل المنطقة العليا من الخبايا. ظهارة الأمعاء يخضع تجديد السريع (حوالي 3-5 أيام) التي يقودها الانقسام المستمر للخلايا التكاثري داخل الأقبية. خلايا التكاثري من الخبايا ليست متجانسة السكان وتنقسم الى مزيد من الخلايا الجذعية و(TA) العبور تضخيم الخلايا 1. الخلايا الجذعية الموجودة في الجزء السفلي من سرداب، خلال أول 4-5 خلايا من الجزء السفلي جدا 2. النموذج الحالي يدعم وجود نوعين من الخلايا الجذعية: الخلايا الجذعية سرداب قاعدة عمودي (CBC) والاحتياطي الخلايا الجذعية هادئة. سي بي سي قخلايا تيم تنتشر بنشاط ويتم وضع علامة كل يسين الغنية التي تحتوي على تكرار G-بروتين بالإضافة مستقبلات 5 (Lgr5) 3، Olfactomedin 4 (Olfm4) 4 و Achaete ترس مثل 2 (Ascl2) 5. من ناحية أخرى، وصفت الاحتياطي الخلايا الجذعية الساكنة التي كتبها B مولوني الفئران الموقع خلية محددة فيروس اللوكيميا التكامل 1 (Bmi1) 6، التيلوميراز الماوس عكس الناسخ (mTert) 7، HOP علبة مثلية (Hopx) 8، Doublecortin على غرار وكام كيناز تشبه 1 (Dclk1) 9، ويسين الغنية يكرر والمناعي، مثل مجالات 1 (Lrig1) 10. الخلايا الجذعية بنشاط تكاثر تثير خلايا TA ثم الخضوع لمزيد من التمايز إلى خلايا الاستيعابية (المعوية) والخلايا الإفرازية (enteroendocrine، كأس، خلايا بانيت، والخصلة). انقسام الخلايا المستمر في منطقة التكاثري النتائج في الحركة الصعودية للخلايا الظهارية على طول محور سرداب-زغابة حتى تصل إلى أعلى من الزغب، حيث أنها تخضع لموت الخلايا المبرمج، وهيتنفصل عن سطح البشرة. يتم وضع علامة على أنواع مختلفة من الخلايا الظهارية في الأمعاء عن طريق التعبير عن بروتينات مميزة (على سبيل المثال، الخلايا الكأس المعوية يمكن التعرف عليه بواسطة تلطيخ مع الأجسام المضادة ضد Muc2 وبانيت الخلايا مع الأجسام المضادة ضد الليزوزيم). نقوم بدراسة دور العوامل Krüppel مثل (KLFs) في التوازن والبيولوجيا المرضية من ظهارة الأمعاء 11-13. وتستند النتائج المعروضة هنا تدعم جدوى تقنية السويسري المتداول تعديل على الدراسات السابقة لدور عامل Krüppel مثل 5 (KLF5) في الحفاظ على بنشاط تكاثر الخلايا الجذعية المعوية الظهارية 14. KLF5 هو عامل النسخ الزنك والإصبع التي يتم التعبير غاية في جذع الأمعاء نشطة وخلايا TA 12. وأظهرت دراسات سابقة أن KLF5 وشارك في التعبير عنها كي-67، علامة التكاثري المعروفة في الخبايا المعوية.
آر الهضمي فعل ليس الأنسجة متجانسة من الناحية الهيكلية أو وظيفيا. يتم تقسيم الأمعاء الدقيقة العفج والصائم واللفائفي والأمعاء الغليظة إلى الأعور والقولون، مع مزيد من الأخير ينقسم إلى القريبة والمتوسطة والبعيدة أجزاء. كل من هذه الأقسام لديها ميزات فريدة من نوعها النسيجية ويلعب أدوار متميزة (15). على هذا النحو، وآثار الشتائم ودرجة الاستجابة للظهارة الأمعاء قد تعتمد على المنطقة من الأنسجة درس 16. بالإضافة إلى ذلك، العديد من سلالات الفئران تثبت التنوع في الاستجابة على الصعيد النسيجي على أساس نوع من الإهانة المستخدمة في الدراسات 16. وهكذا، يليق إعداد الأنسجة ضروري للسماح النسيجية المناسبة والتحليل الجزيئي للأنسجة الأمعاء. على هذا النحو، والسويسرية لفة تحليل المنح تقنية طول الكامل للظهارة الأمعاء في وقت واحد، وبالتالي أيقن استنتاجات مطلعة على أساس معلومات شاملة.
e_content "> تقنية السويسري لفة ذكر لأول مرة من قبل ماغنوس 17، ووصف بالتفصيل Moolenbeck وRuitenberg وبارك وآخرون باعتبارها طريقة لتحضير الأنسجة وأداء النسيجية يحلل من القوارض الأمعاء 18،19 على التوالي. البروتوكول المحددة في هذا المنشور تقدم نسخة محسنة من الأسلوب الأصلي الذي يسمح لإعداد الأنسجة في الوقت المناسب وموثوق بها لأغراض التشخيص. وتتيح هذه التقنية المعدلة لمجموعات فعالة وإعداد ظهارة الأمعاء عن التقنيات المستخدمة عالميا، مثل المناعية، المناعي، وكذلك كما (الفلورية ومولد اللون 20) التهجين. وعلاوة على ذلك، والأنسجة تعديل عينة طريقة التحضير تستخدم الكواشف متوفرة وغير مكلفة نسبيا في حين تقدم وسيلة لتثبيت الأنسجة السريع، ويسمح للانتعاش من البروتين، والحمض النووي، والجيش الملكي النيبالي لتقييم إضافي. المحصلة معا، ثيالصورة التقنية ممتازة لتقييم شامل من المظاهر التشريحية المرضية، المرضية، والجزيئية للظهارة الأمعاء.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. الفئران
- تمت الموافقة على جميع الدراسات على الفئران لجنة جامعة ستوني بروك المؤسسي رعاية الحيوان واستخدام (IACUC). واستمرت الفئران على دورة ضوء الظلام 0:12 ساعة.
- تجاريا الحصول C57BL / 6 الفئران. الحصول على C57BL / 6 الفئران تحمل أليل Klf5 يحيط بها مواقع loxP (Klf5 و ل / و ل). وقد وصفت هذه الفئران قبل 21 وقدمت تكرم الدكتور Ryozo ناغاي.
- شراء C57BL / 6 الفئران يحمل محرض لجنة المساواة العرقية recombinase الجينات تحت تنظيم المروج Lgr5 (Lgr5-EGFP / CreERT2 الفئران).
- لإنشاء Lgr5-EGFP / CREER T2 / Klf5 و ل الفئران / و ل، عبر Klf5 فلوريدا / و الفئران لتر مع Lgr5-EGFP / الفئران CREER T2 ثم متصالب رجعي ذرية لKlf5 فلوريدا / و ل الفئران.
- الفئران في علاج بعقار تاموكسيفين وفقا للبروتوكول وصفها سابقا 22. حقن عمرها 8 أسابيع السيطرة على الفئران التجريبية وداخل الصفاق (IP) مع 1 ملغ من عقار تاموكسيفين (10 ملغ / مل)، وحلت في زيت الذرة العقيمة، لمدة 5 أيام متتالية.
- في يوم 14 بعد أول حقن تاموكسيفين، التضحية الفئران باستخدام ثاني أكسيد الكربون 2 الاختناق عن طريق وضعها في غرفة متصلة ثاني مصدر للغاز 2. تسمح للغاز في التدفق إلى الغرفة حتى الفئران هي فاقدا للوعي وتوقف عن الحركة. لضمان القتل الرحيم أداء خلع عنق الرحم.
2. الأنسجة إعداد والسويسري المتداول
- باستخدام ملقط تشريح ومقص، وقطع شق في الجلد في الجانب البطن. مع زوج من ملقط، مع الاستمرار على الجلد في شق وسحب بلطف بعيدا عن النسيج العضلي في البطن. استخدام زوج من مقص لقطع الجلد في منطقة البطن وفضح عضلات البطن.
- عقد وسحب ما يصل بيritoneum مع ملقط. تأكد من عدم الكشف عن عقد وسحب في الأمعاء. جعل بعناية شق في الأنسجة البريتوني ومواصلة قطع بعيدا الجلد لفضح عضلات البطن. جعل بعناية شق في عضلات البطن ومواصلة قطع بها بعيدا لفضح الأمعاء.
- تحديد القولون وتتبع إلى نهاية البعيدة حيث ينضم المستقيم / الشرج. مع زوج من مقص، وقطع أقرب إلى فتحة الشرج ممكن.
- تحديد المعدة وتتبع حيث ينضم مع الأمعاء الدقيقة. مع زوج من مقص، وقطع سراح الأمعاء حوالي 1 سم بعيدا عن المعدة. نقل طول الأمعاء الدقيقة الافراج عن والقولون إلى طبق بيتري نظيفة تحتوي على الفوسفات مخزنة المالحة (PBS).
- مع جهة واحدة أو زوج من ملقط، مع الاستمرار على النهاية البعيدة من القولون واستخدام اليد الأخرى لكشف بلطف على طول القولون من أي نوع من الأنسجة الضامة و / أو الدهون المساريقي.
- تحديد الأعور(الحقيبة الصغيرة بين الأمعاء الدقيقة والغليظة) وخفض حيث الأعور والقولون انضمام (نهاية القريبة من القولون) لتحرير القولون.
- مع جهة واحدة أو زوج من ملقط، عقد الأمعاء الدقيقة واستخدام اليد الأخرى لكشف بلطف على طول الأمعاء الدقيقة من أي نوع من الأنسجة الضامة و / أو الدهون المساريقي. قطع الأعور وتجاهل إذا لم يكن هناك حاجة لذلك.
ملاحظة: يمكن أن تتوقف هذه العملية التي يحتضنها هنا الأمعاء تشريح في تعديل تثبيتي بوان (50٪ من الإيثانول / 5٪ حمض الخليك في DH 2 O) بين عشية وضحاها، ومواصلة الإجراءات في اليوم التالي. - التعامل مع جزء واحد من الأمعاء (الأمعاء الدقيقة أو القولون)، وملء حقنة 10 مل مع تثبيتي تعديل بوان ونعلق إبرة أنبوب تغذية لذلك. ادخال الإبرة حوالي نصف سنتيمتر في افتتاح الأمامي للجزء الأمعاء.
- عقد إبرة أنبوب تغذية داخل قطاع الأمعاء عن طريق الضغط ثابت بصكعلى القطعة الأمعاء. مع اليد الأخرى يمسك حقنة، وتطبيق ضغط لطيف ولكن ثابت لمسح محتويات الشريحة المعوية باستخدام مثبت تعديل بوان. هذه الخطوة تسمح التنظيف في وقت واحد للجزء الأمعاء والتثبيت على الفور. استخدام طبق بتري لجمع النفايات من خلال تدفق. تثبيت يمكن ملاحظتها من خلال لون القولون تحول مبهمة.
ملاحظة: تأكد من عدم تطبيق الكثير من الضغط أثناء التنظيف أو جزء الأمعاء قد تنفجر مفتوحة. - باستخدام مقص، وقطع فتح جزء الأمعاء بشكل طولي على طول الخط المساريقي. لأنه عقد مع زوج من الملقط وشطف لفترة وجيزة في طبق بتري تحتوي على برنامج تلفزيوني.
- قطع الأمعاء الدقيقة إلى 3 شرائح متساوية: الداني، منتصف، والقاصي. في الجزء الأقرب هو واحد مباشرة بعد المعدة، والجزء القاصي هو واحد مباشرة قبل القولون. الجزء الداني ما يعادل الاثني عشر، منتصف لالصائم، والقاصي لالدقاق.
- لكل جزء بمناسبة الداني والقاصي نهاية. نهاية القريبة هي التي كان يشير في الأصل نحو المعدة، والقاصي وأشار نحو القولون.
- استخدام الجزء العلوي من طبق بيتري لوضع شريحة الأمعاء تنظيفها وفتح. ضع شريحة الأمعاء مع الجانب اللمعية تواجه التصاعدي.
- لالقولون، وتحديد الجانب اللمعية من قبل variegations / التلال يمر عبر العرض والموجودة في نهاية الداني. المناطق المتوسطة والبعيدة لديها بعض variegations التي تعمل بشكل طولي. لالأمعاء الدقيقة، وتحديد الجانب اللمعية عن سطح الظهور الخام، الذي يصادف الزغب.
ملاحظة: للحصول على الأمعاء الدقيقة، لا توجد ترسيم الحدود التشريحية العيانية الخارجية القريبة والمتوسطة والبعيدة المناطق. ولكن هذه المناطق يمكن أن تحدد في أقسام تحت المجهر. الزغابات هي أطول في المنطقة القريبة وتصبح أقصر تدريجيا بشكل أقصى أين همأقصر في الطول. المجهر، الخبايا القولون هي أقصر في المنطقة القريبة والتي يمكن أيضا الكشف عن هويته بسبب وجود التلال. الخبايا القولون هي الأطول في القسم الوسطي وأقصر في المنطقة البعيدة حتى الآن لا يزال أطول مما كانت عليه في المنطقة القريبة.
- لالقولون، وتحديد الجانب اللمعية من قبل variegations / التلال يمر عبر العرض والموجودة في نهاية الداني. المناطق المتوسطة والبعيدة لديها بعض variegations التي تعمل بشكل طولي. لالأمعاء الدقيقة، وتحديد الجانب اللمعية عن سطح الظهور الخام، الذي يصادف الزغب.
- المضي قدما السويسري المتداول القولون:
- إبقاء القولون مفتوحة شقة وتسحبه مع ملقط من نهاية القريبة تجاه حافة طبق بيتري.
- حافظ على الجانب اللمعية مواجهة مع الاستمرار على نهاية القريبة مع ملقط مع يد واحدة مع جهة أخرى عقد مسواك.
- التفاف على حافة نهاية الداني حول مسواك باستخدام ملقط وقرصة قليلا على حافة ملفوفة ضد مسواك ليثبت في مكانه.
- بلطف وببطء بدء المتداول مسواك مع الأصابع للفة القولون حول المسواك لتشكيل لفة السويسرية.
- مرة واحدة وقد توالت على طول القولون بأكمله حتى، استخدام زوج من ملقط لالشريحة بعناية جolon سويس رول قبالة مسواك وإلى معالجة الأنسجة / -embedding كاسيت. وضع الكاسيت في 10٪ مخزنة الفورمالين بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
- المضي قدما السويسري المتداول الأمعاء الدقيقة:
- التعامل مع جزء واحد في وقت واحد، والحفاظ على شريحة مفتوحة شقة مع الجانب اللمعية صعودا وتسحبه مع ملقط من نهاية القريبة تجاه حافة طبق بيتري.
- المضي قدما المتداول السويسري كما هو موضح في القولون.
- المضي قدما في معالجة الأنسجة الثابتة الفورمالين لتضمين البارافين. استكمل كما يلي:
ملاحظة: استخدام معالج الآلي (انظر المواد والمعدات ولمزيد من التفاصيل).- بينما الأنسجة في الكاسيت، وشطف الأنسجة مع PBS حتى تتم إزالة تثبيتي تماما.
- يذوى الأنسجة باستخدام الإيثانول في التسلسل التالي: 50٪ من الإيثانول لمدة 10 دقيقة، و 70٪ من الإيثانول لمدة 10 دقيقة، و 80٪ من الإيثانول لمدة 10 دقيقة، و 95٪ من الإيثانول لمدة 10 دقيقة، و 100٪ من الإيثانول لمدة 10 دقيقة، و 100٪ من الإيثانول لمدة 10 دقيقة و100٪ من الإيثانول لمدة 10 دقيقة.
- صرف الإيثانول مع زيلين في التسلسل التالي: 2: 1 الايثانول: الزيلين لمدة 10-15 دقيقة، 1: 1 الايثانول: الزيلين لمدة 10-15 دقيقة، 1: 2 الايثانول: الزيلين لمدة 10-15 دقيقة، و 100٪ الزيلين لمدة 10 - 15 دقيقة، و 100 زيلين٪ لمدة 10 - 15 دقيقة، و 100 زيلين٪ لمدة 10 - 15 دقيقة. تنبيه: الزيلين يشكل خطرا صحيا، وبالتالي يجب أن تكون مجهزة مكان العمل مع تهوية العادم المحلية مع غطاء محرك السيارة المناسبة ومعدات الوقاية المناسبة يجب أن ترتدي من قبل الموظفين.
- صرف زيلين مع البارافين. نفذ الخطوات التالية في فراغ وضع الفرن لمدة 54-58 درجة مئوية: 2: 1 زيلين: البارافين لمدة 30 دقيقة، 1: 1 زيلين: البارافين لمدة 30 دقيقة، 1: 2 زيلين: البارافين لمدة 30 دقيقة، و 100٪ من النفط الأبيض لل 1-2 ساعة، و 100٪ للالبارافين 1-2 ساعة أو بين عشية وضحاها.
ملاحظة: لا تدع البارافين تتجاوز 60 درجة مئوية لفترات طويلة من الزمن لأن هذا سوف تحط من البوليمرات البارافين وتجعل من الصعب وهشة. - تضمين في طازجة جديدة البارافين وتوجيه الأنسجة كما ديانجب قبل يصلب البارافين. لفات السويسرية، بعد paraffinization الأنسجة، فمن المهم أن يعيد كل لفة على جانبها خلال تضمين البارافين. وهذا يضمن أنه خلال عدة قطاعات، وسيتم إنتاج أجزاء من طول كل لفة.
- لتلطيخ، وقطع الفروع السميكة 5 ميكرون باستخدام مشراح. جمع المقاطع على الشرائح المشحونة وتجفيفها (خبز) في الفرن 65 درجة مئوية خلال الليل. السماح لتبرد لدرجة حرارة الغرفة، واستخدامها في وقت لاحق لهم لتلطيخ.
ملاحظة: يمكن تقصير الوقت الخبز 1 - 2 ساعة اعتمادا على كيفية طازجة قطع هي الشرائح. إذا كانت أقل من شهر منذ باجتزاء، فمن المستحسن أن تخبز بين عشية وضحاها. إذا كان قد مر أكثر من شهر، ثم 1-2 ساعة من الخبز تكفي لتوفير الوقت. إذا نفاد الوقت، يمكن دائما بدعم ليلة وضحاها أن تستخدم.
3. تحليل النسيجي والمناعي تلطيخ
لتحليل النسيجي وimmunofluorescence تلطيخ كما هو موضح سابقا 23،24، مع بعض التعديلات. لتعزيز البروتين الفلوري الأخضر (EGFP) المناعي:
- خبز الشرائح في الفرن 65 درجة مئوية لمدة 1 ساعة إلى تعطيل الذاتية النشاط الفوسفاتيز القلوية وdeparaffinize في وقت لاحق في زيلين.
- احتضان المقاطع في حمام من 3٪ بيروكسيد الهيدروجين في الميثانول لمنع مستخلصات الأنسجة المحلية؛ ثم ترطيب قبل الحضانة في سلسلة خفض حمام الكحول (100٪، 95٪، 70٪)، يليه استرجاع مستضد في حل العازلة سيترات (10 ملي سيترات الصوديوم، 0.05٪ توين-20، ودرجة الحموضة 6.0) في 125 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة باستخدام غرفة decloaking.
- رسم دائرة حول أقسام الأنسجة باستخدام العلامات القلم الذي يوفر حاجز مسعور واحتضان المقاطع مع عازلة تمنع (2.5٪ البقري ألبومين المصل [BSA] في TBS-توين) لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية، وبعد ذلك مع الأجسام المضادة الأولية ضد EGFP (تخفيف 1 : 500) في 4 درجات مئوية خلال الليل في غرفة ترطيب حين تهز بلطف.
- غسل أقسام واحتضان مع الأجسام المضادة الثانوية فلوري الموسومة في تركيز مناسب لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
- غسل الشرائح بعد العلاج بالاجسام المضادة وصمة عار نوى الثانوية مع هويشت وجبل مع وسائل الإعلام في تصاعد مستمر.
- لKlf5 / EGFP / كي 67 شارك في تلطيخ، والشرائح عملية كما هو موضح في الخطوات 3،1-3،3 وأداء Klf5 تلطيخ التي يحتضنها مع Klf5 الأجسام المضادة (التخفيف 1: 150) بين عشية وضحاها.
- تطبيق أرنب ا ف ب كشف البوليمر إلى شرائح حسب البروتوكول.
- كشف Klf4 تلطيخ باستخدام تلطيخ المناعى مولد اللون حسب بروتوكول الشركة الصانعة.
- أداء شطف الأجسام المضادة باستخدام بروتوكول سبق وصفها 25. احتضان الشرائح عند 50 درجة مئوية في جليكاين-SDS (درجة الحموضة 2.0) حل مع الانفعالات لمدة 1 ساعة.
- غسل الشرائح جيدا بالماء المقطر واحتضان مع عازلة تمنع (2.5٪ BSA في TBS-توين) لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
- إضافة كي-67 (التخفيف 1: 500) وEGFP (تخفيف 01:500) الأجسام المضادة في وقت واحد، واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
- أداء الكشف الفلوري مع الأجسام المضادة الثانوية المناسبة قبل تلطيخ مع هويشت (لا تظهر البيانات) وجبل مع تصاعد المتوسطة.
- مراقبة التشكل النسيجي للأنسجة على تلطيخ أقسام 5 ميكرومتر مع الهيماتوكسيلين ويوزين (H & E) 26. للصور الفلورسنت، واستخدام موجات انبعاث 535، 646، و 700 لتصور EGFP، Klf5، وكي-67 تلطيخ، على التوالي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تقنية المتداول السويسرية في تركيبة مع تلطيخ المناعى يتيح المجال لتحليل شامل من الأنسجة المعوية صغيرة أو كبيرة. على سبيل المثال من H & E تلطيخ من الأمعاء الغليظة من C57BL / 6 الماوس (الشكل 1) هو مثال على جدوى وفعالية هذه التقنية. كما هو مبين في الشكل 1، والصورة هي قادرة على التقاط جميع أجزاء من القولون: الداني، والمتوسطة، والبعيدة. وهكذا، فإنه يسمح لتقييم النسيجي شامل. المتداول السويسري والقدرة على التقاط الصور على طول الأنسجة المعوية صغيرة أو كبيرة هي مفيدة للغاية للتعبير الجين غير متجانسة وتلطيخ علامة أو استجابة مختلفة من الأنسجة المعوية على الإهانة.
مثال على ذلك هو نمط تلطيخ EGFP في الفئران Lgr5-EGFP / CREER T2. في هذا النموذج من الفئران، هو الدافع وراء التعبير عن EGFP من قبلالمروج Lgr5، التي تنشط فقط في الخبايا المعوية بنشاط تكاثر. بالإضافة إلى ذلك، يتميز هذا النموذج الماوس عن طريق منخفضة (حوالي 5-10٪) انتفاذ التعبير التحوير. كما هو مبين في الشكل 2، نمط التعبير EGFP في الأنسجة المعوية هو متغير. وبالتالي، فإن القدرة على التقاط عرض كبير من الأنسجة تساعد على تحديد المنطقة ذات الاهتمام.
تقنية الموضحة هنا هي قوية خصوصا مع تطبيق تلطيخ multifluorophore. هنا، وتبين لنا مثال trifluorophore تلطيخ من الأنسجة المعوية التي أعدت باستخدام تقنية السويسرية لفة. وكان الهدف الرئيسي من هذه الدراسة إلى التعرف على دور Klf5 في صيانة الخلايا الجذعية المعوية معربا عن Lgr5 علامة. ولذلك، فإننا حذف Klf5 من الخلايا الجذعية المعوية Lgr5 إيجابية في الفئران Lgr5-EGFP / CREER T2 وجمع الأنسجة المعوية يوم 14 بعد أول حقن تاموكسيفين. لتحليل immunohistological، أعدت الأنسجة وفقا لتم تنفيذ بروتوكول المعروضة في هذه المخطوطة، وتلطيخ لEGFP (Lgr5 علامة)، Klf5، وكي-67. في السيطرة على الفئران، كما تدل Lgr5-EGFP / CREER T2، على حد سواء-EGFP الإيجابي (ملحوظ مع الأسهم الزرقاء) والأقبية-EGFP سلبي (ملحوظ مع السهام البيضاء) عرضت شارك في تلطيخ لKlf5 وكي-67 عند نقطتين الوقت فحص ، كما هو مبين في الشكل 3D. في المقابل، في Lgr5-EGFP / CREER T2 / Klf5 فلوريدا / فلوريدا الأنسجة المعوية صغيرة، Klf5 / كي 67 شارك في تلطيخ كان في عداد المفقودين من الخلايا الجذعية CBC-EGFP الإيجابي (تميزت السهام الزرقاء) ولكن موجودة في EGFP سلبية أقبية المجاورة الخبايا الخضراء (تميزت السهام البيضاء)، كما هو مبين في الشكل 3H. هذا مثال ممتاز على أن تقنيات إعداد الأنسجة المقدمة هنا لا تؤثر سلبا على نوعية تلطيخ.
-page = "1"> 
الشكل 1. H & E تلطيخ من الأمعاء الغليظة من C57B L / 6 الماوس. أظهرت هو صورة مركبة من طول كل من الأمعاء الغليظة. الجزء بين السهم الأسود والخط الأسود يمثل الجزء القريب، بين خطوط سوداء وبرتقالية تمثل الوسط، وبين الخط البرتقالي والسهم البرتقالي علامات على الجزء الأعلى من الأمعاء الغليظة. مقياس شريط = 1000 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. المناعي تلطيخ من الأمعاء الدقيقة لLgr5-EGFP / CREER T2 ماوس. صورة مركبة من البريدGFP (الخلايا الظهارية إيجابية Lgr5 التوسيم) تلطيخ أقسام الأمعاء صغيرة من الماوس Lgr5-EGFP / CREER T2. مثال على تلطيخ المناعي غير متجانسة من البروتين علامة (EGFP) التي تصف الخلايا الظهارية Lgr5-صالحهم بشكل ايجابي في خبايا الماوس Lgr5-EGFP / CREER T2. وتصور النوى مع هويشت. السهام البيضاء علامة أقبية إيجابية للتعبير EGFP. مقياس شريط = 500 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. Klf5 الحذف في Lgr5-EGFP / CREER T2 / Klf5 فلوريدا / فلوريدا الفئران استمرت على المدى الطويل في الأقبية Lgr5-EGFP إيجابية. T2 وLgr5-EGFP / CREER T2 / Klf5 فلوريدا / فلوريدا الفئران في يوم 14 يوم بعد أول حقن تاموكسيفين، على التوالي. لوحات م هي ممثل من تلطيخ من الأنسجة التي تم جمعها من السيطرة على الفئران Lgr5-EGFP / CREER T2، في حين أن لوحات EH تظهر تلطيخ ممثل Lgr5-EGFP / CREER T2 / Klf5 فلوريدا / فلوريدا الفئران. لوحات A و E عرض Klf5 مناعي تلطيخ باللون الأحمر. لوحات B و F تظهر تلطيخ EGFP باللون الأخضر. لوحات C و G المعرض كي-67 تلطيخ باللون الأصفر. والألواح D و H المعرض دمج الصور من Klf5، EGFP وكي-67 البقع. تشير الأسهم الزرقاء إلى أقبية الخضراء. وتشير السهام البيضاء إلى أقبية nongreen في الصور المدمجة. Lgr5-EGFP / CREER T2 / Klf5 فلوريدا / ووأظهرت الفئران ل خسارة على المدى الطويل Klf5 فقط في الخلايا CBC-وصفت EGFP 14. شريط النطاق = 50 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تقنية المتداول السويسري هو وسيلة قوية لإعداد الأنسجة المعوية لتقييم النسيجي والصرفي على نطاق واسع. وعلى النقيض من تقنية السويسري المتداول سبق وصفها، والتي وضعت أصلا لإعداد أقسام المجمدة 18،19، الإجراء المقدمة هنا يسمح إعداد الأنسجة المعوية الفوري وتثبيت لتثبيت الفورمالين وتضمينها البارافين (FFPE). مقارنة مع الأنسجة المجمدة، FFPE الأنسجة لديها أطول مدة الصلاحية وهو النوع المفضل من الأنسجة للتحليل النسيجي بسبب سلامة الأنسجة أفضل. الأجزاء الهامة من بروتوكول السويسرية المتداول تنطوي على مرونة الأنسجة المتداول والحفاظ على سلامة السويسري لفة وجودة النسيج لpostfixation تلطيخ. تقنية السويسري لفة قياسية لFFPE من أنسجة الأمعاء عادة شاقة وتستغرق وقتا طويلا (2 أيام) 18،19. بالإضافة إلى ذلك، وهذه الطريقة القياسية عادة ينتج الأنسجة المعوية التي هي صelatively قاسية وليس من السهل أن تشكل في لفة السويسرية. وذلك لأن الحضانة بين عشية وضحاها من الأنسجة المعوية تشريح في 10٪ مخزنة الفورمالين مطلوب قبل المتداول الأنسجة. وقد وضعت التعديلات الأخرى لهذه التقنية لأغراض FFPE أيضا، ولكن لديهم مشكلة كبيرة في اتجاه الأنسجة المعوية لانبسط و / أو مركز لفة لتكون مشوهة. وذلك لأن الأنسجة المستخدمة في هذه التقنيات هي الأنسجة غير المثبتة جديدة، وهو زلق من المخاط التي تنتجها الأمعاء. التقنية الجديدة المعدلة المعروضة هنا يتغلب على هذه المشاكل باستخدام صيغة معدلة من تثبيتي بوان. يتكون تثبيتي الأصلي بوان من خليط من حامض الخليك، والإيثانول، حمض البكريك وامتصاص العرق (أو الفورمالين). أهم المكونات الخطرة اثنين، حامض البكريك وامتصاص العرق (أو الفورمالين)، وقد تم استبعاد للسماح باستخدام أكثر أمانا من تثبيتي مع مزيج حمض / الايثانول الخليك. يعرض حمض البكريك لخطر الانفجار، وparaformaldehyde (أو الفورمالين) يشكل خطرا السرطان. أهمية استخدام مثبت بوان تعديل هو أنه (1) هو أقل خطورة بالمقارنة مع الصيغة الأصلية، (2) هي سهلة التحضير مع الكواشف nonexpensive نسبيا التي تتوفر بسهولة في معظم المختبرات، و (3) يسمح للسريعة، لحظة تقريبا، وتثبيت الأنسجة عندما تستخدم لغسل. إلى المعرفة، وليس هناك أي قيود معروفة لاستخدام هذه التقنية المعدلة. بالإضافة إلى ذلك، تثبيت سريع مع هذا الخليط يقلل كثيرا من الانزلاق من الأنسجة المعوية، مما يسمح أسرع بكثير وأسهل المتداول الأنسجة. هذا مثبت يسمح أيضا للحفاظ ممتاز للسلامة الأنسجة والخلايا للتحليل النسيجي والمناعية. وهكذا، في مقارنة مع غيرها من أساليب إعداد الأنسجة المعوية، وهذه التقنية المحسنة يتغلب العديد من القضايا التقنية والمنح تتعزز بشكل كبير سرعة وسهولة الاستخدام.
أيضا، وهذا مثبت تعديل مفيد للاستخدام مع الآخر سميكالأنسجة التي تتطلب تثبيت سريع. ونظرا للطبيعة حمض الخليك والإيثانول، التي لديها القدرة على اختراق سريع من الأنسجة السميكة بينما في نفس الوقت تمر التثبيت. وقد استخدمنا بنجاح لإصلاح بسرعة الأنسجة السميكة مثل الكبد والطحال والكلى. على سبيل المثال، حققت تثبيت من الكبد كله الماوس الكبار باستخدام مثبت بوان تعديل عادة في غضون 15-20 دقيقة. هذا يمكن الحكم بسهولة عن طريق قطع شريحة في الكبد ومراقبة ما إذا كانت المناطق العميقة من الكبد قد تغير لون من الدم الحمراء إلى اللون الرمادي. التغير في لون يدل على التثبيت. ثم تبعتها هذا التثبيت من قبل يشابك باستخدام الفورمالين مخزنة عن 24-48 ساعة دون خوف من تغير التركيبة الخلوية / الأنسجة، كما يتم إصلاح الأنسجة بالفعل في هذه المرحلة.
وعلى سبيل المقارنة، فإن استخدام الطريقة التقليدية تثبيت مخزنة-الفورمالين وحدها على الكبد كله الماوس الكبار يحتاج 24 - 48 ساعة لتحقيق fixati الأنسجة العميقعلى، مع خطر تكوين الخلايا تغير من الأنسجة العميقة. وطرق التثبيت سريعة من الأنسجة السميكة لديه ميزة متفوقة من الحد إلى الحد الأدنى من التغيير من المكونات الخلوية في استجابة لظروف عصيبة، مثل نقص الأكسجة، بعد إزالة الجهاز / الأنسجة من الجسم. ونحن نتوقع أن تثبيتي تعديل يمكن أن تستخدم في نضح الحيوانية وسيلة أسرع من تحديد سميكة النسيج / الأجهزة هو المطلوب. وهكذا، في الختام، هذه الطريقة وتثبيتي تعديل توفر مزايا متعددة على الطرق التقليدية المستخدمة في حصاد الأنسجة المعوية وتثبيت وتثبيتي تعديل يمكن أن تستخدم لإصلاح بسرعة الأنسجة السميكة / غيرها من الأجهزة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stainless Steel Dissecting Kits | VWR | 25640-002 | |
| Decloaking Chamber | Biocare Medical | DC2012 | |
| Syringe 10 ml | VWR | 89215-218 | |
| Swingsette Tissue embedding/processing cassette with lid | Simport | M515 | |
| Superfrost Plus Slides [size: 25 x 75 x 1 mm] | VWR | 48311-703 | |
| Manual Slide Staining Set | Tissue-Tek/Sakura | 4451 | |
| Staining Dish Green | Tissue-Tek/Sakura | 4456 | |
| Staining Dish White | Tissue-Tek/Sakura | 4457 | |
| 24-Slide Slide Holder with Detachable Handle | Tissue-Tek/Sakura | 4465 | |
| Oven | Thermo Scientific | 6243 | for baking slides at 65 degree |
| Dissection microscope | Zeiss | Stemi 2000C | |
| Fluorescence Microscope | Nikon | Eclipse 90i | Bright and fluoerescent light, with objectives: 10X, 20X |
| PAP Pen Super-Liquid Blocker Mini | Fisher Scientific | DAI-PAP-S-M | |
| Ethanol 200 proof | AAPR | 111000200 | |
| Methanol | VWR | BDH1135-4LP | |
| Glacial acetic acid | AAPR | 281000ACS | |
| Xylene | Fisher Scientific | X5P-1GAL | |
| Hydrogen peroxide 25% solution in water | ACROS | 202465000 | |
| 10% bufered formalin | Fisher Scientific | 22-026-213 | |
| Bovine serum fraction V, heat shock | Roche | 3116956001 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P7949 | |
| Sodium citrate | Fisher Scientific | S279 | |
| Gavage needle | VWR | 20068-624 | |
| Rabbit anti Klf5 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-22797 | Dilution 1:150 |
| Chicken anti EGFP antibody | Millipore | AB16901 | Dilution 1:500 |
| Rabbit anti Ki67 antibody | Biocare Medical | CRM325B | Dilution 1:500 |
| Mach3 rabbit AP polymer detection kit | Biocare Medical | M3R533L | |
| Warp red chromogen kit | Biocare Medical | WR806 H | |
| Lgr5-EGFP/CreERT2 mice | Jackson labs | 008875 | |
| Automated processor | Leica | Leica TP1020 |
References
- van der Flier, L. G., Clevers, H. Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium. Annu Rev Physiol. 71, 241-260 (2009).
- Bjerknes, M., Cheng, H. Methods for the isolation of intact epithelium from the mouse intestine. Anat Rec. 199, 565-574 (1981).
- Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449 (7165), 1003-1007 (2007).
- van der Flier, L. G., Haegebarth, A., Stange, D. E., van de Wetering, M., Clevers, H. OLFM4 is a robust marker for stem cells in human intestine and marks a subset of colorectal cancer cells. Gastroenterology. 137 (1), 15-17 (2009).
- van der Flier, L. G., et al. Transcription factor achaete scute-like 2 controls intestinal stem cell fate. Cell. 136 (5), 903-912 (2009).
- Sangiorgi, E., Capecchi, M. R. Bmi1 is expressed in vivo in intestinal stem cells. Nat Genet. 40 (7), 915-920 (2008).
- Montgomery, R. K., et al. Mouse telomerase reverse transcriptase (mTert) expression marks slowly cycling intestinal stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (1), 179-184 (2011).
- Takeda, N., et al. Interconversion between intestinal stem cell populations in distinct niches. Science. 334 (6061), 1420-1424 (2011).
- May, R., et al. Identification of a novel putative gastrointestinal stem cell and adenoma stem cell marker, doublecortin and CaM kinase-like-1, following radiation injury and in adenomatous polyposis coli/multiple intestinal neoplasia mice. Stem Cells. 26 (3), 630-637 (2008).
- Powell, A. E., et al. The pan-ErbB negative regulator Lrig1 is an intestinal stem cell marker that functions as a tumor suppressor. Cell. 149 (1), 146-158 (2012).
- Pearson, R., Fleetwood, J., Eaton, S., Crossley, M., Bao, S. Kruppel-like transcription factors: a functional family. Int J Biochem Cell Biol. 40 (10), 1996-2001 (2008).
- McConnell, B. B., Yang, V. W. Mammalian Kruppel-like factors in health and diseases. Physiol Rev. 90 (4), 1337-1381 (2010).
- McConnell, B. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. The diverse functions of Kruppel-like factors 4 and 5 in epithelial biology and pathobiology. Bioessays. 29 (6), 549-557 (2007).
- Nandan, M. O., Ghaleb, A. M., Bialkowska, A. B., Yang, V. W. Kruppel-like factor 5 is essential for proliferation and survival of mouse intestinal epithelial stem cells. Stem Cell Res. 14 (1), 10-19 (2015).
- Gelberg, H. B. Comparative anatomy, physiology, and mechanisms of disease production of the esophagus, stomach, and small intestine. Toxicol Pathol. 42 (1), 54-66 (2014).
- De Robertis, M., et al. The AOM/DSS murine model for the study of colon carcinogenesis: From pathways to diagnosis and therapy studies. J Carcinog. 10 (9), (2011).
- Magnus, H. A. Observations on the presence of intestinal epithelium in the gastric mucosa. The Journal of Pathology and Bacteriology. 44 (2), 389-398 (1937).
- Moolenbeek, C., Ruitenberg, E. J. The "Swiss roll": a simple technique for histological studies of the rodent intestine. Lab Anim. 15 (1), 57-59 (1981).
- Park, C. M., Reid, P. E., Walker, D. C., MacPherson, B. R. A simple, practical 'swiss roll' method of preparing tissues for paraffin or methacrylate embedding. J Microsc. 145, Pt 1 115-120 (1987).
- Summersgill, B., Clark, J., Shipley, J. Fluorescence and chromogenic in situ hybridization to detect genetic aberrations in formalin-fixed paraffin embedded material, including tissue microarrays. Nat Protoc. 3 (2), 220-234 (2008).
- Takeda, N., et al. Cardiac fibroblasts are essential for the adaptive response of the murine heart to pressure overload. J Clin Invest. 120 (1), 254-265 (2010).
- el Marjou, F., et al. Tissue-specific and inducible Cre-mediated recombination in the gut epithelium. Genesis. 39 (3), 186-193 (2004).
- McConnell, B. B., et al. Kruppel-like factor 5 is important for maintenance of crypt architecture and barrier function in mouse intestine. Gastroenterology. 141 (4), 1302-1313 (2011).
- Nandan, M. O., et al. Kruppel-like factor 5 is a crucial mediator of intestinal tumorigenesis in mice harboring combined ApcMin and KRASV12 mutations. Mol Cancer. 9 (63), (2010).
- Pirici, D., et al. Antibody elution method for multiple immunohistochemistry on primary antibodies raised in the same species and of the same subtype. J Histochem Cytochem. 57 (6), 567-575 (2009).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. CSH Protoc. 2008, pdb prot4986 (2008).
