Summary
Die genaue Identifizierung und Lokalisierung von Epithelzellen entlang der Darmschleimhaut sind wesentlich unterschiedlichen Zelllinien zu definieren. Die richtige Darstellung von Darmgewebe ist von entscheidender Bedeutung für die Identifizierung von Proteinexpressionsmuster mit maximaler Auflösung. Diese Studie hat zum Ziel, die optimalen Verfahren und Bedingungen für die Verarbeitung der Maus Darmgewebe zu beschreiben.
Introduction
Die Säuger Darmepithel umfasst eine einzelne Schicht aus säulen Zellen. Im Dünndarm werden die proliferative Zellen zu den Krypten beschränkt, während die differenzierten Zellen villus Region besetzen. Da es jedoch keine Zotten im Dickdarm sind, werden die proliferative Zellen auf den Boden der Krypten lokalisiert und differenzierten Zellen besetzen den oberen Bereich der Krypten. Darmepithel erfährt rasche Nachfüllung (ca. 3 - 5 Tage), die durch kontinuierliche Trennung der proliferativen Zellen in den Krypten angetrieben wird. Die proliferativen Zellen der Krypten sind keine homogene Bevölkerung und werden weiter in Stammzellen und Transit-Verstärkung (TA) Zellen 1 unterteilt. Die Stammzellen liegen an der Unterseite der Krypta, innerhalb der ersten 4 bis 5 Zellen von ganz unten 2. Das aktuelle Modell unterstützt die Existenz von zwei Arten von Stammzellen: Krypta Basis säulen (CBC) Stammzellen und Reserve ruhenden Stammzellen. Die CBC stem Zellen aktiv vermehren und werden von Leucin-rich repeat enthaltenden G-Protein - gekoppelten Rezeptor 5 (Lgr5) 3, Olfactomedin 4 (OLFM4) 4 und Achaete scute-like 2 (Ascl2) 5 markiert. Auf der anderen Seite, sind Reserve ruhenden Stammzellen von B - Zell-spezifischen Moloney - Maus - Leukämie - Virus - Integrationsstelle 1 (Bmi1) 6, Maus Telomerase Reverse Transkriptase (mTERT) 7 gekennzeichnet, HOP Homeobox (Hopx) 8, Double-Like und CAM - Kinase -Wie 1 (DCLK1) 9, und leucinreichen Repeats und Immunoglobulin-ähnlichen Domänen 1 (Lrig1) 10. Die aktiv vermehrenden Stammzellen führen zu TA-Zellen dann eine weitere Differenzierung in absorptive Zellen durchlaufen (Enterozyten) und sekretorischen Zellen (enteroendokrinen, Becher, Paneth und Tuft-Zellen). Kontinuierliche Zellteilung in der proliferativen Zone führt zu einer Aufwärtsbewegung von Epithelzellen entlang der Krypta-villus Achse, bis sie oben auf der Zotten zu erreichen, wo sie unterziehen Apoptose und sindabgestoßen von der Oberfläche des Epithels ab. Die verschiedenen Arten von intestinalen Epithelzellen werden durch die Expression von bestimmten Proteinen markiert (zB intestinalen Becherzellen können durch Färbung mit Antikörper gegen MUC2 und Paneth - Zellen mit Antikörper gegen Lysozym zu erkennen). Wir untersuchen die Rolle der Krüppel-ähnlichen Faktoren (KLFs) in der Homöostase und Pathobiologie des Darmepithels 11-13. Die hier vorgestellten Ergebnisse , die Durchführbarkeit eines modifizierten Swiss-Walztechnik unterstützen , werden bei früheren Untersuchungen der Rolle von Krüppel-like factor 5 (KLF5) bei der Aufrechterhaltung der aktiv proliferierenden intestinalen epithelialen Stammzellen 14 basiert. KLF5 ist ein Faktor Zinkfinger - Transkriptions , die 12 in dem aktiven Darm Schaft und TA - Zellen stark exprimiert wird. Frühere Studien zeigten, dass KLF5 wird coexprimiert mit Ki-67, einem bekannten proliferative Marker in den Darmkrypten.
Die Magen-Darm-tr Akt ist kein strukturell oder funktionell homogenen Gewebe. Der Dünndarm wird in Duodenum unterteilt, Jejunum und Ileum und den Dickdarm in Caecum und Colon, wobei letztere weiter in proximaler unterteilt, mittleren und distalen Abschnitten. Jeder dieser Abschnitte hat einzigartige histologische Eigenschaften und spielt verschiedene Rollen 15. Als solche können die Auswirkungen von Beleidigungen und der Grad der Reaktion des Darmepithels kann 16 auf dem Bereich des untersuchten Gewebes abhängt. Darüber hinaus zeigen verschiedene Mausstämme Vielfalt der Antwort auf der histologischen Ebene basierend auf der Art der Insult in den Studien verwendet 16. Somit ist Gewebepräparation geziemt notwendig, geeignete histologische und molekulare Analyse der Darmgewebe zu ermöglichen. Als solche ermittelt die Swiss-Rolle-Technik gewährt Analyse der gesamten Länge des Darmepithel zu einer Zeit und damit gut informierte Schlussfolgerungen über umfassende Informationen.
e_content "> Die Swiss-Roll - Technik wurde zuerst von Magnus 17, erwähnt und im Detail von Moolenbeck und Ruitenberg und Park et al. , wie ein Verfahren zur Herstellung von Geweben und histologische Durchführung des Nagetiers Darm analysiert 18,19 dar. Das Protokoll in dieser Druckschrift abgegrenzt stellt eine verbesserte Version der ursprünglichen Methode, die für eine rechtzeitige und zuverlässige Gewebevorbereitung für diagnostische Zwecke ermöglicht. mit dieser modifizierte Technik für die effiziente Sammlung und Vorbereitung des Darmepithels für allgemein verwendete Techniken, wie der Immunhistochemie, Immunfluoreszenz, als auch wie in situ - Hybridisierung (fluoreszierend und chromogenen 20). Ferner verwendet das modifizierte Gewebeprobe Herstellungsverfahren leicht verfügbar und relativ preiswerten Reagenzien während eines Verfahrens zur schnellen Gewebefixierung bietet und ermöglicht eine Rückgewinnung von Protein, DNA und RNA für zusätzliche Auswertung. Genommen zusammen, this-Technik eignet sich hervorragend für eine umfassende Beurteilung der histopathologischen, pathologische und molekulare Merkmale des Darmepithel.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Mäuse
- Alle Studien mit Mäusen wurden von der Stony Brook University Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) zugelassen. Die Mäuse wurden auf einem 00.12 h Hell-Dunkel-Zyklus gehalten.
- Kommerziell C57BL / 6-Mäusen erhalten. Erhalten C57BL / 6 - Mäuse tragen KLF5 Allele flankiert von loxP - Stellen (KLF5 f l / f l). Diese Mäuse wurden zuvor 21 beschrieben und gnädig von Dr. Ryozo Nagai zur Verfügung gestellt.
- Bestellen Sie C57BL / 6-Mäuse, die induzierbare Cre-Rekombinase-Gen unter Regulation des Lgr5-Promotor (Lgr5-EGFP / CreERT2 Mäuse).
- Lgr5-EGFP / Creer T2 / KLF5 f l / f l Mäusen kreuzen KLF5 fl / f l Mäuse mit Lgr5-EGFP / Creer T2 Mäuse und dann Rückkreuzung die Nachkommenschaft KLF5 fl / f l zu etablieren Mäusen.
- Treat Mäuse mit Tamoxifen nach dem Protokoll zuvor beschriebenen 22. Injizieren 8 Wochen alten Versuchs- und Kontrollmäusen intraperitoneal (IP) mit 1 mg Tamoxifen (10 mg / ml) in sterile Maisöl gelöst, für 5 aufeinanderfolgende Tage.
- Am Tag 14 nach der ersten Injektion Tamoxifen, opfern Mäuse CO 2 Erstickung , indem es sie in einer Kammer platziert , um CO 2 -Gas Quelle verbunden. Erlauben es dem Gas in die Kammer zu strömen, bis die Mäuse bewusstlos und jede Bewegung aufhört sind. Euthanasie durchführen Zervikaldislokation zu gewährleisten.
2. Gewebepräparation und Schweizer Rollen
- Mit Dissektion Pinzette und Schere, schnitt einen Einschnitt in der Haut der Bauchseite. Mit einer Pinzette, halten Sie die Haut an der Einschnitt und ziehen Sie aus dem Bauch Muskelgewebe sanft entfernt. Verwenden Sie eine Schere aus der Bauchhaut und setzen Sie die Bauchmuskeln zu schneiden.
- Halten und ziehen Sie den peritoneum mit der Zange. Achten Sie darauf, nicht zu halten und Ziehen an den Darm. machen Sie vorsichtig einen Einschnitt in der Bauchgewebe und weiterhin die Haut wegschneiden, um die Bauchmuskeln aus. machen Sie vorsichtig einen Einschnitt in die Bauchmuskeln und sie weiterhin Wegschneiden zu den Darm aus.
- Identifizieren Sie den Doppelpunkt und Spuren an das distale Ende, wo es das Rektum / Anus verbindet. Mit einer Schere, schneiden Sie so nah an der Analöffnung wie möglich.
- Identifizieren Sie den Magen und verfolgen, wo es mit dem Dünndarm verbindet. Mit einer Schere, freigeschnitten den Darm etwa 1 cm vom Magen. Übertragen die gesamte Länge des befreit Dünndarm und Dickdarm in eine saubere Petrischale mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
- Mit einer Hand oder einer Pinzette, um das distale Ende des Dickdarms zu halten und mit der anderen Hand sanft über die gesamte Länge des Dickdarms von jedem mesenteric Binde- und / oder Fettgewebe entwirren.
- Identifizieren Sie den Blinddarm(Kleine Beutel zwischen Dünn- und Dickdarm) und schneiden, wo der Blinddarm und der Doppelpunkt verbinden (das proximale Ende des Dickdarms) um den Darm zu befreien.
- Mit einer Hand oder einer Pinzette, halten Sie den Dünndarm und mit der anderen Hand sanft über die gesamte Länge des Dünndarms von jedem mesenteric Binde- und / oder Fettgewebe entwirren. Schneiden Sie den Blinddarm entfernt und verwerfen, wenn es keine Notwendigkeit dafür.
Hinweis: Der Prozess hier beendet werden kann , die seziert Darm in modifizierter Bouin-Fixiermittel durch Inkubation (50% Ethanol / 5% Essigsäure in dH 2 O) über Nacht und fahren am nächsten Tag den Vorgang. - ein Segment des Darms (Dünndarm oder Kolon) Handhabung, füllen einen 10-ml-Spritze mit modifizierten Bouin-Fixiermittel und heften sich an eine Sondennadel. Führen Sie die Nadel etwa einem halben Zentimeter in der vorderen Öffnung des Darmsegments.
- Halten Sie die Sondennadel innerhalb des Darm-Segment durch festen Druck mit einem Instrument Anwendungauf die intestinale Segment. Mit der anderen Hand die Spritze gelten sanfte, aber gleichmäßigen Druck, den Inhalt des Darmsegments zu spülen modifizierten Bouin-Fixiermittel verwendet wird. Dieser Schritt ermöglicht die gleichzeitige Reinigung des Darmsegments und sofortige Fixierung. Verwenden Sie eine Petrischale, die Flow-Through-Abfall zu sammeln. Die Fixierung kann durch den Darm Farbe drehen undurchsichtig beobachtet werden.
Hinweis: Achten Sie darauf, nicht zu viel Druck auszuüben, beim Spülen oder der Darm-Segment könnte aufplatzen. - Mit einer Schere, schneiden Sie das Darmsegment öffnen längs entlang der mesenterischen Linie. Halten Sie es mit einer Pinzette und spülen Sie ihn kurz in einer Petrischale mit PBS.
- Schneiden Sie den Dünndarm in drei gleich große Segmente: proximalen, mittleren und distalen. Das proximale Segment ist das man sofort den Magen folgenden, und das distale Segment ist derjenige unmittelbar vor dem Doppelpunkt. Das proximale Segment entspricht dem Zwölffingerdarm, den mittleren bis Jejunum und dem distaldas Ileum.
- Für jedes Segment das proximale und das distale Ende markieren. Das proximale Ende ist derjenige, der ursprünglich in Richtung auf den Magen zeigt, und das distale Richtung Kolon gerichtet.
- Verwenden Sie die oben auf einer Petrischale, die gereinigt und geöffnet Darm-Segment zu platzieren. Legen Sie das Darmsegment mit der luminalen Seite nach oben zeigt.
- Für den Doppelpunkt zu identifizieren der luminalen Seite von den Farbvarietät / Grate über ihre Breite läuft und an dem proximalen Ende vorhanden sind. Die mittleren und distalen Bereichen haben einige Farbvarietät, die in Längsrichtung verlaufen. Für den Dünndarm, identifizieren die luminale Seite durch die grobe erscheinende Oberfläche, die den Zotten markiert.
Hinweis: Für den Dünndarm gibt es keine externe makroskopische anatomische Abgrenzung der proximalen, mittleren und distalen Regionen. Jedoch können diese Bereiche in den Abschnitten unter dem Mikroskop identifiziert werden kann. Die Zotten sind am längsten im proximalen Bereich und werden nach und nach distal kürzer, wo sie sinddie kürzeste Länge. Mikroskopisch sind die Kolonkrypten kürzesten im proximalen Bereich, der auch durch das Vorhandensein von Graten identifiziert werden kann. Die Kolonkrypten sind höchsten in den Mittelteil und kürzer im distalen Bereich dennoch noch größer als im proximalen Bereich.
- Für den Doppelpunkt zu identifizieren der luminalen Seite von den Farbvarietät / Grate über ihre Breite läuft und an dem proximalen Ende vorhanden sind. Die mittleren und distalen Bereichen haben einige Farbvarietät, die in Längsrichtung verlaufen. Für den Dünndarm, identifizieren die luminale Seite durch die grobe erscheinende Oberfläche, die den Zotten markiert.
- Fahren Sie mit dem Schweizer den Doppelpunkt rollen:
- Halten Sie den Doppelpunkt flach offen und ziehen Sie sie mit einer Pinzette von seinem proximalen Ende in Richtung auf den Rand der Petrischale.
- Halten Sie luminalen Seite nach oben und halten Sie das proximale Ende mit der Zange mit einer Hand und mit der anderen Hand halten einen Zahnstocher.
- Wickeln Sie den Rand des proximalen Ende um den Zahnstocher mit der Pinzette und leicht kneifen die verpackte Kante gegen den Zahnstocher es an Ort und Stelle zu halten.
- Sanft und langsam beginnen den Zahnstocher mit den Fingern rollen den Darm um den Zahnstocher zu rollen eine Schweizer Rolle zu bilden.
- Sobald die gesamte Kolon Länge aufgerollt wurde, wird eine Pinzette benutzen, um sorgfältig die c schiebenOlon Rouladen aus dem Zahnstocher und in ein Gewebe-Verarbeitung / Embedding Kassette. Legen Sie die Kassette in 10% gepuffertem Formalin über Nacht bei Raumtemperatur.
- Fahren Sie mit dem Schweizer in den Dünndarm rollen:
- ein Segment zu einem Zeitpunkt, Handhabung, halten das Segment flach offen mit luminalen Seite nach oben und ziehen Sie sie mit einer Pinzette von seinem proximalen Ende in Richtung auf den Rand der Petrischale.
- Fahren Sie mit dem Schweizer Roll wie für den Doppelpunkt beschrieben.
- Fahren Sie mit der Verarbeitung Formalin fixierten Geweben für Paraffineinbettung. Gehen Sie wie folgt vor:
HINWEIS: Verwenden Sie einen automatisierten Prozessor (siehe Materialien und Equipment für weitere Details).- Während Gewebe in der Kassette ist, spülen Sie Gewebe mit PBS bis Fixateur vollständig entfernt wird.
- Dehydratisieren Gewebe Ethanol in der folgenden Reihenfolge unter Verwendung von 50% Ethanol für 10 min, 70% Ethanol für 10 min, 80% Ethanol für 10 min, 95% Ethanol für 10 min, 100% Ethanol für 10 min, 100% Ethanol für 10 min , und 100% Ethanol für 10 min.
- Austausch ethanol mit Xylol in der folgenden Reihenfolge: 2: 1 Ethanol: Xylol für 10 bis 15 min, 1: 1 Ethanol: Xylol für 10 bis 15 min, 1: 2 Ethanol: Xylol für 10 bis 15 min, 100% Xylol 10 - 15 min, 100% Xylol für 10 - 15 min und 100% Xylol für 10 - 15 min. ACHTUNG: Xylen ist eine Gefahr für die Gesundheit, so dass der Arbeitsplatz sollte mit einer lokalen Absaugung mit einer richtigen Haube und der richtigen Schutzausrüstung ausgestattet werden sollte von Personal getragen werden.
- Exchange-Xylol mit Paraffin. Führen Sie die folgenden Schritte in einem Vakuumofen-Set für 54 bis 58 ° C: 2: 1 Xylol: Paraffin 30 min, 1: 1 Xylol: Paraffin 30 min, 1: 2 Xylol: Paraffin 30 min, 100% Paraffin 1 bis 2 Stunden und 100% Paraffin mit 1 - 2 Stunden oder über Nacht.
Hinweis: Lassen Sie sich nicht das Paraffin 60 ° C für längere Zeit nicht überschreiten, da dies die Paraffin Polymere zersetzen und es hart und spröde machen. - Einbetten in frischen neuen Paraffin und orientieren Gewebe als degezeugt, bevor das Paraffin erstarrt. Für die Schweizer Brötchen, Gewebe paraffinization folgen, ist es wichtig, jede Rolle auf seiner Seite während Paraffineinbettung neu zu positionieren. Dadurch wird sichergestellt, dass während des Schneidens wird, Abschnitte der gesamten Länge jeder Walze hergestellt werden.
- Zur Färbung, schneiden 5 um dicke Abschnitte Mikrotom. Sammeln Sie die Abschnitte über die geladene Objektträger und trocknen Sie sie (backen) in einem 65 ° C Ofen über Nacht; lassen auf Raumtemperatur abkühlen und sie anschließend zum Färben verwendet.
Anmerkung: Die Backzeit kann verkürzt werden auf 1 - 2 Stunden, je nachdem wie frisch geschnittenem Die Objektträger werden. Wenn weniger als einem Monat seit sectioning, dann ist es ratsam, über Nacht zu backen. Wenn es hat sich mehr als einen Monat, dann 1 bis 2 h Backen reicht aus, um Zeit zu sparen. Wenn die Zeit läuft, kann immer über Nacht Lage verwendet werden.
3. Die histologische Analyse und Immunfluoreszenzanfärbung
Führen Sie die histologische Analyse und immunofluFluoreszenz - Färbung beschrieben , wie zuvor 23,24, mit Modifikationen. Für eine verbesserte grün fluoreszierende Protein (EGFP) Immunofluoreszenz:
- Bake die Folien in einem 65 ° C Ofen für 1 h auf endogene alkalische Phosphatase-Aktivität inaktivieren und entparaffinieren anschließend in Xylol.
- Inkubieren Abschnitte in einem Bad von 3% Wasserstoffperoxid in Methanol endogene Peroxidasen Gewebe zu blockieren; durch Inkubation in einem abnehm Alkoholbad Serie (100%, 95%, 70%), gefolgt von Antigen-Retrieval in Citrat-Pufferlösung (10 mM Natriumcitrat, 0,05% Tween-20, pH 6,0) bei 125 ° C rehydriert dann für 10 min mit einer decloaking Kammer.
- Zeichnen Sie einen Kreis um Gewebeschnitte mit Stift Markierung, die hydrophobe Barriere bietet und inkubieren Abschnitte mit Blockierungspuffer (2,5% Rinderserumalbumin [BSA] in TBS-Tween) für 30 min bei 37 ° C und dann mit dem primären Antikörper gegen EGFP (Verdünnung 1 : über Nacht in einer befeuchteten Kammer bei) 4 ° C 500 unter leichtem Schütteln.
- Waschen Abschnitte und inkubiere mit fluoreszierendem-tagged sekundären Antikörper in der entsprechenden Konzentration für 30 min bei 37 ° C.
- Waschen Sie Dias nach der sekundären Antikörperbehandlung und Fleckenkerne mit Hoechst und montieren mit Montage Medien.
- Für KLF5 / EGFP / Ki-67 Co-Färbung, Prozess gleitet wie in den Schritten 3.1 beschrieben - durch Inkubation mit KLF5 Antikörper (Verdünnung 1: 150), 3.3 und führen KLF5 Färbung über Nacht.
- Bewerben Kaninchen AP Polymer Erkennung Dias laut Protokoll.
- Reveal Klf4 mit Chromogen immunhistochemischen Färbung Färbung gemäß Protokoll des Herstellers.
- Führen Antikörper Elution der zuvor beschriebenen Protokoll 25 verwendet wird . Inkubiere Objektträger bei 50 ° C in Glycin-SDS (pH 2,0) Lösung unter Rühren für 1 Stunde.
- Wasch gleitet gründlich mit destilliertem Wasser und Inkubieren Puffer (2,5% BSA in TBS-Tween) für 30 min bei 37 ° C mit Blockierung.
- In Ki-67 (Verdünnung 1: 500) und EGFP (Verdünnung 01.500) Antikörper gleichzeitig und inkubieren bei 37 ° C für 1 Stunde.
- Führen Fluoreszenzdetektion mit einem geeigneten sekundären Antikörper vor mit Hoechst-Färbung (Daten nicht gezeigt) und montieren mit Eindeckmediums.
- Beobachten histologische Morphologie der Gewebe auf Anfärben 5-um - Schnitte mit Hämatoxylin und Eosin (H & E) 26. Für Fluoreszenzbilder verwenden Emissionswellenlängen von 535, 646 und 700 EGFP, KLF5 sichtbar zu machen, und Ki-67-Färbung auf.
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Representative Results
Die Schweizer Walztechnik in Kombination mit immunhistochemischen Färbung ermöglicht eine umfassende Analyse von kleinen oder großen Darmgewebe. Das Beispiel von H & E - Färbung eines Dickdarms einer C57BL / 6 - Maus (Figur 1) ist eine Darstellung der Durchführbarkeit und die Wirksamkeit dieser Technik. Wie in 1 gezeigt, ist das Bild der Lage , alle Teile des Dickdarms zu erfassen: proximalen, mittleren und distalen. Somit ermöglicht es eine umfassende histologische Beurteilung. Die Schweizer Walz- und die Fähigkeit, die gesamte Länge des kleinen oder großen Darmgewebe zu erfassen ist äußerst hilfreich für heterogene Genexpression und Marker Färbung oder eine variable Reaktion des Darmgewebes zur Beleidigung.
Ein Beispiel ist das EGFP - Färbungsmuster in Lgr5-EGFP / Creer T2 Mäusen. In diesem Mausmodell die Expression von EGFP wird durch die angetriebeneLgr5 Promotor, der nur in den aktiv proliferierenden Darmkrypten aktiv ist. (- 10% in etwa 5) Penetranz der Transgen-Expression Zusätzlich wird dieses Mausmodell durch niedrige gekennzeichnet. Wie in 2 gezeigt, ist das EGFP - Expressionsmuster in dem Darmgewebe variabel. Folglich wird eine große Ansicht des Gewebes, die Fähigkeit, zu erfassen, hilft den interessierenden Bereich zu identifizieren.
Die hier beschriebene Technik ist mächtig vor allem mit der Anwendung der multifluorophore Färbung. Hier zeigen wir ein Beispiel für trifluorophore Färbung des Darmgewebes, das hergestellt wurde, die Swiss-Roll-Technik. Das Hauptziel dieser Studie war es, die Rolle der KLF5 bei der Aufrechterhaltung der Darm Stammzellen exprimiert Lgr5 Marker zu untersuchen. Deshalb löschten wir KLF5 aus den Lgr5-positiven Darmstammzellen in Lgr5-EGFP / Creer T2 Mäuse und Darmgewebe am Tag gesammelt14 nach der ersten Injektion Tamoxifen. Für immunhistologische Analyse wurden die Gewebe hergestellt nach dem Protokoll in diesem Manuskript präsentiert und Färbung für EGFP (Lgr5 Marker), KLF5 und Ki-67 durchgeführt wurde. In den Kontrollmäusen, bezeichnet als Lgr5-EGFP / Creer T2, beide EGFP-positive (mit blauen Pfeilen markiert) und EGFP-negativen Krypten (markiert mit weißen Pfeilen) zeigte Co-Färbung für KLF5 und Ki-67 bei beiden untersuchten Zeitpunkten wird , wie in 3D gezeigt. Im Gegensatz dazu werden in Lgr5-EGFP / Creer T2 / KLF5 fl / fl kleinen Darmgewebe, KLF5 / Ki-67 Co-Färbung fehlte von den EGFP-positiven CBC Stammzellen (gekennzeichnet durch blaue Pfeile) , aber in der EGFP-negativ Krypten die grünen Krypten angrenzenden (durch weiße Pfeile gekennzeichnet), wie in Abbildung 3H gezeigt. Dies ist ein hervorragendes Beispiel dafür, dass die Gewebepräparationstechniken präsentierten sich nicht negativ Färbungsqualität beeinflussen.
Abbildung 1. H & E - Färbung eines Dickdarms von einem C57B L / 6 - Maus. Dargestellt ist das zusammengesetzte Bild von der gesamten Länge des Dickdarms. Der Abschnitt zwischen dem schwarzen Pfeil und schwarze Linie markiert den proximalen Teil, zwischen den schwarzen und orangefarbenen Linien in der Mitte markiert, und zwischen der orange Linie und orange Pfeil markiert den distalen Teil des Dickdarms. Maßstabsbalken = 1000 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Immunfluoreszenzanfärbung eines Dünndarm eines Lgr5-EGFP / Creer T2 Maus. Composite - Bild von EGFP (Kennzeichnung Lgr5-positiven Epithelzellen) Färbung von Dünndarm Abschnitte eines Lgr5-EGFP / Creer T2 Maus. Beispiel für heterogene Immunfluoreszenzanfärbung von Protein - Marker (EGFP) , die Lgr5-postive Epithelzellen in den Krypten des Lgr5-EGFP / Creer T2 Maus - Etiketten. Nuclei mit Hoechst sichtbar gemacht. Weiße Pfeile markieren Krypten positiv für EGFP-Expression. Maßstabsbalken = 500 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. KLF5 Deletion in Lgr5-EGFP / Creer T2 / KLF5 fl / fl Mäuse Persists Long Term in Lgr5-EGFP-positive Krypten. T2 - Steuerung und Lgr5-EGFP / Creer T2 / KLF5 fl / fl Mäusen 14 Tage am Tag nach der ersten Injektion Tamoxifen auf. Panels AD sind Vertreter der Färbung von Gewebe gesammelt von Lgr5-EGFP / Creer T2 Kontrollmäuse, während Platten EH zeigen Färbung repräsentativ für Lgr5-EGFP / Creer T2 / KLF5 fl / fl Mäusen. Panels A und E Anzeige KLF5 Immunfluoreszenzanfärbung in rot; Platten B und F zeigen EGFP Färbung in grün; Platten C und G zeigen Ki-67 Färbung in gelb; und Platten D und H zeigen fusionierte Bilder von KLF5, EGFP und Ki-67 Flecken. Blaue Pfeile zeigen auf grün Krypten; weiße Pfeile zeigen auf nongreen Krypten in den fusionierten Bilder. Lgr5-EGFP / Creer T2 / KLF5 fl / fl Mäuse zeigten langfristigen Verlust von KLF5 nur in den EGFP-markierte CBC Zellen 14. Maßstabsbalken = 50 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Die Schweizer Walztechnik ist eine leistungsfähige Methode zur Darmgewebe zur histologischen und morphologischen Beurteilung in großem Maßstab vor. Im Gegensatz zu dem zuvor beschriebenen Swiss-Walztechnik, die ursprünglich zur Herstellung von Gefrierschnitten 18,19 entwickelt wurde, stellte das Verfahren hier ermöglicht die schnelle intestinalen Gewebepräparation und Fixierung für Formalin Fixierung und Paraffineinbettung (FFPE). Im Vergleich zu gefrorenem Gewebe, hat FFPE Gewebe wesentlich längere Haltbarkeit und ist die bevorzugte Art von Gewebe für die histologische Analyse wegen der besseren Gewebeintegrität. Kritische Teile des Swiss-rolling-Protokoll beinhalten Gewebe Flexibilität für das Walzen und die Aufrechterhaltung der Swiss-Rolle Integrität und Qualität des Gewebes für die Färbung Nachfixierung. Die Standard Swiss-Rolle Technik zur FFPE von Darmgewebe ist typischerweise arbeits- und zeitaufwendig (2 Tage) 18,19. Darüber hinaus in der Regel diese Standardmethode ergibt Gewebe Darm, die relatively steif und nicht leicht zu in eine Schweizer Rolle bilden. Dies liegt daran, über Nacht Inkubation des sezierten Darmgewebe in 10% gepuffertem Formalin vor Gewebewalzen erforderlich ist. Andere Modifikationen der Technik für die Zwecke FFPE auch entwickelt worden, aber sie haben ein großes Problem der Tendenz von Darmgewebe zu entrollen und / oder für die Mitte der Walze verzerrt. Dies, da die in diesen Techniken verwendet, um Gewebe frisch unfixierten Gewebes, die aus dem Schleim durch den Darm erzeugte schlüpfrig ist. Die neue modifizierte Technik überwindet diese Probleme hier dargestellt durch eine modifizierte Form von Bouin-Fixiermittel verwendet wird. Original Bouin-Fixiermittel besteht aus einer Mischung von Essigsäure, Ethanol, Pikrinsäure und Paraformaldehyd (oder Formalin). Die beiden gefährlichsten Komponenten, Pikrinsäure und Paraformaldehyd (oder Formalin), wurden viel sicherere Nutzung des Fixiermittel mit einer Essigsäure / Ethanol-Mix zu ermöglichen, eliminiert. Pikrinsäure stellt eine Explosionsgefahr, und paraformaldehyde (oder Formalin) ist eine Krebsgefahr. Die Bedeutung des modifizierten Bouin-Fixiermittel ist, dass es (1) weniger gefährlich im Vergleich zu seiner ursprünglichen Formel (2) ist einfach mit relativ nonexpensive Reagenzien herzustellen, die in den meisten Labors leicht verfügbar sind, und (3) ermöglicht eine schnelle, fast sofortige, Fixierung des Gewebes, wenn zum Spülen verwendet. Um Wissen gibt es keine bekannten Einschränkungen dieser modifizierten Technik verwendet wird. Zusätzlich reduziert die schnelle Fixierung mit dieser Mischung immens die Gleitfähigkeit des Darmgewebes, so dass viel schneller und Geweberoll einfacher. Diese Fixiermittel können auch für eine ausgezeichnete Konservierung von Gewebe- und Zellintegrität für histologische und Immunfärbungsanalyse. Somit überwindet im Vergleich zu anderen Verfahren der intestinalen Gewebepräparation, diese verbesserte Technik mehrere technische Probleme und gewährt stark verbesserten Geschwindigkeit und einfache Nutzung.
Auch diese modifizierte Fixiermittel ist nützlich, um mit anderen dick zu verwenden,Gewebe, die eine schnelle Fixierung erfordern. Aufgrund der Natur von Essigsäure und Ethanol, welche die Kapazität des schnellen Eindringens von dickem Gewebe während zur gleichen Zeit unterzogen Fixierung aufweisen. Wir haben es erfolgreich schnell zu beheben dicke Gewebe wie Leber, Milz und Nieren verwendet. 20 min - beispielsweise Fixierung einer erwachsenen Maus ganze Leber das modifizierte Bouin-Fixiermittel verwendet, wird in der Regel innerhalb von 15 erreicht. Dies kann leicht durch Schneiden mit einem Querschnitt in die Leber beurteilt werden, und beobachtet wird, ob die tiefen Regionen der Leber Farbe aus blutroten verändert hatte bis grau. Die Farbänderung ist indikativ für Fixierung. Diese Fixierung wird dann gefolgt durch Vernetzen gepuffert Formalin für 24 bis 48 Stunden ohne Angst vor veränderte zelluläre / Gewebezusammensetzung, da das Gewebe bereits an dieser Stelle festgelegt ist.
Im Vergleich dazu würde die traditionelle Verwendung gepufferte Formalinfixierung Verfahren allein auf einer erwachsenen Maus ganze Leber benötigen 24 bis 48 h Tiefengewebsmassage Befestigungs zu erreichenauf, mit dem Risiko einer veränderten zellulären Zusammensetzung des tiefen Gewebes. Die Schnellbefestigungsmethoden dicken Gewebe hat den überlegenen Vorteil, daß die Veränderung der Zellkomponenten in Reaktion auf ein Minimum reduzierenden Bedingungen, wie Hypoxie zu betonen, der Organ- / Gewebe aus dem Körper nach der Entfernung. Wir gehen davon aus, dass das modifizierte Fixiermittel kann der Befestigungs dicken Gewebe / Organe in Tier Perfusion als eine noch schnellere Art und Weise verwendet werden, ist erwünscht. So, zum Schluss, diese Methode und modifizierte Fixiermittel mehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen Methoden zur Darmgewebe Ernte verwendet liefern und die Fixierung und das modifizierte Fixiermittel kann verwendet werden, um schnell andere dicke Gewebe / Organe reparieren.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stainless Steel Dissecting Kits | VWR | 25640-002 | |
| Decloaking Chamber | Biocare Medical | DC2012 | |
| Syringe 10 ml | VWR | 89215-218 | |
| Swingsette Tissue embedding/processing cassette with lid | Simport | M515 | |
| Superfrost Plus Slides [size: 25 x 75 x 1 mm] | VWR | 48311-703 | |
| Manual Slide Staining Set | Tissue-Tek/Sakura | 4451 | |
| Staining Dish Green | Tissue-Tek/Sakura | 4456 | |
| Staining Dish White | Tissue-Tek/Sakura | 4457 | |
| 24-Slide Slide Holder with Detachable Handle | Tissue-Tek/Sakura | 4465 | |
| Oven | Thermo Scientific | 6243 | for baking slides at 65 degree |
| Dissection microscope | Zeiss | Stemi 2000C | |
| Fluorescence Microscope | Nikon | Eclipse 90i | Bright and fluoerescent light, with objectives: 10X, 20X |
| PAP Pen Super-Liquid Blocker Mini | Fisher Scientific | DAI-PAP-S-M | |
| Ethanol 200 proof | AAPR | 111000200 | |
| Methanol | VWR | BDH1135-4LP | |
| Glacial acetic acid | AAPR | 281000ACS | |
| Xylene | Fisher Scientific | X5P-1GAL | |
| Hydrogen peroxide 25% solution in water | ACROS | 202465000 | |
| 10% bufered formalin | Fisher Scientific | 22-026-213 | |
| Bovine serum fraction V, heat shock | Roche | 3116956001 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P7949 | |
| Sodium citrate | Fisher Scientific | S279 | |
| Gavage needle | VWR | 20068-624 | |
| Rabbit anti Klf5 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-22797 | Dilution 1:150 |
| Chicken anti EGFP antibody | Millipore | AB16901 | Dilution 1:500 |
| Rabbit anti Ki67 antibody | Biocare Medical | CRM325B | Dilution 1:500 |
| Mach3 rabbit AP polymer detection kit | Biocare Medical | M3R533L | |
| Warp red chromogen kit | Biocare Medical | WR806 H | |
| Lgr5-EGFP/CreERT2 mice | Jackson labs | 008875 | |
| Automated processor | Leica | Leica TP1020 |
References
- van der Flier, L. G., Clevers, H. Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium. Annu Rev Physiol. 71, 241-260 (2009).
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