Summary
Nauwkeurige identificatie en locatie van epitheelcellen langs de intestinale slijmvlies essentieel verschillende cellijnen definiëren. Een goede beeldvorming van darmweefsel is van cruciaal belang voor de identificatie van eiwit expressie patronen met maximale resolutie. Dit onderzoek heeft als doel om de optimale methoden en voorwaarden voor de verwerking van de muis intestinale weefsels af te bakenen.
Introduction
Het zoogdier darmepitheel omvat een enkele laag van kolomvormige cellen. In de dunne darm worden de proliferatieve cellen beperkt tot de crypten terwijl gedifferentieerde cellen bezetten de villus regio. Omdat er geen villi in de dikke darm, de proliferatieve cellen gelokaliseerd in de bodem van de crypten en gedifferentieerde cellen bezetten het bovenste gebied van de crypten. Het darmepitheel ondergaat snelle aanvulling (ongeveer 3-5 dagen) die wordt aangedreven door continue verdeling van de proliferatieve cellen in de crypten. De proliferatieve cellen van de crypten geen homogene populatie en worden verder onderverdeeld in stamcellen en doorvoer amplificeren (TA) cellen 1. De stamcellen bevinden aan de onderkant van de crypte binnen de eerste 4-5 cellen van de bodem 2. Het huidige model ondersteunt het bestaan van twee typen stamcellen: crypt base zuilvormige (CBC) stamcellen en reserveer rustende stamcellen. De CBC sTEM-cellen zijn actief delende en worden gekenmerkt door leucine-rich-repeat bevattende G-eiwit gekoppelde receptor 5 (Lgr5) 3, Olfactomedin 4 (Olfm4) 4 en Achaete scute-achtige 2 (Ascl2) 5. Aan de andere kant, zijn reserve rustende stamcellen gelabeld door B-cel-specifieke Moloney muizen leukemie virus integratie plaats 1 (Bmi1) 6, muis telomerase reverse transcriptase (mTERT) 7, HOP Homeobox (Hopx) 8, doublecortin-achtige en CAM Kinase -achtige 1 (Dclk1) 9, en leucine-rijke herhalingen en immunoglobuline-achtige domeinen 1 (Lrig1) 10. Het actief prolifererende stamcellen aanleiding geven tot TA-cellen vervolgens ondergaan verdere differentiatie in absorberende cellen (enterocyten) en secretoire cellen (entero-endocriene, beker, Paneth en Tuft cellen). Continue celdeling in de proliferatieve zone leidt tot opwaartse beweging van epitheelcellen langs de crypte-villus as tot zij boven de villi, waar ze apoptose ondergaan en zijn bereiktafgeworpen van het oppervlak van het epitheel. De verschillende types van darmepitheelcellen worden gekenmerkt door de expressie van verschillende eiwitten (bijvoorbeeld, kan intestinale bekercellen door kleuren met antilichaam tegen MUC2 en Paneth cellen met antilichaam tegen lysozyme herkend). We bestuderen de rol van Krüppel-achtige factoren (KLFs) in de homeostase en pathobiologie van het darmepitheel 11-13. De hier voorgestelde ondersteuning van de haalbaarheid van een gemodificeerd Swiss-rolling techniek resultaten zijn gebaseerd op eerdere onderzoeken van de rol van Krüppel-achtige factor 5 (KLF5) in het onderhoud van het actief prolifererende intestinale epitheliale stamcellen 14. KLF5 een zinkvinger transcriptiefactor die hoog tot expressie in de actieve intestinale stamcellen en TA 12 cellen. Eerdere studies toonden aan dat KLF5 is co-expressie gebracht met Ki-67, een bekende proliferatieve marker in de intestinale crypten.
Het maag tr act is geen structureel of functioneel homogeen weefsel. De dunne darm bestaat uit duodenum, jejunum en ileum en de dikke darm in blindedarm en de dikke darm, waarbij de laatste verder verdeeld in proximale, midden en distale gedeelten. Elk van deze afdelingen heeft unieke histologische kenmerken en speelt verschillende rollen 15. Als zodanig kunnen de effecten van beledigingen en de mate van de respons van het darmepitheel afhankelijk regio onderzochte weefsel 16. Daarnaast worden verschillende muizenstammen tonen diversiteit van de respons op histologisch niveau op basis van het type insult in het onderzoek gebruikte 16. Aldus past weefselbereiding moeten passende histologische en moleculaire analyse van het darmweefsel mogelijk. Als zodanig, de Zwitsers-roll techniek subsidies analyse van de volledige lengte van het darmepitheel in één keer en zo constateert goed geïnformeerde conclusies op basis van uitgebreide informatie.
e_content "> de Swiss-roll techniek werd eerst vermeld door Magnus 17 en in detail beschreven door Moolenbeck en Ruitenberg en Park et al. een werkwijze voor het bereiden van weefsel en histologische analyses uitvoeren van het knaagdier darm 18,19 respectievelijk. Het protocol afgebakend in deze publicatie toont een verbeterde versie van de oorspronkelijke methode die het mogelijk maakt om actuele, betrouwbare weefselpreparatie voor diagnostische doeleinden. deze aangepaste techniek maakt efficiënte verzameling en voorbereiding van het darmepitheel van algemeen gebruikte technieken, zoals immunohistochemie, immunofluorescentie, alsmede zoals in situ hybridisatie (fluorescerende en chromogene 20). Bovendien is de gemodificeerde weefselspecimen bereidingswijze gebruikt gemakkelijk beschikbaar en relatief goedkope reagentia terwijl het een werkwijze voor snelle fixatie van het weefsel en maakt terugwinning van eiwitten, DNA en RNA voor extra evaluatie. Genomen samen, this techniek is uitstekend voor uitgebreide beoordeling van histopathologische, pathologische en moleculaire kenmerken van het darmepitheel.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Muizen
- Alle studies met muizen werden goedgekeurd door de Stony Brook University Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC). De muizen werden gehandhaafd op een 12:12 uur licht-donker cyclus.
- Commercieel te verkrijgen C57BL / 6 muizen. Verkrijgen C57BL / 6 muizen die Klf5 allelen geflankeerd door loxP-plaatsen (Klf5 f l / f l). Deze muizen werden eerder beschreven 21 en vriendelijk aangeboden door Dr. Ryozo Nagai.
- Aankoop van C57BL / 6 muizen die de induceerbare Cre recombinase gen onder regulatie van de Lgr5 promoter (Lgr5-EGFP / CreERT2 muizen).
- Om Lgr5-EGFP / Creer T2 / Klf5 f l / f l muizen vast te stellen, steek Klf5 fl / f l muizen met Lgr5-EGFP / Creer T2 muizen en vervolgens terugkruising het nageslacht te Klf5 fl / f l muizen.
- Behandel muizen met tamoxifen volgens het protocol eerder beschreven 22. Injecteer 8 weken oude experimentele en controle muizen intraperitoneaal (IP) met 1 mg tamoxifen (10 mg / ml), opgelost in steriele maïsolie, gedurende 5 opeenvolgende dagen.
- Op dag 14 na de eerste injectie tamoxifen, offeren muizen, waarbij CO 2 stikken door ze in een kamer verbonden CO 2 gasbron. Laat het gas te stromen in de kamer totdat de muizen zijn onbewuste en al beweging ophoudt. Om ervoor te zorgen euthanasie uit te voeren cervicale dislocatie.
2. Tissue Voorbereiding en Zwitserse Rolling
- Gebruik dissectie pincet en schaar gesneden een incisie in de huid van de buikzijde. Met een pincet, houdt de huid op de incisie en trek zachtjes weg van de buikspier weefsel. Gebruik een schaar om de buikhuid snijden en bloot de buikspieren.
- Houd en trek de peritoneum met de tang. Zorg ervoor dat niet te houden en trekken aan de darmen. maak zorgvuldig een incisie in de peritoneale weefsel en verder snijden van de huid weg om de buikspieren bloot. maak zorgvuldig een incisie in de buikspieren en blijven ze weg te snijden om de ingewanden bloot te leggen.
- Identificeer de colon en sporenelementen aan het distale einde waar hij samenkomt met het rectum / anus. Met een schaar gesneden zo dicht bij de anale opening mogelijk.
- Identificeer de maag en traceren waar hij samenkomt met de dunne darm. Met een schaar, losgesneden de darm ongeveer 1 cm van de maag. Breng de gehele lengte van de vrijgekomen dunne darm en colon een schone petrischaal met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
- Met een hand of een tang, houdt het distale uiteinde van het colon en met de andere hand voorzichtig ontrafelen de gehele lengte van de dikke darm van een mesenteriale bindweefsel en / of vetweefsel.
- Identificeer de blindedarm(Klein zakje tussen de dunne en dikke darm) en snijden waar de blindedarm en de dikke darm join (het proximale uiteinde van de colon) om de dikke darm te bevrijden.
- Met een hand of een tang, houdt de dunne darm en met de andere hand voorzichtig ontrafelen de gehele lengte van de dunne darm van een mesenteriale bindweefsel en / of vetweefsel. Weggesneden de blindedarm en weggooien als er geen behoefte aan is.
Let op: Het proces kan hier worden gestopt door incubatie van de uitgesneden darmen in gewijzigde Bouin's fixatief (50% ethanol / 5% azijnzuur in dH 2 O) 's nachts en voortzetting van de procedure de volgende dag. - Omgaan met een segment van de darm (dunne darm of dikke darm), het invullen van een 10-ml spuit met fixatief gemodificeerde Bouin's en bevestig een maagsonde naald aan. Steek de naald ongeveer een halve centimeter in de voorste opening van de intestinale segment.
- Houd de maagsonde naald in de intestinale segment door het toepassen van een stevige druk met een instrumentop de intestinale segment. Met de andere hand de spuit, zachtjes maar constante druk om de inhoud van de intestinale segment modified Bouin's fixatief spoelen. Deze stap maakt gelijktijdige reiniging van de intestinale segment en onmiddellijke fixatie. Gebruik een petrischaal om het doorstroomkanaal afval te verzamelen. Fixatie kan worden waargenomen door de colon kleur draaien ondoorzichtig.
Opmerking: Zorg ervoor niet te veel druk toe te passen tijdens het spoelen of de intestinale segment zou kunnen barsten open. - Met een schaar, opengesneden de intestinale segment lengterichting langs de mesenteriale lijn. Houd het met een pincet en spoel het kort in een petrischaal met PBS.
- Snijd de dunne darm in 3 gelijke segmenten: proximale, midden en distale. Het proximale segment is die direct na de maag en het distale segment is die onmiddellijk vóór de colon. Het proximale segment is gelijk aan de twaalfvingerige darm, het midden tot het jejunum en het distaalhet ileum.
- Voor elk segment markeert het proximale en het distale uiteinde. Het proximale uiteinde is degene die oorspronkelijk was richting van de maag en de distale wees naar de dikke darm.
- Gebruik van de top van een petrischaal Gereinigde en opende darmsegment plaatsen. Plaats de intestinale segment met de luminale kant naar boven.
- Voor de colon identificeer de luminale naast de schakeringen / richels over de breedte en bij het proximale uiteinde zijn. Het midden en distale gebieden hebben een aantal schakeringen die in de lengterichting lopen. Voor de dunne darm, identificeer de luminale zijde van het ruwe oppervlak verschijnen, die de villi markeert.
Opmerking: Voor de dunne darm, zijn er geen externe macroscopische anatomische afbakening van proximale, middelste en distale gebieden. Maar deze gebieden kunnen worden geïdentificeerd in secties onder de microscoop. De villi zijn langste in het proximale gebied en wordt geleidelijk aan korter distaal waar ze zijnde kortste lengte. Microscopisch de colon crypten kortste in het proximale gebied dat ook kan worden geïdentificeerd door de aanwezigheid van ribbels. De colon crypten zijn langst in de buik en korter in de distale regio nog steeds groter dan in het proximale gebied.
- Voor de colon identificeer de luminale naast de schakeringen / richels over de breedte en bij het proximale uiteinde zijn. Het midden en distale gebieden hebben een aantal schakeringen die in de lengterichting lopen. Voor de dunne darm, identificeer de luminale zijde van het ruwe oppervlak verschijnen, die de villi markeert.
- Ga verder met de Zwitserse rollen van de dikke darm:
- Houd de dikke darm platte open en trek hem met een pincet uit zijn proximale einde naar de rand van de petrischaal.
- Houd luminale kant naar boven en houdt het proximale einde met de tang met één hand en met de andere hand houdt een tandenstoker.
- Wikkel de rand van het proximale uiteinde rond de tandenstoker met behulp van de tang en iets knijpen de ingepakte rand tegen de tandenstoker om het te houden op zijn plaats.
- Voorzichtig en langzaam beginnen met het rollen van de tandenstoker met de vingers om de dikke darm te rollen rond de tandenstoker een Swiss roll vormen.
- Zodra de gehele dikke darm lengte dossier is opgerold, gebruik dan een pincet om schuif de cOlon Swiss roll off van de tandenstoker en in een weefsel-processing / -embedding cassette. Plaats de cassette in 10% gebufferde formaline gedurende de nacht bij kamertemperatuur.
- Ga verder met de Zwitserse rollen van de dunne darm:
- Omgaan met een segment in een tijd, houdt het segment vlakke openen met luminale kant naar boven en trek hem met een pincet uit zijn proximale einde naar de rand van de petrischaal.
- Doorgaan met Zwitserse rollen zoals beschreven voor de colon.
- Ga verder met het verwerken van in formaline gefixeerde weefsels op paraffine inbedding. Ga als volgt te werk:
OPMERKING: Gebruik een geautomatiseerde processor (zie materialen en apparatuur voor details).- Terwijl weefsel in de cassette, spoel weefsel met PBS totdat fixeermiddel volledig verwijderd.
- Dehydrateer weefsel met behulp van ethanol in de volgende volgorde: 50% ethanol gedurende 10 min, 70% ethanol gedurende 10 min, 80% ethanol gedurende 10 min, 95% ethanol gedurende 10 min, 100% ethanol gedurende 10 min, 100% ethanol gedurende 10 min en 100% ethanol gedurende 10 minuten.
- Exchange ethanol met xyleen in de volgende volgorde: 2: 1 ethanol: xyleen gedurende 10 - 15 min, 1: 1 ethanol: xyleen gedurende 10 - 15 min, 1: 2 ethanol: xyleen gedurende 10 - 15 min, 100% xyleen gedurende 10 - 15 min, 100% xyleen gedurende 10 - 15 minuten en 100% xyleen gedurende 10 - 15 min. LET OP: Xyleen is een gevaar voor de gezondheid, aldus de werkplek moeten worden uitgerust met een lokale afzuiging met een behoorlijke kap en de juiste beschermingsmiddelen moeten worden gedragen door personeel.
- Exchange xyleen met paraffine. De volgende stappen in een vacuümoven ingesteld op 54-58 ° C: 2: 1 xyleen: paraffine gedurende 30 min, 1: 1 xyleen: paraffine gedurende 30 min, 1: 2 xyleen: paraffine voor 30 min, 100% paraffine voor 1-2 uur, en 100% paraffine gedurende 1-2 uur of 's nachts.
Opmerking: Laat de paraffine hoger zijn dan 60 ° C gedurende langere tijd, omdat deze de paraffine polymeren zullen worden afgebroken en maken het hard en bros. - Insluiten in frisse nieuwe paraffine en oriënteren weefsel als devoor de gewenste paraffine verhardt. Voor de Swiss roll, bij weefselschade paraffinization, is het belangrijk dat elke rol aan de kant verplaatsen tijdens inbedden in paraffine. Dit zorgt ervoor dat tijdens het snijden, delen van de gehele lengte van elke rol wordt geproduceerd.
- Voor het kleuren, knippen 5-pm dikke secties met behulp van microtoom. Verzamel de hoofdstukken over geladen dia's en droog ze (bakken) in een 65 ° C oven gedurende de nacht; laat afkoelen tot kamertemperatuur en vervolgens te worden gebruikt voor het kleuren.
Opmerking: De baktijd kan worden ingekort tot 1-2 uur, afhankelijk van hoe vers gesneden van de dia's zijn. Als er minder dan een maand sinds het snijden, dan is het raadzaam om 's nachts te bakken. Indien deze meer dan een maand is opgesteld, 1-2 uur bakken volstaat om tijd te besparen. Als de tijd dringt, kan 's nachts backing altijd worden gebruikt.
3. Histologische analyse en immunofluorescentie kleuring
Voer histologische analyse en immunofluorescence kleuring zoals eerder beschreven 23,24, met modificaties. Voor versterkt groen fluorescent eiwit (EGFP) immunofluorescentie:
- Bak de objectglaasjes in een 65 ° C oven gedurende 1 uur geïnactiveerd endogene alkalische fosfatase-activiteit en vervolgens deparaffinize in xyleen.
- Incubeer secties in een bad van 3% waterstofperoxide in methanol endogeen weefsel peroxidasen blokkeren; Vervolgens rehydrateren door incubatie in een afnemende alcohol bad serie (100%, 95%, 70%), gevolgd door antigeenterugtrekking in citraatbuffer-oplossing (10 mM natriumcitraat, 0,05% Tween-20, pH 6,0) bij 125 ° C gedurende 10 min met behulp van een onthulling kamer.
- Omcirkel weefselcoupes gebruikt markeerstift die hydrofobe barrière biedt en incubeer secties met blokkerende buffer (2,5% runderserumalbumine [BSA] in TBS-Tween) gedurende 30 min bij 37 ° C en vervolgens met primair antilichaam tegen EGFP (verdunning 1 : 500) bij 4 ° C geïncubeerd in een bevochtigde kamer onder zacht schudden.
- Wassen secties en incubeer met fluorescent gelabelde secundaire antilichaam bij de geschikte concentratie voor 30 minuten bij 37 ° C.
- Was de dia's na de secundaire behandeling antilichaam en vlek kernen met Hoechst en monteer met montage media.
- Voor Klf5 / EGFP / Ki-67 co-kleuring proces dia's zoals beschreven in de stappen 3,1-3,3 en uit te voeren Klf5 kleuring door incubatie met Klf5 antilichaam (verdunning 1: 150) gedurende de nacht.
- Solliciteer konijn AP polymeer detectie om dia's per protocol.
- Reveal Klf4 kleuring met behulp van chromogeen immunohistochemische kleuring volgens het protocol van de fabrikant.
- Voer antilichaam elutie met behulp van de eerder beschreven protocol 25. Incubeer dia bij 50 ° C in Glycine-SDS (pH 2,0) oplossing onder roeren gedurende 1 uur.
- Wassen glijdt grondig met gedestilleerd water en geïncubeerd met blokkerende buffer (2,5% BSA in TBS-Tween) gedurende 30 min bij 37 ° C.
- Voeg Ki-67 (verdunning 1: 500) en EGFP (verdunning 1:500) antilichamen gelijktijdig en incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur.
- Voer fluorescerende detectie met passende secundaire antilichamen voor kleuring met Hoechst (gegevens niet getoond) en monteer met montage medium.
- Observeren histologische morfologie van het weefsel op kleuring 5-um secties met hematoxyline en eosine (H & E) 26. Voor tl-beelden, gebruiken de emissie golflengtes van 535, 646 en 700 te visualiseren EGFP, Klf5 en Ki-67 kleuring, respectievelijk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De Zwitserse rollende techniek in combinatie met immunohistochemische kleuring zorgt voor een uitgebreide analyse van kleine of grote darmweefsel. Het voorbeeld van H & E kleuring van een dikke darm van een C57BL / 6 muis (Figuur 1) is een illustratie van de haalbaarheid en de effectiviteit van deze techniek. Zoals getoond in figuur 1, het beeld kunnen alle gedeelten van de colon te vangen: proximaal, midden en distaal. Zo maakt het breed histologische evaluatie. De Zwitserse rollen en de mogelijkheid om de gehele lengte van de dunne of dikke darmweefsel vangen is zeer nuttig voor heterogene genexpressie en marker vlekken of een variabele respons van het darmweefsel voor het insult.
Een voorbeeld is de EGFP kleuringspatroon in Lgr5-EGFP / créer T2 muizen. In dit muismodel wordt expressie van EGFP aangedreven door deLgr5 promotor, die alleen actief is in het actief prolifererende intestinale crypten. Tevens wordt dit muismodel gekenmerkt door lage (ongeveer 5-10%) penetrantie van transgenexpressie. Zoals getoond in figuur 2, het EGFP expressiepatroon in het darmweefsel variabel. Derhalve de mogelijkheid om een grote weergave van het weefsel vangen helpt om het gebied van belang te identificeren.
De hier beschreven techniek is krachtig bijzonder met toepassing van multifluorophore kleuring. Hier tonen we een voorbeeld van trifluorophore kleuring van het darmweefsel dat bereid was met behulp van de Zwitsers-roll-techniek. Het belangrijkste doel van deze studie was de rol van Klf5 in het onderhoud van intestinale stamcellen tot expressie Lgr5 merker te onderzoeken. Daarom hebben we verwijderd Klf5 uit de Lgr5-positieve intestinale stamcellen in Lgr5-EGFP / Creer T2 muizen en darmweefsel op dag verzameld14 na de eerste injectie tamoxifen. Voor immunohistologische analyse werden de weefsels vervaardigd volgens het protocol in dit manuscript en kleuring van EGFP (Lgr5 marker), Klf5 en Ki-67 werd uitgevoerd. In de controle muizen, aangeduid als Lgr5-EGFP / Creer T2, zowel EGFP-positieve (gemarkeerd met blauwe pijlen) en EGFP-negatieve crypten (gemarkeerd met witte pijlen) vertoonden co-kleuring voor Klf5 en Ki-67 bij twee onderzochte tijdstippen , zie figuur 3D. In tegenstelling, in Lgr5-EGFP / Creer T2 / Klf5 fl / fl kleine darmweefsel, Klf5 / Ki-67 co-kleuring ontbrak in de EGFP-positieve CBC stamcellen (gemarkeerd met blauwe pijlen), maar in de EGFP-negatieve crypten grenzend groene crypten (gemarkeerd met witte pijlen), zie figuur 3H. Dit is een uitstekend voorbeeld dat het weefsel voorbereiding technieken die hier gepresenteerd heeft geen negatieve invloed op kleuring kwaliteit.
Figuur 1. H & E kleuring van de dikke darm van een L C57B / 6 muis. Getoond wordt het samengestelde beeld van de gehele lengte van de dikke darm. Het gedeelte tussen de zwarte pijl en zwarte lijn geeft het proximale deel, tussen de zwarte en oranje lijnen markeert het midden, en tussen de oranje lijn en oranje pijl markeert het distale deel van de dikke darm. Schaal bar = 1,000 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. immunofluorescentiekleuring van een dunne darm van een Lgr5-EGFP / Creer T2 Mouse. Samengesteld beeld van EGFP (etikettering Lgr5-positieve epitheelcellen) kleuring van de dunne darm delen van een Lgr5-EGFP / Creer T2 muis. Voorbeeld van een heterogene immunofluorescentiekleuring eiwit marker (EGFP) dat Lgr5-positieve epitheelcellen labels in de crypten van de Lgr5-EGFP / Creer T2 muis. Kernen worden gevisualiseerd met Hoechst. Witte pijlen markeren crypten positief voor EGFP expressie. Schaal bar = 500 pm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Klf5 Schrapping in Lgr5-EGFP / Creer T2 / Klf5 fl / fl Mice steunt nog steeds Long Term in Lgr5-EGFP-positieve crypten. T2 controle en Lgr5-EGFP / Creer T2 / Klf5 fl / fl muizen op dag 14 dagen na de eerste injectie tamoxifen, respectievelijk. Panelen AD zijn representatief voor de kleuring van weefsel verzameld van Lgr5-EGFP / Creer T2 controle muizen, terwijl de panelen EH toon kleuring vertegenwoordiger van Lgr5-EGFP / Creer T2 / Klf5 fl / fl muizen. Panelen A en E vertoning Klf5 immunofluorescentiekleuring in het rood; panelen B en F tonen EGFP kleuring in groen; panelen C en G tonen Ki-67 kleuring in geel; en panelen D en H tonen samengevoegd beelden van Klf5, EGFP en Ki-67 vlekken. Blauwe pijlen wijzen naar groene crypten; witte pijlen wijzen naar nongreen crypten in de samengevoegde beelden. Lgr5-EGFP / Creer T2 / Klf5 fl / fl muizen langdurige verlies van Klf5 alleen in de EGFP-gemerkte cellen CBC 14. Schaal bar = 50 pm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De Zwitserse rollen techniek is een krachtige methode voor het bereiden darmweefsel voor histologische en morfologische beoordeling op grote schaal. In tegenstelling tot de eerder beschreven Swiss walsen techniek die oorspronkelijk is ontwikkeld voor bereiding van ingevroren secties 18,19, de hier gepresenteerde maakt snelle voorbereiding darmweefsel en fixatie voor formaline fixatie en inbedden in paraffine (FFPE). In vergelijking met ingevroren weefsel, FFPE weefsel heeft veel langere houdbaarheid en is het voorkeurstype weefsel voor histologische analyse vanwege betere weefselintegriteit. Kritieke delen van de Zwitsers-rolling protocol betrekken weefsel flexibiliteit voor het walsen en het behoud van de Zwitsers-roll integriteit en kwaliteit weefsel voor kleuring postfixatie. De standaard Swiss-roll techniek voor FFPE van darmweefsel is meestal arbeidsintensief en tijdrovend (2 dagen) 18,19. Bovendien, deze standaard methode levert meestal darmweefsel dat is relatively stijf en niet gemakkelijk te vormen in een Swiss roll. Dit komt omdat overnacht incubatie van de ontleed darmweefsel in 10% gebufferde formaline nodig voor weefsel rollen. Andere modificaties van de techniek voor FFPE doeleinden zijn ontwikkeld, maar ze hebben een groot probleem van de neiging van darmweefsel te rollen en / of het centrum van de rol wordt vervormd. Dit komt doordat het weefsel gebruikt in deze technieken vers losgemaakte weefsel, dat glad uit het slijm door de darm. De nieuwe gemodificeerde techniek hier worden deze problemen opgeheven door gebruik van een gemodificeerde vorm van Bouin's fixatief. Originele Bouin's fixeermiddel bestaat uit een mengsel van azijnzuur, ethanol, picrinezuur en paraformaldehyde (of formaline). De twee meest gevaarlijke onderdelen, picrinezuur en paraformaldehyde (of formaline), zijn geëlimineerd om veel veiliger gebruik van het fixeermiddel met een azijnzuur / ethanol mix mogelijk te maken. Picrinezuur presenteert een explosiegevaar, en paraformaldehyde (of formaline) is een gevaar voor kanker. Het belang van het gebruik van de gemodificeerde Bouin's fixeermiddel dat (1) minder gevaarlijk dan de oorspronkelijke formule (2) is gemakkelijk te bereiden met relatief nonexpensive reagentia die gemakkelijk beschikbaar in de meeste laboratoria zijn, en (3) zorgt voor snelle, bijna direct, fixatie van het weefsel wanneer het wordt gebruikt voor het spoelen. Te weten zijn er geen bekende beperkingen aan het gebruik van dit gemodificeerde techniek. Bovendien, de snelle bevestiging met dit mengsel enorm reduceert de gladheid van het darmweefsel, waardoor veel sneller en gemakkelijker weefsel rollen. Dit fixeermiddel maakt ook uitstekende conservering van weefsels en cellen integriteit en immunokleuring histologische analyse. Dus, in vergelijking met andere werkwijzen darmweefsel voorbereiding, deze verbeterde techniek overwint een aantal technische problemen en verleent sterk verbeterde snelheid en gebruiksgemak.
Ook deze gewijzigde fixatief nuttig voor gebruik met andere dikkeweefsels die snelle fixatie nodig. Vanwege de aard van azijnzuur en ethanol, dat de capaciteit van snelle penetratie van dik weefsel, terwijl tegelijkertijd ondergaat fixatie. We hebben met succes gebruikt om dik weefsel snel oplossen zoals lever, milt en nieren. Bijvoorbeeld wordt fixatie van een volwassen muis lever geheel met de gemodificeerde Bouin's fixatief algemeen binnen 15-20 min. Dit kan gemakkelijk worden beoordeeld door het snijden van een dwarsdoorsnede in de lever en het waarnemen of de diepe gebieden van de lever kleur van bloedrood tot grijs veranderd. De kleurverandering duidt op fixatie. Deze fixatie wordt gevolgd door verknoping via gebufferde formaline gedurende 24 - 48 uur, zonder angst veranderde cellulaire / weefselsamenstelling, zoals het weefsel reeds op dit punt wordt bevestigd.
Ter vergelijking, zou het gebruik van traditionele gebufferde formaline fixatie methode alleen op een volwassen muis hele lever nodig 24-48 uur tot deep-tissue fixati bereikendoor en het risico van veranderde cellulaire samenstelling van deep tissue. De snelle bevestigingsmethoden dikke weefsels heeft superieure voordeel dat een minimale verandering van de cellulaire componenten in reactie op, zoals hypoxie benadrukken, na verwijdering van het orgaan / weefsel van het lichaam. We verwachten dat de gemodificeerde hechtmiddel bij dieren perfusie kan worden gebruikt als een nog snellere manier vaststelling dik weefsel / organen gewenst. Bijgevolg kan worden geconcludeerd, deze werkwijze gewijzigde fixeermiddel bieden vele voordelen ten opzichte van traditionele methoden voor darmweefsel oogsten en fixatie en het gemodificeerde fixeermiddel kan worden gebruikt om andere dikke weefsels / organen snel oplossen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stainless Steel Dissecting Kits | VWR | 25640-002 | |
| Decloaking Chamber | Biocare Medical | DC2012 | |
| Syringe 10 ml | VWR | 89215-218 | |
| Swingsette Tissue embedding/processing cassette with lid | Simport | M515 | |
| Superfrost Plus Slides [size: 25 x 75 x 1 mm] | VWR | 48311-703 | |
| Manual Slide Staining Set | Tissue-Tek/Sakura | 4451 | |
| Staining Dish Green | Tissue-Tek/Sakura | 4456 | |
| Staining Dish White | Tissue-Tek/Sakura | 4457 | |
| 24-Slide Slide Holder with Detachable Handle | Tissue-Tek/Sakura | 4465 | |
| Oven | Thermo Scientific | 6243 | for baking slides at 65 degree |
| Dissection microscope | Zeiss | Stemi 2000C | |
| Fluorescence Microscope | Nikon | Eclipse 90i | Bright and fluoerescent light, with objectives: 10X, 20X |
| PAP Pen Super-Liquid Blocker Mini | Fisher Scientific | DAI-PAP-S-M | |
| Ethanol 200 proof | AAPR | 111000200 | |
| Methanol | VWR | BDH1135-4LP | |
| Glacial acetic acid | AAPR | 281000ACS | |
| Xylene | Fisher Scientific | X5P-1GAL | |
| Hydrogen peroxide 25% solution in water | ACROS | 202465000 | |
| 10% bufered formalin | Fisher Scientific | 22-026-213 | |
| Bovine serum fraction V, heat shock | Roche | 3116956001 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P7949 | |
| Sodium citrate | Fisher Scientific | S279 | |
| Gavage needle | VWR | 20068-624 | |
| Rabbit anti Klf5 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-22797 | Dilution 1:150 |
| Chicken anti EGFP antibody | Millipore | AB16901 | Dilution 1:500 |
| Rabbit anti Ki67 antibody | Biocare Medical | CRM325B | Dilution 1:500 |
| Mach3 rabbit AP polymer detection kit | Biocare Medical | M3R533L | |
| Warp red chromogen kit | Biocare Medical | WR806 H | |
| Lgr5-EGFP/CreERT2 mice | Jackson labs | 008875 | |
| Automated processor | Leica | Leica TP1020 |
References
- van der Flier, L. G., Clevers, H. Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium. Annu Rev Physiol. 71, 241-260 (2009).
- Bjerknes, M., Cheng, H. Methods for the isolation of intact epithelium from the mouse intestine. Anat Rec. 199, 565-574 (1981).
- Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449 (7165), 1003-1007 (2007).
- van der Flier, L. G., Haegebarth, A., Stange, D. E., van de Wetering, M., Clevers, H. OLFM4 is a robust marker for stem cells in human intestine and marks a subset of colorectal cancer cells. Gastroenterology. 137 (1), 15-17 (2009).
- van der Flier, L. G., et al. Transcription factor achaete scute-like 2 controls intestinal stem cell fate. Cell. 136 (5), 903-912 (2009).
- Sangiorgi, E., Capecchi, M. R. Bmi1 is expressed in vivo in intestinal stem cells. Nat Genet. 40 (7), 915-920 (2008).
- Montgomery, R. K., et al. Mouse telomerase reverse transcriptase (mTert) expression marks slowly cycling intestinal stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (1), 179-184 (2011).
- Takeda, N., et al. Interconversion between intestinal stem cell populations in distinct niches. Science. 334 (6061), 1420-1424 (2011).
- May, R., et al. Identification of a novel putative gastrointestinal stem cell and adenoma stem cell marker, doublecortin and CaM kinase-like-1, following radiation injury and in adenomatous polyposis coli/multiple intestinal neoplasia mice. Stem Cells. 26 (3), 630-637 (2008).
- Powell, A. E., et al. The pan-ErbB negative regulator Lrig1 is an intestinal stem cell marker that functions as a tumor suppressor. Cell. 149 (1), 146-158 (2012).
- Pearson, R., Fleetwood, J., Eaton, S., Crossley, M., Bao, S. Kruppel-like transcription factors: a functional family. Int J Biochem Cell Biol. 40 (10), 1996-2001 (2008).
- McConnell, B. B., Yang, V. W. Mammalian Kruppel-like factors in health and diseases. Physiol Rev. 90 (4), 1337-1381 (2010).
- McConnell, B. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. The diverse functions of Kruppel-like factors 4 and 5 in epithelial biology and pathobiology. Bioessays. 29 (6), 549-557 (2007).
- Nandan, M. O., Ghaleb, A. M., Bialkowska, A. B., Yang, V. W. Kruppel-like factor 5 is essential for proliferation and survival of mouse intestinal epithelial stem cells. Stem Cell Res. 14 (1), 10-19 (2015).
- Gelberg, H. B. Comparative anatomy, physiology, and mechanisms of disease production of the esophagus, stomach, and small intestine. Toxicol Pathol. 42 (1), 54-66 (2014).
- De Robertis, M., et al. The AOM/DSS murine model for the study of colon carcinogenesis: From pathways to diagnosis and therapy studies. J Carcinog. 10 (9), (2011).
- Magnus, H. A. Observations on the presence of intestinal epithelium in the gastric mucosa. The Journal of Pathology and Bacteriology. 44 (2), 389-398 (1937).
- Moolenbeek, C., Ruitenberg, E. J. The "Swiss roll": a simple technique for histological studies of the rodent intestine. Lab Anim. 15 (1), 57-59 (1981).
- Park, C. M., Reid, P. E., Walker, D. C., MacPherson, B. R. A simple, practical 'swiss roll' method of preparing tissues for paraffin or methacrylate embedding. J Microsc. 145, Pt 1 115-120 (1987).
- Summersgill, B., Clark, J., Shipley, J. Fluorescence and chromogenic in situ hybridization to detect genetic aberrations in formalin-fixed paraffin embedded material, including tissue microarrays. Nat Protoc. 3 (2), 220-234 (2008).
- Takeda, N., et al. Cardiac fibroblasts are essential for the adaptive response of the murine heart to pressure overload. J Clin Invest. 120 (1), 254-265 (2010).
- el Marjou, F., et al. Tissue-specific and inducible Cre-mediated recombination in the gut epithelium. Genesis. 39 (3), 186-193 (2004).
- McConnell, B. B., et al. Kruppel-like factor 5 is important for maintenance of crypt architecture and barrier function in mouse intestine. Gastroenterology. 141 (4), 1302-1313 (2011).
- Nandan, M. O., et al. Kruppel-like factor 5 is a crucial mediator of intestinal tumorigenesis in mice harboring combined ApcMin and KRASV12 mutations. Mol Cancer. 9 (63), (2010).
- Pirici, D., et al. Antibody elution method for multiple immunohistochemistry on primary antibodies raised in the same species and of the same subtype. J Histochem Cytochem. 57 (6), 567-575 (2009).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. CSH Protoc. 2008, pdb prot4986 (2008).
