Summary
accurata identificazione e localizzazione delle cellule epiteliali lungo il rivestimento della mucosa intestinale sono essenziali per definire diverse linee cellulari. Corretta l'imaging dei tessuti intestinali è di fondamentale importanza per l'identificazione dei pattern di espressione della proteina con la massima risoluzione. Questo studio si propone di delineare i metodi e le condizioni ottimali per i tessuti intestinali lavorazione del mouse.
Introduction
L'epitelio intestinale di mammifero comprende un singolo strato di cellule colonnari. Nel piccolo intestino, le cellule proliferative sono limitati alle cripte mentre le cellule differenziate occupano la regione villi. Tuttavia, perché non ci sono villi nell'intestino crasso, le cellule proliferative sono localizzati nel fondo delle cripte e cellule differenziate occupano la regione superiore delle cripte. L'epitelio intestinale subisce rifornimento rapido (circa 3 - 5 giorni) che è guidato dalla divisione continua delle cellule proliferative all'interno delle cripte. Le cellule proliferative delle cripte non sono una popolazione omogenea e sono ulteriormente suddivisi in cellule staminali e cellule 1 di transito di amplificazione (TA). Le cellule staminali risiedono sul fondo della cripta, entro i primi 4 - 5 cellule dal fondo 2. L'attuale modello supporta l'esistenza di due tipi di cellule staminali: le cellule staminali cripta base a colonna (CBC) e le cellule staminali quiescenti di riserva. Il CBC sle cellule TEM sono attivamente proliferando e sono contrassegnati da G-proteine repeat-contenenti ricchi di leucina recettore accoppiato 5 (Lgr5) 3, 4 Olfactomedin (Olfm4) 4 e Achaete scute-like 2 (Ascl2) 5. D'altra parte, le cellule staminali quiescenti di riserva sono etichettati in base al sito B specifici delle cellule Moloney murine leukemia virus integrazione 1 (BMI1) 6, la telomerasi del mouse trascrittasi inversa (mTert) 7, HOP Homeobox (Hopx) 8, doublecortin-like e CAM chinasi -Come 1 (Dclk1) 9, e leucina Rich ripetizioni e Immunoglobulina-Come domini 1 (Lrig1) 10. Le cellule staminali proliferano attivamente danno origine a cellule TA poi subire un'ulteriore differenziazione in cellule assorbenti (enterociti) e cellule secretorie (enteroendocrine, calice, cellule Paneth, e Tuft). divisione cellulare continua nella zona proliferativa traduce in movimento verso l'alto delle cellule epiteliali lungo l'asse cripta-villo fino a raggiungere sommità dei villi, dove subiscono apoptosi e sonosloughed dalla superficie dell'epitelio. I diversi tipi di cellule epiteliali intestinali sono contrassegnati mediante l'espressione di proteine distinte (ad esempio, cellule caliciformi intestinali può essere riconosciuto dalla colorazione con anticorpi contro le cellule MUC2 e Paneth con anticorpi contro il lisozima). Studiamo il ruolo dei fattori Krüppel-like (KLFs) nella omeostasi e patobiologia dell'epitelio intestinale 11-13. I risultati qui presentati sostenere la fattibilità di una tecnica Swiss-rolling modificate sono basate su precedenti studi sul ruolo del fattore Krüppel-like 5 (KLF5) nella manutenzione delle attivamente proliferanti cellule staminali epiteliali intestinali 14. KLF5 è un fattore di trascrizione zinc-finger che è altamente espresso nel gambo intestinale attiva e le cellule TA 12. Studi precedenti hanno dimostrato che KLF5 è co-espresso con Ki-67, un marker proliferativa nota nelle cripte intestinali.
La gastrointestinale TR atto non è un tessuto strutturalmente o funzionalmente omogeneo. L'intestino tenue è suddiviso in duodeno, digiuno, ileo e e crasso in cieco e del colon, con quest'ultimo suddiviso in prossimale, centrale, e le porzioni distali. Ognuna di queste sezioni ha caratteristiche istologiche uniche e svolge ruoli distinti 15. Come tali, gli effetti di insulti e il grado della risposta dell'epitelio intestinale possono dipendere regione di tessuto studiato 16. Inoltre, vari ceppi di topi dimostrano la diversità della risposta a livello istologico base al tipo di insulto usato negli studi 16. Così, si addice preparazione dei tessuti è necessario consentire istologica appropriata e analisi molecolare dei tessuti intestinali. Come tale, il Swiss extra analisi tecnica sovvenzioni della lunghezza completa dell'epitelio intestinale in una sola volta e quindi accerta conclusioni ben informati basate su informazioni complete.
e_content "> La tecnica Swiss-rotolo è stato menzionato da Magnus 17, e descritto in dettaglio da Moolenbeck e Ruitenberg and Park et al. come metodo per la preparazione di tessuti e l'esecuzione di analisi istologica del roditore dell'intestino 18,19 rispettivamente. Il protocollo delineato in questa pubblicazione presenta una versione migliorata del metodo originale che permette per la preparazione dei tessuti tempestive e affidabili per scopi diagnostici. questa tecnica modificata permette di collezioni e la preparazione del epitelio intestinale per le tecniche universalmente utilizzati, come immunoistochimica, immunofluorescenza, così efficienti come ibridazione in situ (fluorescente e cromogenico 20). Inoltre, il tessuto modificato provino metodo di preparazione utilizza reagenti facilmente disponibili e relativamente poco costoso, mentre offrono un metodo di fissaggio del tessuto rapida e permette il recupero di proteine, DNA e RNA per valutazione supplementare. Tratto insieme, thitecnica s è eccellente per la valutazione completa delle caratteristiche istopatologiche, patologiche e molecolari del epitelio intestinale.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. topi
- Tutti gli studi che coinvolgono i topi sono stati approvati dal Comitato Stony Brook University Istituzionale cura degli animali e Usa (IACUC). I topi sono stati mantenuti in un ciclo luce-buio 12:12 hr.
- Commercialmente ottenere C57BL 6 topi /. Ottenere C57BL / 6 topi portatori alleli Klf5 fiancheggiati da siti loxP (Klf5 f l / f l). Questi topi sono stati precedentemente descritti 21 e gentilmente forniti dal Dr. Ryozo Nagai.
- Acquisto C57BL / 6 topi portatori del gene inducibile Cre ricombinasi sotto controllo del promotore Lgr5 (topi Lgr5-EGFP / CreERT2).
- Per stabilire Lgr5-EGFP / créer T2 / Klf5 f l / f l topi, attraversare Klf5 fl / f topi l con topi Lgr5-EGFP / créer T2 e quindi backcross la progenie di Klf5 fl / f l topi.
- Topi Trattare con tamoxifene come da protocollo descritto in precedenza 22. Iniettare topi di controllo sperimentale e 8 settimane di età intraperitoneale (IP) con 1 mg di tamoxifene (10 mg / ml), disciolto in olio di mais sterili, per 5 giorni consecutivi.
- Il giorno 14 dopo la prima iniezione tamoxifene, sacrificare i topi con CO 2 asfissia mettendoli in una camera collegata al CO 2 fonte di gas. Lasciare che il gas di fluire nella camera fino a quando i topi sono inconscio e tutti i movimenti cessa. Per garantire l'eutanasia eseguire dislocazione cervicale.
2. Preparazione del tessuto e Swiss rotolamento
- Utilizzando pinze dissezione e forbici, tagliare un'incisione nella pelle del lato addominale. Con un paio di pinze, tenere la pelle in incisione e tirare delicatamente via dal tessuto muscolare addominale. Utilizzare un paio di forbici per tagliare la pelle addominale ed esporre i muscoli addominali.
- Tenere e tirare su la peritoneum con le pinze. Assicurarsi di non essere in possesso e tirando l'intestino. fare attenzione un'incisione nel tessuto peritoneale e continuare a tagliare via la pelle per esporre i muscoli addominali. fare attenzione un'incisione nei muscoli addominali e continuare a tagliare via per esporre l'intestino.
- Identificare i due punti e tracciare fino alla fine distale dove si unisce il retto / ano. Con un paio di forbici, tagliare il più vicino all'apertura anale possibile.
- Identificare lo stomaco e tracciare dove si unisce con il piccolo intestino. Con un paio di forbici, tagliare liberare l'intestino di circa 1 cm di distanza dallo stomaco. Trasferire l'intera lunghezza del piccolo intestino e colon liberato ad un piatto pulito Petri contenente tampone fosfato salino (PBS).
- Con una mano o un paio di pinze, tenere l'estremità distale del colon e utilizzare l'altra mano per svelare delicatamente l'intera lunghezza del colon da qualsiasi tessuto connettivo e / o grasso mesenterico.
- Identificare il cieco(Piccolo sacchetto tra intestino tenue e crasso) e tagliare dove il cieco e il colon uniscono (l'estremità prossimale del colon) per liberare il colon.
- Con una mano o un paio di pinze, tenere il piccolo intestino e utilizzare l'altra mano per svelare delicatamente l'intera lunghezza del piccolo intestino da qualsiasi tessuto connettivo e / o grasso mesenterico. Tagliare il cieco e scartare se non c'è bisogno.
Nota: Il processo può essere fermato qui incubando intestini sezionati in modificato fissativo di Bouin (50% etanolo / 5% di acido acetico in dH 2 O) durante la notte e continuare la procedura del giorno successivo. - Manipolazione un segmento di intestino (intestino tenue o del colon), riempire una siringa da 10 ml con fissativo modificata di Bouin e inserire un ago sonda gastrica ad esso. Inserire l'ago circa mezzo centimetro nell'apertura anteriore del segmento intestinale.
- Tenere l'ago sonda gastrica all'interno del segmento intestinale mediante l'applicazione di una pressione decisa con uno strumentosul segmento intestinale. Con l'altra mano che tiene la siringa, esercitare una leggera ma consistente pressione svuotare il contenuto del segmento intestinale utilizzando fissativo modificata di Bouin. Questa fase consente pulizia simultanea del segmento intestinale e fissaggio immediato. Utilizzare una capsula di Petri per raccogliere i rifiuti flow-through. Fixation può osservare dal colore colon tornitura opaco.
Nota: Assicurarsi di non applicare troppa pressione durante il lavaggio o il segmento intestinale potrebbe scoppiare aperta. - Utilizzando le forbici, tagliare aprire il segmento intestinale longitudinalmente lungo la linea mesenterica. Tenerlo con un paio di pinze e sciacquare brevemente in una capsula di Petri contenente PBS.
- Tagliare il piccolo intestino in 3 segmenti uguali: prossimale, medio e distale. Il segmento prossimale è quello immediatamente dopo lo stomaco, e il segmento distale è quella immediatamente prima del colon. Il segmento prossimale è equivalente al duodeno, la metà a digiuno, e distale perl'ileo.
- Per ogni segmento segnare prossimale e l'estremità distale. L'estremità prossimale è quella che originariamente rivolta verso lo stomaco, e distale puntato verso il colon.
- Usare la parte superiore di un piatto Petri per posizionare il segmento intestinale puliti e aperto. Posizionare il segmento intestinale con il lato luminale rivolto verso l'alto.
- Per il colon, identificare il lato luminale dalle screziature / creste che attraversano la sua larghezza e sono presenti alla fine prossimale. Le regioni medie e distali hanno alcuni variegature che corrono longitudinalmente. Per il piccolo intestino, identificare il lato luminale dalla superficie ruvida-apparire, che segna il villi.
Nota: Per il piccolo intestino, non ci sono macroscopici delimitazione anatomica esterna prossimale, centrale e le regioni distali. Tuttavia queste regioni possono essere identificate possono nelle sezioni al microscopio. I villi sono più lungo della regione prossimale e diventano via via più breve distale dove sonola più breve in lunghezza. Microscopicamente, le cripte del colon sono più breve nella regione prossimale che può anche essere identificata dalla presenza di creste. Le cripte del colon sono più alto nella parte centrale e più brevi nella regione distale ma ancora più alto nella regione prossimale.
- Per il colon, identificare il lato luminale dalle screziature / creste che attraversano la sua larghezza e sono presenti alla fine prossimale. Le regioni medie e distali hanno alcuni variegature che corrono longitudinalmente. Per il piccolo intestino, identificare il lato luminale dalla superficie ruvida-apparire, che segna il villi.
- Procedere con Swiss rotolare i due punti:
- Mantenere il colon piatta aperto e tirarlo con una pinza dalla sua estremità prossimale verso il bordo del piatto Petri.
- Mantenere lato luminale rivolto verso l'alto e l'estremità prossimale con la pinza con una mano e con l'altra mano tenere uno stuzzicadenti.
- Avvolgere il bordo della estremità prossimale intorno al stuzzicadenti con le pinze e un po 'pizzicare il bordo avvolto contro il stuzzicadenti per tenerlo in posizione.
- Delicatamente e lentamente iniziare a rotazione lo stuzzicadenti con le dita per rotolare i due punti intorno lo stuzzicadenti in modo da formare un rotolo svizzero.
- Una volta che l'intera lunghezza del colon è stato arrotolato, usare un paio di pinze a scivolare con attenzione il colon Swiss roll off lo stuzzicadenti e in un tessuto di elaborazione / cassette -embedding. Inserire la cassetta in 10% formalina tamponata notte a temperatura ambiente.
- Procedere con Swiss rotolare il piccolo intestino:
- Manipolazione un segmento alla volta, tenere il tratto piano aperto con lato luminale e tirarlo con una pinza dalla sua estremità prossimale verso il bordo del piatto Petri.
- Procedere con rotolamento Swiss come descritto per il colon.
- Procedere con l'elaborazione di tessuti fissati in formalina per paraffina. Procedere come segue:
NOTA: utilizzare un processore automatizzato (vedi Materiali e attrezzature per i dettagli).- Mentre il tessuto è nella cassetta, lavare tessuti con PBS fino fissativo viene completamente rimosso.
- Disidratare tessuto con etanolo nella seguente sequenza: 50% di etanolo per 10 min, 70% di etanolo per 10 min, 80% di etanolo per 10 min, 95% di etanolo per 10 minuti, 100% di etanolo per 10 min, 100% di etanolo per 10 min e 100% di etanolo per 10 min.
- Scambio etanolo con xilene nella seguente sequenza: 2: 1 etanolo: xilene per 10 - 15 min, 1: 1 etanolo: xilene per 10 - 15 min, 1: 2 etanolo: xilene per 10 - 15 min, 100% xilene per 10 - 15 min, 100% xilene per 10 - 15 minuti, e il 100% xilene per il 10 - 15 min. ATTENZIONE: xilene è un pericolo per la salute, così il posto di lavoro dovrebbe essere dotato di un sistema di aspirazione locale con una corretta cappuccio e l'attrezzatura di protezione deve essere indossato dal personale.
- xilene Exchange con paraffina. Effettuare le seguenti operazioni in un forno sotto vuoto impostato al 54 - 58 ° C: 2: 1 xilene: paraffina per 30 min, 1: 1 xilene: paraffina per 30 min, 1: 2 xilene: paraffina per 30 minuti, 100% paraffina 1 - 2 ore, e il 100% di paraffina per 1 - 2 ore o durante la notte.
Nota: Non lasciate che la paraffina superi i 60 ° C per lunghi periodi di tempo perché questo si degradano i polimeri di paraffina e rendono difficile e fragile. - Incorporare nel nuovo paraffina e orientare tessuto fresco come dedesiderato prima la paraffina indurisce. Per i rulli svizzeri, seguendo paraffinization tessuti, è importante riposizionare ogni rotolo sul suo lato durante incorporamento paraffina. Ciò garantisce che durante il taglio, saranno prodotte sezioni della intera lunghezza di ogni rullo.
- Per la colorazione, taglio a 5 micron sezioni spesse con microtomo. Raccogliere sezioni su vetrini carichi e (bake) asciugare in un forno a 65 ° C durante la notte; lasciare raffreddare a temperatura ambiente e successivamente utilizzato per la colorazione.
Nota: Il tempo di cottura può essere ridotto a 1 - 2 ore a seconda di come appena tagliata le diapositive sono. Se meno di un mese da sezionamento, allora è consigliabile cuocere durante la notte. Se è stato più di un mese, poi 1 - 2 ore di cottura è sufficiente per risparmiare tempo. Se a corto di tempo, il sostegno durante la notte può sempre essere utilizzato.
3. analisi istologica e immunofluorescenza colorazione
Eseguire l'analisi istologica e immunofluorescence colorazione come precedentemente descritto 23,24, con modifiche. Per la proteina fluorescente verde (EGFP) immunofluorescenza:
- Cuocere le diapositive di una C forno a 65 ° per 1 ora per inattivare endogena fosfatasi alcalina e successivamente Deparaffinare in xilene.
- Incubare le sezioni in un bagno di perossido di idrogeno al 3% in metanolo di bloccare perossidasi endogene di tessuto; poi reidratare mediante incubazione in una serie decrescente vasca alcool (100%, 95%, 70%) seguita da antigene recupero in soluzione tampone citrato (10 mM citrato di sodio, 0,05% Tween-20, pH 6,0) a 125 ° C per 10 min utilizzando una camera decloaking.
- Disegnare un cerchio attorno sezioni di tessuto usando pennarello che fornisce barriera idrofobica e incubare sezioni con tampone di bloccaggio (albumina sierica bovina 2,5% BSA [] in TBS-Tween) per 30 minuti a 37 ° C e poi con anticorpo primario contro EGFP (diluizione 1 : 500) a 4 ° C per una notte in una camera umidificata agitatore.
- Lavare sezioni e incubare con anticorpo secondario fluorescente-tag alla concentrazione appropriata per 30 min a 37 ° C.
- Lavare i vetrini dopo secondarie di trattamento di anticorpi e macchia nuclei con Hoechst e montare con mezzi di montaggio.
- Per Klf5 / EGFP / Ki-67 co-colorazione, i vetrini di processo come descritto ai punti 3.1 - 3.3 ed eseguire Klf5 colorazione incubando con anticorpo Klf5 (diluizione 1: 150) durante la notte.
- Applicare coniglio rilevamento polimero AP alle diapositive come da protocollo.
- Rivela Klf4 colorazione utilizzando cromogeno colorazione immunoistochimica secondo il protocollo del produttore.
- Eseguire eluizione degli anticorpi utilizzando il protocollo descritto in precedenza 25. Incubare i vetrini a 50 ° C in Glycine-SDS (pH 2,0) la soluzione sotto agitazione per 1 ora.
- Lavare i vetrini accuratamente con acqua distillata e incubare con tampone di bloccaggio (2,5% BSA in TBS-Tween) per 30 minuti a 37 ° C.
- Aggiungere Ki-67 (diluizione 1: 500) e EGFP (diluizione 1:500) anticorpi simultaneamente e incubare a 37 ° C per 1 ora.
- Eseguire il rilevamento fluorescente con anticorpi secondari appropriati prima colorazione con Hoechst (dati non mostrati) e montare con mezzo di montaggio.
- Osservare la morfologia istologica dei tessuti sulla colorazione sezioni 5 micron con ematossilina e eosina (H & E) 26. Per le immagini a fluorescenza, utilizzare le lunghezze d'onda di emissione di 535, 646, e 700 di visualizzare EGFP, Klf5, e Ki-67 colorazione, rispettivamente.
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Representative Results
La tecnica di laminazione svizzero in combinazione con colorazione immunoistochimica permette di un'analisi completa del tessuto intestinale piccola o grande. L'esempio di colorazione H & E di un crasso di un C57BL / 6 del mouse (figura 1) è un esempio di fattibilità e l'efficacia di questa tecnica. Come mostrato in figura 1, l'immagine è in grado di catturare tutte le porzioni del colon: prossimale, medio e distale. Così, permette per valutazione globale istologica. Il rotolamento svizzero e la capacità di catturare l'intera lunghezza del piccolo o grande tessuto intestinale è estremamente utile per l'espressione genica eterogeneo e marcatore colorazione o una risposta variabile del tessuto intestinale per l'insulto.
Un esempio è il pattern di colorazione EGFP nei topi Lgr5-EGFP / créer T2. In questo modello di topo, espressione di EGFP è guidato dalPromoter Lgr5, che è attivo solo nelle cripte intestinali attivamente proliferanti. Inoltre, questo modello di topo è caratterizzato da bassa (circa 5 - 10%) penetranza di espressione del transgene. Come mostrato in figura 2, il pattern di espressione EGFP nel tessuto intestinale è variabile. Di conseguenza, la capacità di catturare una visuale del tessuto aiuta a identificare la regione di interesse.
La tecnica qui descritta è particolarmente potente con applicazione di multifluorophore colorazione. Qui vi mostriamo un esempio di trifluorophore colorazione del tessuto intestinale che è stato preparato con la tecnica svizzero extra. L'obiettivo principale di questo studio è stato quello di indagare il ruolo della Klf5 nel mantenimento delle cellule staminali intestinali che esprimono Lgr5 marcatore. Pertanto, abbiamo cancellato Klf5 dalle cellule staminali intestinali Lgr5-positive nei topi Lgr5-EGFP / créer T2 e raccolto tessuti intestinali in giorno14 dopo la prima iniezione tamoxifene. Per l'analisi immunoistochimica, i tessuti sono stati preparati secondo il protocollo presentato in questo manoscritto, e la colorazione per EGFP (Lgr5 marcatore), Klf5, e Ki-67 è stato eseguito. Nei topi di controllo, indicati come Lgr5-EGFP / créer T2, sia EGFP-positivi (segnato con frecce blu) e cripte EGFP-negativi (segnato con frecce bianche) esposto co-colorazione per Klf5 e Ki-67 in due punti temporali esaminati , come mostrato in Figura 3D. Al contrario, in Lgr5-EGFP / créer T2 / Klf5 fl / fl piccolo tessuto intestinale, Klf5 / Ki-67 co-colorazione mancava dalle cellule staminali CBC EGFP-positivi (segnato da frecce blu), ma presente nella EGFP-negativi cripte adiacenti cripte verdi (contrassegnati da frecce bianche), come mostrato in Figura 3H. Questo è un esempio eccellente che le tecniche di preparazione dei tessuti presentate qui non influenzano negativamente la qualità della colorazione.
Figura 1. H & E colorazione di un crasso da un C57B L / 6 Mouse. Mostrato è l'immagine composita di tutta la lunghezza del colon. La porzione tra la freccia nera e la linea nera indica la parte prossimale, tra le righe nere e arancio segna la metà, e tra la linea arancione e freccia arancione segna la parte distale del grosso intestino. Scala bar = 1,000 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. immunofluorescenza colorazione di un piccolo intestino di un / créer T2 mouse Lgr5-EGFP. Immagine composita di EGFP (cellule epiteliali etichettatura Lgr5-positivi) colorazione di piccole sezioni intestine di un mouse Lgr5-EGFP / créer T2. Esempio di eterogenea immunofluorescenza di proteina marker (EGFP) che etichetta le cellule epiteliali Lgr5-postive nelle cripte del mouse Lgr5-EGFP / créer T2. I nuclei sono visualizzati con Hoechst. frecce bianche indicano cripte positivi per l'espressione EGFP. Scala bar = 500 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Klf5 Soppressione in Lgr5-EGFP / créer T2 / Klf5 fl / fl Mice persiste a lungo termine nelle cripte Lgr5-EGFP-positivi. T2 e Lgr5-EGFP / créer T2 / Klf5 fl / fl topi al giorno 14 giorni dopo la prima iniezione tamoxifene, rispettivamente. Pannelli dC sono rappresentativi di colorazione da tessuto raccolti da topi di controllo Lgr5-EGFP / créer T2, mentre i pannelli EH spettacolo colorazione rappresentativi di Lgr5-EGFP / créer T2 / Klf5 fl / fl topi. Pannelli A e E visualizzazione Klf5 immunofluorescenza colorazione in rosso; Pannelli B e F mostrano colorazione EGFP nel verde; Pannelli C e G spettacolo Ki-67 colorazione in giallo; e pannelli D e H mostrano immagini di Klf5, EGFP e Ki-67 macchie fuse. Le frecce blu indicano cripte verdi; frecce bianche indicano cripte non verde nelle immagini fuse. Lgr5-EGFP / créer T2 / Klf5 fl / fl topi hanno mostrato perdita a lungo termine Klf5 solo nelle cellule CBC EGFP-marcato 14. Barra di scala = 50 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
La tecnica di laminazione svizzero è un metodo efficace per la preparazione di tessuto intestinale per la valutazione istologica e morfologica su larga scala. In contrasto con la tecnica precedentemente descritta Swiss-rotolamento, che è stato originariamente sviluppato per la preparazione delle sezioni congelate 18,19, la procedura qui presentata consente rapida preparazione tessuto intestinale e la fissazione per fissazione in formalina e paraffina (FFPE). Rispetto ai tessuti congelati, tessuto FFPE ha durata molto più lunga ed è il tipo preferito di tessuto per l'analisi istologica causa di una migliore integrità dei tessuti. Le parti critiche del protocollo Swiss-rotolamento riguardano la flessibilità del tessuto per la laminazione e mantenere l'integrità svizzero-roll e la qualità dei tessuti per la colorazione postfixation. La tecnica Swiss extra standard per FFPE del tessuto intestinale è tipicamente laborioso e lungo (2 giorni) 18,19. Inoltre, questo metodo standard fornisce generalmente tessuto intestinale che è relatively rigida e non facile da formare in un rotolo svizzero. Questo perché è richiesto notte di incubazione del tessuto intestinale sezionato in 10% formalina tamponata prima della rullatura tessuto. Altre modifiche della tecnica per scopi FFPE Sono state sviluppate anche, ma hanno un grave problema della tendenza del tessuto intestinale srotolare e / o per il centro del rotolo per essere distorto. Questo perché il tessuto utilizzati in queste tecniche è tessuto non fissato fresco, che è scivoloso dal muco prodotto dall'intestino. La nuova tecnica modificata mostrato qui supera questi problemi utilizzando una forma modificata di fissativo di Bouin. fissativo originale di Bouin costituito da una miscela di acido acetico, etanolo, acido picrico e paraformaldeide (o formalina). I due componenti più pericolosi, acido picrico e paraformaldeide (o formalina), sono state eliminate per consentire l'uso molto più sicuro del fissativo con una miscela di acido / etanolo acetico. L'acido picrico presenta un rischio di esplosione, e paraforformaldeide (o formalina) è un rischio di cancro. L'importanza di usare il modificato fissativo di Bouin è che (1) è meno pericolosa rispetto alla sua formula originale, (2) è facile da preparare con reagenti relativamente nonexpensive che sono facilmente disponibili in molti laboratori, e (3) permette una rapida, quasi istantanea, fissazione del tessuto quando viene utilizzato per il lavaggio. A conoscenza, non esistono limiti noti per utilizzare questa tecnica modificata. Inoltre, il fissaggio rapido con questa miscela riduce enormemente la scivolosità del tessuto intestinale, permettendo laminazione tessuto molto più veloce e più facile. Questo fissativo consente anche di eccellente conservazione dell'integrità dei tessuti e delle cellule per l'analisi istologica e immunocolorazione. Così, in confronto ad altri metodi di preparazione tessuto intestinale, questa tecnica perfezionata supera diversi problemi tecnici e sovvenzioni notevolmente migliorata velocità e facilità d'uso.
Inoltre, questo fissativo modificato è utile da usare con altre di spessoretessuti che richiedono la fissazione rapida. A causa della natura di acido acetico e di etanolo, che hanno la capacità di rapida penetrazione del tessuto spesso, mentre allo stesso tempo in fase di fissaggio. Abbiamo usato con successo per risolvere rapidamente il tessuto di spessore come fegato, milza e reni. Ad esempio, la fissazione di un fegato intero topo adulto utilizzando il modificato fissativo di Bouin viene solitamente raggiunta entro 15 - 20 min. Questo può essere facilmente giudicato tagliando una sezione trasversale nel fegato e osservando se le regioni profonde del fegato avevano cambiato colore da rosso sangue al grigio. Il cambiamento di colore è indicativo di fissazione. Questa fissazione è seguito da reticolazione utilizzando formalina tamponata per 24 - 48 ore senza timore di composizione alterata cellule / tessuti, come il tessuto è già fissato a questo punto.
In confronto, il tradizionale metodo di fissazione tamponata e formalina uso solo su un fegato intero topo adulto richiederebbe 24-48 ore per raggiungere fixati tessuti profondion, con il rischio di alterata composizione cellulare del tessuto profondo. I metodi di fissaggio rapido di tessuti spessi ha il vantaggio superiore di ridurre al minimo l'alterazione dei componenti cellulari in risposta a condizioni di stress, come ipossia, dopo la rimozione dell'organo / tessuto dal corpo. Prevediamo che il fissativo modificato può essere utilizzato in perfusione animale come un modo ancora più veloce di fissare spessore dei tessuti / organi è desiderato. Così, in conclusione, questo metodo e fissativo modificato forniscono diversi vantaggi rispetto ai metodi tradizionali utilizzati per la raccolta tessuto intestinale e fissazione e il fissativo modificato può essere utilizzato per risolvere rapidamente altre spessi tessuti / organi.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stainless Steel Dissecting Kits | VWR | 25640-002 | |
| Decloaking Chamber | Biocare Medical | DC2012 | |
| Syringe 10 ml | VWR | 89215-218 | |
| Swingsette Tissue embedding/processing cassette with lid | Simport | M515 | |
| Superfrost Plus Slides [size: 25 x 75 x 1 mm] | VWR | 48311-703 | |
| Manual Slide Staining Set | Tissue-Tek/Sakura | 4451 | |
| Staining Dish Green | Tissue-Tek/Sakura | 4456 | |
| Staining Dish White | Tissue-Tek/Sakura | 4457 | |
| 24-Slide Slide Holder with Detachable Handle | Tissue-Tek/Sakura | 4465 | |
| Oven | Thermo Scientific | 6243 | for baking slides at 65 degree |
| Dissection microscope | Zeiss | Stemi 2000C | |
| Fluorescence Microscope | Nikon | Eclipse 90i | Bright and fluoerescent light, with objectives: 10X, 20X |
| PAP Pen Super-Liquid Blocker Mini | Fisher Scientific | DAI-PAP-S-M | |
| Ethanol 200 proof | AAPR | 111000200 | |
| Methanol | VWR | BDH1135-4LP | |
| Glacial acetic acid | AAPR | 281000ACS | |
| Xylene | Fisher Scientific | X5P-1GAL | |
| Hydrogen peroxide 25% solution in water | ACROS | 202465000 | |
| 10% bufered formalin | Fisher Scientific | 22-026-213 | |
| Bovine serum fraction V, heat shock | Roche | 3116956001 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P7949 | |
| Sodium citrate | Fisher Scientific | S279 | |
| Gavage needle | VWR | 20068-624 | |
| Rabbit anti Klf5 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-22797 | Dilution 1:150 |
| Chicken anti EGFP antibody | Millipore | AB16901 | Dilution 1:500 |
| Rabbit anti Ki67 antibody | Biocare Medical | CRM325B | Dilution 1:500 |
| Mach3 rabbit AP polymer detection kit | Biocare Medical | M3R533L | |
| Warp red chromogen kit | Biocare Medical | WR806 H | |
| Lgr5-EGFP/CreERT2 mice | Jackson labs | 008875 | |
| Automated processor | Leica | Leica TP1020 |
References
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