Summary
A identificação precisa e localização de células epiteliais ao longo da mucosa intestinal são essenciais para definir diferentes linhagens celulares. imagiologia adequado dos tecidos intestinais é crucial para a identificação de padrões de expressão de proteínas com uma resolução máxima. Este estudo visa delinear os métodos ótimos e as condições de processamento do mouse tecidos intestinais.
Introduction
O epitélio intestinal de mamífero compreende uma única camada de células colunares. No intestino delgado, as células proliferativas são confinados às criptas enquanto que as células diferenciadas ocupar a região da vilosidade. No entanto, porque não há nenhum vilosidades no intestino grosso, as células proliferativas são localizadas na parte inferior das criptas e células diferenciadas ocupar a região superior das criptas. O epitélio intestinal sofre reposição rápida (cerca de 3-5 dias) que é accionado por divisão contínua das células proliferativas nas criptas. As células proliferativas das criptas não são uma população homogénea e são ainda subdivididas em células estaminais e células-amplificação de trânsito (TA) 1. As células estaminais reside na parte inferior da cripta, dentro das primeiras 4 - 5 células a partir da parte inferior 2. O modelo atual suporta a existência de dois tipos de células-tronco: as células-tronco da cripta colunar base (CBC) e de reserva de células estaminais quiescentes. A CBC scélulas dez estão se proliferando de forma activa e são marcados por rica em leucina contendo repetição G-proteína receptor acoplado 5 (Lgr5) 3, Olfactomedin 4 (Olfm4) 4 e Achaete scute-like 2 (Ascl2) 5. Por outro lado, as células estaminais quiescentes de reserva são rotulados por Moloney site B específico da célula vírus da leucemia murina de integração 1 (Bmi1) 6, a telomerase rato transcriptase reversa (mTert) 7, HOP homeobox (Hopx) 8, duplacortina-like e CAM Kinase -como 1 (Dclk1) 9, e leucina-ricos repete e do tipo imunoglobulina domínios 1 (Lrig1) 10. As células estaminais que proliferam activamente dar origem a células TA, em seguida, submetido a posterior diferenciação em células absortivas (enterócitos) e células secretoras (enteroendócrinas, caliciformes, células de Paneth e flocos). divisão celular contínua na zona proliferativa resulta em movimento ascendente de células epiteliais ao longo do eixo de cripta-vilosidade até atingirem a parte superior da vilosidade, onde eles sofrem apoptose e sãodescartadas a partir da superfície do epitélio. Os diferentes tipos de células epiteliais intestinais estão marcados pela expressão de proteínas diferentes (por exemplo, células caliciformes intestinais podem ser reconhecidos através de coloração com anticorpo contra células de Paneth MUC2 e com anticorpo contra lisozima). Nós estudar o papel de factores como Krüppel-(KLFs) na homeostase e patobiologia do epitélio intestinal 11-13. Os resultados aqui apresentados apoiar a viabilidade de uma técnica de laminagem Swiss modificado baseiam-se em estudos anteriores sobre o papel do factor-Krüppel como 5 (KLF5) na manutenção das proliferam activamente células estaminais epiteliais intestinais 14. KLF5 é um factor de transcrição dedo de zinco que é altamente expresso na haste intestinal activa e 12 alvéolos Ta. Estudos anteriores demonstraram que KLF5 é co-expressa com Ki-67, um marcador conhecido proliferativa nas criptas intestinais.
O tr gastrointestinal ato não é um tecido estruturalmente ou funcionalmente homogénea. O intestino delgado é dividido em duodeno, jejuno e íleo e o intestino grosso no ceco e no cólon, com esta última ainda divididas em segmentos proximal, médio e distal. Cada uma destas secções tem características histológicas únicas e desempenha papéis distintos 15. Como tal, os efeitos de insultos e o grau de resposta do epitélio intestinal pode depender da região de tecido estudado 16. Além disso, várias estirpes de ratos demonstrar a diversidade da resposta ao nível histológico com base no tipo de insulto utilizado nos estudos 16. Assim, condizente com a preparação do tecido é necessário para permitir histológico apropriado e análise molecular dos tecidos intestinais. Como tal, a-rolo suíço análise bolsas técnica de todo o comprimento do epitélio intestinal de uma só vez e, assim, verifica conclusões bem informadas com base numa informação global.
e_content "> A técnica Swiss-rolo foi mencionado pela primeira vez por Magnus 17, e descrito em detalhe por Moolenbeck e Ruitenberg e Park et al., como um método para a preparação de tecidos e realizando análises histológicas do intestino roedor 18,19, respectivamente. O protocolo delineada na presente publicação apresenta uma versão melhorada do método original que permite a preparação do tecido oportuna e confiável para fins de diagnóstico. esta técnica modificada permite coleções e preparação do epitélio intestinal de técnicas universalmente utilizados, tais como imuno-histoquímica, imunofluorescência, bem eficientes como hibridação in situ (fluorescente e cromogénico 20). Além disso, o tecido modificado espécime método de preparação utiliza reagentes facilmente disponíveis e relativamente pouco dispendiosos, enquanto que oferecem um método de fixação rápida dos tecidos e permite a recuperação de proteína, ADN e ARN para a avaliação adicional. Tomados juntos, this técnica é excelente para avaliação abrangente dos aspectos histopatológicos, patológicas e moleculares do epitélio intestinal.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Ratos
- Todos os estudos envolvendo ratos foram aprovados pelo Comitê Animal Care Institucional e Use o Stony Brook University (IACUC). Os ratinhos foram mantidos num ciclo de luz-escuro 12:12 h.
- Comercialmente obter ratinhos C57BL / 6. Obter camundongos C57BL / 6 com alelos Klf5 flanqueadas por locais loxP (Klf5 f l / f l). Estes ratos foram previamente descritos 21 e graciosamente cedido pelo Dr. Ryozo Nagai.
- Comprar camundongos C57BL / 6 portadores do gene induzível recombinase Cre sob regulação do promotor Lgr5 (ratos Lgr5-EGFP / CreERT2).
- Para estabelecer Lgr5-EGFP / creer T2 / Klf5 f l / f l ratos, atravessar Klf5 fl / f l camundongos com ratos / creer T2 Lgr5-EGFP e depois retrocruzamento a prole para Klf5 fl / f l ratos.
- Camundongos deleite com tamoxifeno como por o protocolo previamente descrito 22. Injectar 8 semanas de idade, os ratinhos de controlo e experimentais por via intraperitoneal (IP) com 1 mg de tamoxifeno (10 mg / mL), dissolvidos em óleo de milho estéril, durante 5 dias consecutivos.
- No dia 14 após a primeira injecção tamoxifeno, sacrificar os ratinhos utilizando asfixia com CO 2, colocando-os em uma câmara ligada ao CO 2 fonte de gás. Permitir que o gás flua para dentro da câmara até que os ratinhos são inconsciente e todo o movimento cessa. Para assegurar a eutanásia executar deslocamento cervical.
2. Preparação de tecidos e Swiss Rolamentos
- Utilizando fórceps de dissecção e uma tesoura, corte de uma incisão na pele do lado abdominal. Com um par de fórceps, segure a pele na incisão e puxe para fora do tecido do músculo abdominal. Utilizar um par de tesouras para cortar a pele abdominal e expor os músculos abdominais.
- Segurar e puxar para cima o peritoneum com a pinça. Certifique-se de não estar segurando e puxando os intestinos. Cuidadosamente fazer uma incisão no tecido peritoneal e continuar a cortar afastado da pele para expor os músculos abdominais. Cuidadosamente fazer uma incisão nos músculos abdominais e continuar cortando-a para expor os intestinos.
- Identificar os dois pontos e traço para a extremidade distai onde se junta o recto / ânus. Com um par de tesouras, cortar o mais próximo possível da abertura anal quanto possível.
- Identificar o estômago e de rastreio, onde se junta com o intestino delgado. Com uma tesoura, corte libertar o intestino cerca de 1 cm de distância do estômago. Transferir todo o comprimento do intestino delgado e cólon libertado para uma placa de Petri limpa contendo solução salina tamponada com fosfato (PBS).
- Com uma mão ou um par de fórceps, segure a extremidade distai do cólon e utilizar a outra mão para desvendar suavemente todo o comprimento do cólon a partir de qualquer tecido conjuntivo e / ou gordura mesentérica.
- Identificar o ceco(Pequena bolsa entre o intestino delgado e grosso) e cortar onde o ceco e no cólon join (a extremidade proximal do cólon) para libertar no cólon.
- Com uma mão ou um par de fórceps, segurar o intestino delgado e utilizar a outra mão para desvendar suavemente todo o comprimento do intestino delgado a partir de qualquer tecido conjuntivo e / ou gordura mesentérica. Cortar o ceco e descarte se não houver necessidade.
Nota: O processo pode ser interrompido aqui por incubação dos intestinos dissecados em fixador de Bouin modificada (50% de etanol / 5% ácido acético em dH 2 O) durante a noite e continuar o procedimento no dia seguinte. - Manipulação de um segmento do intestino (intestino delgado ou do cólon), encher uma seringa de 10 ml com fixador de Bouin modificado e anexar uma agulha de gavagem a ele. Inserir a agulha cerca de meio centímetro na abertura anterior do segmento intestinal.
- Segurar a agulha de gavagem no interior do segmento intestinal por aplicação de uma pressão firme com um instrumentono segmento intestinal. Com a outra mão segura a seringa, aplique pressão suave, mas consistente para liberar o conteúdo do segmento intestinal usando fixador modificado de Bouin. Este passo permite que a limpeza simultânea do segmento intestinal e fixação imediata. Use uma placa de Petri para recolher os resíduos de fluxo. A fixação pode ser observado pela cor cólon transformando opaco.
Nota: Certifique-se de não aplicar muita pressão durante a lavagem ou o segmento intestinal poderia estourar aberto. - Com uma tesoura, cortar abrir o segmento intestinal longitudinalmente ao longo da linha mesentérica. Segure-o com um par de fórceps e lave-o brevemente em uma placa de Petri contendo PBS.
- Cortar o intestino delgado em 3 segmentos iguais: proximal, médio e distal. O segmento proximal é a um imediatamente a seguir ao estômago, e o segmento distai é a única imediatamente antes do cólon. O segmento proximal é equivalente para o duodeno, o meio para o jejuno, eo distalo íleo.
- Para cada segmento de marcar as extremidades proximal e a extremidade distal. A extremidade proximal é a que foi inicialmente apontando para o estômago, e distal apontou para o cólon.
- Usar a parte superior de uma placa de Petri para colocar o segmento intestinal limpa e aberta. Colocar o segmento intestinal com o lado luminal voltada para cima.
- Para o cólon, identificar o lado luminal pelos variegations / nervuras correndo através da sua largura e estão presentes na extremidade proximal. As regiões médias e distais têm algumas variegations que correm longitudinalmente. Para o intestino delgado, identificar o lado luminal por a superfície áspera de aparência, que marca as vilosidades.
Nota: Para o intestino delgado, não há a demarcação anatómica macroscópica externo proximal, médio e distal. No entanto, estas regiões podem ser podem ser identificados em secções sob o microscópio. As vilosidades são mais longa na região proximal e tornar-se gradualmente mais curto distally onde eles estãoo mais curto em comprimento. Microscopicamente, as criptas do cólon são mais curtos na região proximal que também pode ser identificado pela presença de saliências. As criptas colônicas são o mais alto no meio e mais curto na região distal e ainda mais alto do que na região proximal.
- Para o cólon, identificar o lado luminal pelos variegations / nervuras correndo através da sua largura e estão presentes na extremidade proximal. As regiões médias e distais têm algumas variegations que correm longitudinalmente. Para o intestino delgado, identificar o lado luminal por a superfície áspera de aparência, que marca as vilosidades.
- Prossiga com a Swiss rolando o cólon:
- Manter o cólon plana aberta e puxá-lo com uma pinça a partir da sua extremidade proximal para a extremidade da placa de Petri.
- Mantenha lado luminal voltado para cima e segure a extremidade proximal com a pinça com uma mão e com a outra mão segure um palito.
- Enrole a borda da extremidade proximal em torno do palito usando a pinça e um pouco beliscar a ponta envolto contra o palito para segurá-la no lugar.
- Suave e lentamente começar a rolar o palito com os dedos para rolar os dois pontos em torno do palito para formar um rolo suíço.
- Uma vez que todo o comprimento do cólon tem sido enrolado, use um par de fórceps para deslizar cuidadosamente o cOlon Swiss roll off o palito e em um tecido de processamento / cassete Embedding. Coloque a gaveta em 10% de formalina tamponada durante a noite à temperatura ambiente.
- Prossiga com a Swiss rolando o intestino delgado:
- Manipulação de um segmento de cada vez, manter o segmento plano aberto com o lado luminal para cima e puxe-o com uma pinça de sua extremidade proximal em direção à borda da placa de Petri.
- Continuar com a laminagem do Swiss tal como descrito para o cólon.
- Prosseguir com o processamento de tecidos fixados em formalina para inclusão em parafina. Proceda da seguinte forma:
NOTA: Use um processador automatizado (ver Materiais e equipamentos para obter detalhes).- Enquanto o tecido está na cassete, lavar o tecido com PBS até fixador é completamente removido.
- Desidratar o tecido utilizando etanol na sequência seguinte: 50% de etanol durante 10 min, 70% de etanol durante 10 min, 80% de etanol durante 10 min, 95% de etanol durante 10 min, 100% de etanol durante 10 min, 100% de etanol durante 10 min , e 100% de etanol durante 10 min.
- etanol Exchange com xileno na seguinte sequência: 2: 1 de etanol: xileno durante 10 - 15 min, 1: 1 de etanol: xileno durante 10 - 15 min, 1: 2 de etanol: xileno durante 10 - 15 min, 100% de xileno para 10 - 15 min, 100% de xileno durante 10 - 15 min, e 100% de xileno durante 10 - 15 min. CUIDADO: O xileno é um perigo para a saúde, assim, o local de trabalho deve ser equipado com uma ventilação de exaustão local com um capuz adequada e o equipamento de protecção adequado deve ser usava por pessoal.
- xileno intercâmbio com parafina. Executar os seguintes passos num forno de vácuo regulado para 54-58 ° C: 2: 1 xileno: parafina, durante 30 min, 1: 1 xileno: parafina, durante 30 min, 1: 2 xileno: parafina, durante 30 min, 100% de parafina para 1 - 2 horas, e% de parafina 100 para 1 - 2 horas ou durante a noite.
Nota: Não deixe que a parafina superior a 60 ° C por períodos prolongados de tempo, porque isso irá degradar os polímeros de parafina e torná-lo duro e quebradiço. - Incorporar no novo tecido parafina e oriental fresco como dedesejado antes da parafina endurece. Para os rolos suíços, seguindo parafinização tecido, é importante para reposicionar cada rolo no seu lado durante a inclusão em parafina. Isso garante que, durante o corte, vão ser produzidas secções de todo o comprimento de cada rolo.
- Para a coloração, corte 5 mm de espessura usando micrótomo. Recolher as secções em lâminas carregadas e secá-las (bake) em um 65 ° C forno durante a noite; deixe esfriar à temperatura ambiente e subsequentemente utilizado para a coloração.
Nota: O tempo de cozedura pode ser reduzido para 1 - 2 horas dependendo de como acabada de cortar as lâminas são. Se menos de um mês desde o corte, então é aconselhável para assar durante a noite. Se ele tem sido mais de um mês, em seguida, 1-2 hr de bicarbonato é suficiente para poupar tempo. Se correndo contra o tempo, o apoio durante a noite pode ser sempre utilizado.
3. Análise histológica e por imunofluorescência Coloração
Realizar a análise histológica e immunofluorescence coloração como descrito anteriormente 23,24, com modificações. Para reforçada proteína verde fluorescente (EGFP) imunofluorescência:
- Coza os diapositivos num forno de 65 ° C durante 1 hora, para inactivar a actividade de fosfatase alcalina endógena e subsequentemente Desparafinar em xileno.
- Incubar secções em um banho de 3% de peróxido de hidrogénio em metanol para bloquear peroxidases endógenas de tecido; em seguida, re-hidratados por incubação em série decrescente banho de álcool (100%, 95%, 70%), seguido por recuperação de antigénios em solução tampão de citrato (10 mM de citrato de sódio, 0,05% de Tween-20, pH 6,0) a 125 ° C durante 10 min usando uma câmara decloaking.
- Desenhar um círculo em torno de secções de tecido utilizando pena de marcação que proporciona uma barreira hidrofóbica e incubar secções com um tampão de bloqueio (2,5% de albumina de soro bovino [BSA] em TBS-Tween) durante 30 min a 37 ° C e, em seguida, com o anticorpo primário contra EGFP (diluição 1 : 500) a 4 ° C durante a noite numa câmara humidificada, agitando suavemente.
- Lave os cortes e incubar com o anticorpo secundário fluorescente marcada com a concentração apropriada, durante 30 min a 37 ° C.
- Lavagem das lâminas após tratamento com o anticorpo e mancha núcleos secundários com Hoechst e montar com meios de montagem.
- Para Klf5 / EGFP / Ki-67 co-coloração, as lâminas de processo como descrito nas etapas 3.1 - 3.3 e realização da coloração Klf5 por incubação com anticorpo Klf5 (diluição 1: 150) durante a noite.
- Aplicar detecção de polímero AP coelho para slides como por protocolo.
- Revelar KLF4 coloração com coloração imuno-histoquímica cromógeno, conforme o protocolo do fabricante.
- Realizar a eluição do anticorpo utilizando o protocolo previamente descrito 25. Incubar as lâminas a 50 ° C em glicina-SDS (pH 2,0) solução com agitação durante 1 h.
- Lave as lâminas cuidadosamente com água destilada e incubar com um tampão de bloqueio (2,5% de BSA em TBS-Tween) durante 30 min a 37 ° C.
- Adicionar o Ki-67 (diluição 1: 500) e a EGFP (diluição 1:500) Anticorpos simultaneamente e incubar a 37 ° C durante 1 h.
- Realizar a detecção fluorescente com anticorpos secundários apropriados antes da coloração com Hoechst (dados não mostrados) e de montagem com meio de montagem.
- Observar a morfologia histológica dos tecidos na coloração seções 5 mícrons com hematoxilina e eosina (H & E) 26. Para imagens fluorescentes, usar comprimentos de onda de emissão de 535, 646 e 700 para visualizar EGFP, Klf5 e Ki-67 coloração, respectivamente.
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Representative Results
A técnica de rolamento suíça em combinação com coloração imuno-histoquímica permite a análise abrangente do tecido intestinal pequeno ou grande. O exemplo de coloração de H & E de um intestino grosso de um C57BL / 6 de ratinho (Figura 1) é uma ilustração da exequibilidade e a eficácia desta técnica. Como mostrado na Figura 1, a imagem é capaz de capturar todas as porções do cólon: proximal, médio e distal. Assim, permite a avaliação histológica abrangente. A laminagem Suíça e a capacidade para capturar todo o comprimento do tecido do intestino delgado ou grande é extremamente útil para a expressão do gene marcador de coloração heterogéneo e ou uma resposta variável do tecido intestinal para o insulto.
Um exemplo é o padrão de coloração de EGFP em ratos Lgr5-EGFP / CREER T2. Neste modelo de rato, a expressão da EGFP é impulsionado pelaPromotor Lgr5, que é ativo somente nas proliferam activamente criptas intestinais. Além disso, este modelo de murganho é caracterizada por baixa (cerca de 5 - 10%) penetrância de expressão do transgene. Como mostrado na Figura 2, o padrão de expressão EGFP no tecido intestinal, é variável. Consequentemente, a capacidade para capturar uma grande vista do tecido ajuda a identificar a região de interesse.
A técnica aqui descrita é poderosa, especialmente com a aplicação de coloração multifluorophore. Aqui, mostramos um exemplo de trifluorophore coloração do tecido intestinal que foi preparado utilizando a técnica de rolo suíço. O principal objetivo deste estudo foi investigar o papel da Klf5 na manutenção de células-tronco intestinais expressando Lgr5 marcador. Por isso, excluído Klf5 a partir das células-tronco intestinais Lgr5-positivos em camundongos Lgr5-EGFP / creer T2 e recolhidos tecidos intestinais no dia14 após a primeira injecção tamoxifeno. Para a análise imuno-histológica, os tecidos foram preparados de acordo com o protocolo apresentado neste trabalho, e coloração para EGFP (Lgr5 marcador), Klf5, e Ki-67 foi executada. Nos ratinhos de controlo, denotados como Lgr5-EGFP / CREER T2, ambos co-coloração criptas EGFP-negativo EGFP-positivo (marcados com setas azuis) e (marcados com setas brancas) exibiu para Klf5 e Ki-67 em dois pontos de tempo examinados , como mostrado na Figura 3D. Em contraste, em Lgr5-EGFP / CREER T2 / Klf5 fl / FL pequena tecido intestinal, Klf5 / Ki-67 co-coloração foi em falta a partir das células-tronco CBC EGFP-positivo (marcada por setas azuis) mas presente no EGFP-negativo criptas adjacentes às criptas verdes (marcadas com setas brancas), como mostrado na Figura 3H. Este é um excelente exemplo de que as técnicas de preparação de tecidos aqui apresentados não influencia negativamente a qualidade de coloração.
Figura 1. Coloração com H & E de um intestino grosso de um C57B G / 6 rato. É mostrada a imagem composta de todo o comprimento do intestino grosso. A parte entre a seta preta e linha preta marca a parte proximal, entre as linhas pretas e laranja marca o meio, e entre a linha laranja e seta laranja marca a parte distal do intestino grosso. Barra de escala = 1.000 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Imunofluorescência Coloração de um intestino delgado de um Lgr5-EGFP / creer T2 Mouse. A imagem composta de EGFP (células epiteliais rotulagem Lgr5-positivos) coloração de pequenas seções do intestino de um rato Lgr5-EGFP / creer T2. Exemplo de imunofluorescência heterogêneo de marcador de proteína (EGFP) que rotula células epiteliais Lgr5-postive nas criptas do mouse Lgr5-EGFP / creer T2. Os núcleos são visualizadas com Hoechst. setas brancas marcar criptas positivas para a expressão EGFP. Barra de escala = 500 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Klf5 deleção em Lgr5-EGFP / creer T2 / Klf5 fl / fl Mice Persiste Longo Prazo em criptas Lgr5-EGFP-positivos. T2 e Lgr5-EGFP / creer T2 / Klf5 fl / fl ratos no dia 14 dias após a primeira injecção tamoxifeno, respectivamente. Painéis AD são representativos de coloração de tecidos recolhidos de ratinhos de controlo Lgr5-EGFP / creer T2, enquanto representativos painéis EH mostram coloração de Lgr5-EGFP / creer T2 / Klf5 fl / fl ratos. Painéis A e exibição Klf5 imunofluorescência coloração E em vermelho; painéis B e F mostram coloração EGFP em verde; painéis C e G mostram Ki-67 coloração em amarelo; e os painéis D e H mostram fundiu imagens de Klf5, EGFP e Ki-67 manchas. setas azuis apontam para criptas verdes; setas brancas apontam para criptas nongreen nas imagens fundidas. Lgr5-EGFP / creer T2 / Klf5 fl / fl ratos mostraram perda a longo prazo da Klf5 apenas nas células 14 CTF marcadas com EGFP. Barra de escala = 50 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A técnica de laminação Swiss é um método poderoso para a preparação de tecido intestinal para avaliação histológica e morfológica em grande escala. Em contraste com a técnica Swiss-laminagem anteriormente descrita, que foi originalmente desenvolvido para preparação de secções congeladas 18,19, o processo aqui apresentado permite a preparação do tecido intestinal rápida e a fixação para a fixação de formalina e embebidos em parafina (FFPE). Em comparação com tecido congelado, o tecido FFPE tem muito maior vida de prateleira e é o tipo preferido de tecido para análise histológica por causa de uma melhor integridade do tecido. partes críticas do protocolo Swiss-rolamento envolvem a flexibilidade do tecido para o material e manter a integridade Swiss-roll e qualidade de tecidos para postfixation coloração. A técnica Swiss-rolo padrão para FFPE de tecido intestinal é normalmente trabalhosa e consome tempo (2 dias) 18,19. Além disso, este método padrão geralmente produz tecido intestinal que é relatively duro e não é fácil de se formar em um rolo suíço. Isto é porque durante a noite de incubação do tecido intestinal dissecada em 10% de formalina tamponada é necessária antes de rolamento tecido. Outras modificações da técnica para fins de FFPE foram também desenvolvidos, mas que têm um grande problema da tendência do tecido intestinal para desenrolar e / ou para o centro do rolo a ser distorcido. Isto é porque o tecido utilizado nestas técnicas é tecido não fixado fresco, que é escorregadia do muco produzido pelo intestino. A nova técnica modificada, mostrada aqui ultrapassa estes problemas através da utilização de uma forma modificada do fixador de Bouin. fixador de Bouin original consiste de uma mistura de ácido acético, etanol, ácido pícrico e paraformaldeído (ou formalina). Os dois componentes mais perigosos, ácido pícrico e paraformaldeído (ou formalina), foram eliminados para permitir uma utilização muito mais seguro do fixador com uma mistura de ácido acético / etanol. ácido pícrico apresenta o risco de explosão e paraformaldehyde (ou formalina) é um risco de câncer. A importância da utilização do fixador de Bouin modificado é que (1) é menos perigoso em comparação com a sua fórmula original, (2) É fácil de preparar com reagentes relativamente nonexpensive que estão prontamente disponíveis na maior parte dos laboratórios, e (3) permite uma rápida, quase instantânea, a fixação do tecido, quando usada para a lavagem. Ao conhecimento, não há limitações conhecidas para usar esta técnica modificada. Além disso, a fixação rápida com esta mistura reduz imensamente o escorregamento do tecido intestinal, permitindo que o tecido de rolamento muito mais rápido e mais fácil. Este fixador também permite uma excelente preservação dos tecidos e células de integridade para análise histológica e imunocoloração. Assim, em comparação com outros métodos de preparação do tecido intestinal, esta técnica melhorada supera várias questões técnicas e subsídios velocidade e facilidade de utilização muito maior.
Além disso, este fixador modificado é útil para usar com outros espessuratecidos que necessitam de fixação rápida. Devido à natureza do ácido acético e do etanol, que tem a capacidade de penetração rápida do tecido de espessura, enquanto ao mesmo tempo a sofrer de fixação. Temos utilizado com sucesso para corrigir rapidamente o tecido grosso, como fígado, baço e rins. Por exemplo, a fixação de todo um fígado do rato adulto usando o fixador de Bouin modificado é geralmente atingida dentro de 15 - 20 min. Isto pode ser facilmente julgado por corte de uma secção transversal para o fígado e observando se as regiões profundas do fígado tinha mudado de cor de vermelho-sangue ao cinza. A mudança de cor é indicativa de fixação. Essa fixação é seguida por reticulação usando formalina tamponada para 24-48 horas, sem medo de composição celular / tecido alterado, como o tecido já está fixado neste ponto.
Por comparação, a utilização tradicional método de fixação em formalina tamponada com sozinho em conjunto, um fígado de ratinho adulto exigiria 24-48 horas para alcançar FIXAÇÃO-tecidos profundosno, com o risco de composição celular alterado de tecidos profundos. Os métodos de fixação rápida de tecidos tem a vantagem de espessura superior de reduzir a um mínimo a alteração de componentes celulares, em resposta a condições de stress, tais como a hipoxia, a seguir à remoção do órgão / tecido do corpo. Prevemos que o fixador pode ser modificado para a perfusão dos animais como uma forma ainda mais rápido do que fixa grossas tecidos / órgãos é desejada. Assim, em conclusão, este método e fixador modificado fornecer várias vantagens em relação aos métodos tradicionais utilizados para a colheita de tecido intestinal e a fixação e o fixador modificado pode ser usado para fixar rapidamente outros tecidos / órgãos de espessura.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stainless Steel Dissecting Kits | VWR | 25640-002 | |
| Decloaking Chamber | Biocare Medical | DC2012 | |
| Syringe 10 ml | VWR | 89215-218 | |
| Swingsette Tissue embedding/processing cassette with lid | Simport | M515 | |
| Superfrost Plus Slides [size: 25 x 75 x 1 mm] | VWR | 48311-703 | |
| Manual Slide Staining Set | Tissue-Tek/Sakura | 4451 | |
| Staining Dish Green | Tissue-Tek/Sakura | 4456 | |
| Staining Dish White | Tissue-Tek/Sakura | 4457 | |
| 24-Slide Slide Holder with Detachable Handle | Tissue-Tek/Sakura | 4465 | |
| Oven | Thermo Scientific | 6243 | for baking slides at 65 degree |
| Dissection microscope | Zeiss | Stemi 2000C | |
| Fluorescence Microscope | Nikon | Eclipse 90i | Bright and fluoerescent light, with objectives: 10X, 20X |
| PAP Pen Super-Liquid Blocker Mini | Fisher Scientific | DAI-PAP-S-M | |
| Ethanol 200 proof | AAPR | 111000200 | |
| Methanol | VWR | BDH1135-4LP | |
| Glacial acetic acid | AAPR | 281000ACS | |
| Xylene | Fisher Scientific | X5P-1GAL | |
| Hydrogen peroxide 25% solution in water | ACROS | 202465000 | |
| 10% bufered formalin | Fisher Scientific | 22-026-213 | |
| Bovine serum fraction V, heat shock | Roche | 3116956001 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P7949 | |
| Sodium citrate | Fisher Scientific | S279 | |
| Gavage needle | VWR | 20068-624 | |
| Rabbit anti Klf5 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-22797 | Dilution 1:150 |
| Chicken anti EGFP antibody | Millipore | AB16901 | Dilution 1:500 |
| Rabbit anti Ki67 antibody | Biocare Medical | CRM325B | Dilution 1:500 |
| Mach3 rabbit AP polymer detection kit | Biocare Medical | M3R533L | |
| Warp red chromogen kit | Biocare Medical | WR806 H | |
| Lgr5-EGFP/CreERT2 mice | Jackson labs | 008875 | |
| Automated processor | Leica | Leica TP1020 |
References
- van der Flier, L. G., Clevers, H. Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium. Annu Rev Physiol. 71, 241-260 (2009).
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