Summary
l'identification et la localisation des cellules épithéliales le long de la paroi de la muqueuse intestinale précis sont essentiels pour définir différentes lignées cellulaires. l'imagerie correcte des tissus intestinaux est cruciale pour l'identification des motifs d'expression de protéine avec une résolution maximale. Cette étude vise à définir les méthodes et les conditions optimales pour les tissus intestinaux de traitement de la souris.
Introduction
L'épithélium intestinal de mammifère comprend une seule couche de cellules prismatiques. Dans l'intestin grêle, les cellules proliférantes sont confinés dans les cryptes tandis que les cellules différenciées occupent la région de villosités. Cependant, parce qu'il n'y a pas de villosités dans le gros intestin, les cellules proliférantes sont localisées au fond des cryptes et des cellules différenciées occupent la partie supérieure des cryptes. L'épithélium intestinal subit une reconstitution rapide (environ 3-5 jours) qui est entraîné en continu par division des cellules prolifératives dans les cryptes. Les cellules prolifératives des cryptes ne sont pas une population homogène et sont subdivisées en cellules souches et (TA) des cellules de transit-amplification 1. Les cellules souches se trouvent au fond de la crypte, dans les 4 premières - 5 cellules de la très inférieure 2. Le modèle actuel soutient l'existence de deux types de cellules souches: les cellules souches cryptes colonnaire de base (SRC) et les cellules souches quiescentes de réserve. La SRC scellules TEM sont activement prolifèrent et sont marquées par une protéine G contenant de répétition-leucine-riche récepteur couplé 5 (LGR5) 3, olfactomédine 4 (Olfm4) 4 et Achaete scute-like 2 (Ascl2) 5. D'autre part, les cellules souches quiescentes de réserve sont marqués par B Moloney murine site spécifique des cellules de virus de la leucémie d'intégration 1 (Bmi1) 6, la télomérase de la souris transcriptase inverse (mTERT) 7, HOP Homeobox (HopX) 8, Doublecortin-Like Et CAM Kinase -Comme 1 (DCLK1) 9, et riche en leucine répétitions et Immunoglobulin-Like Domains 1 (Lrig1) 10. Les cellules souches qui prolifèrent activement donnent naissance à des cellules TA puis subissent une différenciation en cellules absorbantes (entérocytes) et les cellules sécrétoires (entéro, caliciformes, cellules Paneth et Tuft). la division cellulaire continue dans la zone de prolifération résulte en mouvement vers le haut des cellules épithéliales le long de l'axe crypte-villosité jusqu'à ce qu'ils atteignent le dessus des villosités, où ils subissent l'apoptose et sontmué hors de la surface de l'épithélium. Les différents types de cellules épithéliales intestinales sont marquées par l'expression de protéines distinctes (par exemple, les cellules caliciformes intestinales peuvent être reconnues par coloration avec un anticorps contre les cellules muc2 et Paneth avec un anticorps dirigé contre le lysozyme). Nous étudions le rôle des facteurs Krüppel-like (KLFs) dans l'homéostasie et physiopathologie de l'épithélium intestinal 11-13. Les résultats présentés ici supportant la faisabilité d'une technique de laminage suisse modifiés sont basés sur des études antérieures sur le rôle de facteur semblable à Krüppel 5 (KLF5) dans le maintien de la prolifération active des cellules souches épithéliales intestinales 14. KLF5 est un facteur de transcription à doigt de zinc qui est fortement exprimé dans la tige intestinale active et les cellules 12 TA. Des études antérieures ont démontré que KLF5 est co-exprimé avec Ki-67, un marqueur proliférative connu dans les cryptes intestinales.
Le tr gastro acte est pas un tissu structurellement ou fonctionnellement homogène. L'intestin grêle est subdivisé en le duodénum, le jéjunum et l'iléon et le gros intestin, du caecum et du côlon dans, ce dernier étant en outre divisée en proximale, intermédiaire et distale. Chacune de ces sections a des caractéristiques histologiques uniques et joue des rôles distincts 15. Par conséquent, les effets des injurieux et le degré de la réponse de l'épithélium intestinal peuvent dépendre de la région de tissu étudié 16. En outre, les différentes souches de souris montrent la diversité de la réponse au niveau histologique en fonction du type d'insulte utilisée dans les études 16. Ainsi, digne préparation des tissus est nécessaire pour permettre histologique appropriée et l'analyse moléculaire des tissus intestinaux. En tant que tel, le Swiss-roll subventions de la technique d'analyse de la longueur totale de l'épithélium intestinal en même temps et donc détermine des conclusions bien informées fondées sur des informations complètes.
e_content "> La technique Swiss-roll a été mentionné par Magnus 17, et décrit en détail par Moolenbeck et Ruitenberg et Park et al. comme une méthode pour la préparation de tissus et d' effectuer des analyses histologiques de l'intestin des rongeurs 18,19, respectivement. Le protocole délimitée dans cette publication présente une version améliorée de la méthode originale qui permet pour la préparation des tissus en temps opportun et fiable à des fins de diagnostic. cette technique modifiée permet de collections et de la préparation de l'épithélium intestinal des techniques universellement utilisées, comme l'immunohistochimie, immunofluorescence, ainsi efficaces comme l' hybridation in situ (fluorescente et chromogénique 20). en outre, le tissu modifié spécimen procédé de préparation utilise des réactifs facilement disponibles et relativement peu coûteux , tout en offrant un mode de fixation rapide des tissus et permet la récupération des protéines, de l' ADN et de l' ARN pour une évaluation supplémentaire. Prise ensemble, this technique est excellente pour l'évaluation complète des caractéristiques histopathologiques, pathologiques et moléculaires de l'épithélium intestinal.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Souris
- Toutes les études sur des souris ont été approuvées par l'Institutional soin et l'utilisation des animaux Comité Stony Brook University (IACUC). Les souris ont été maintenues sur un cycle de lumière-obscurité 12:12 h.
- obtenir dans le commerce C57BL / 6. Obtenir des souris C57BL / 6 portant des alleles KLF5 flanquée de sites loxP (KLF5 f l / f l). Ces souris ont été décrites précédemment 21 et gracieusement fournies par le Dr Ryozo Nagai.
- Achetez C57BL / 6 souris portant le gène de la recombinase Cre inductible sous la régulation du promoteur LGR5 (LGR5-EGFP / CreERT2 souris).
- Pour établir LGR5-EGFP / CREER T2 / KLF5 f l / f l souris, traverser KLF5 fl / f l souris avec des souris / CREER T2 LGR5-EGFP puis rétrocroisement la progéniture KLF5 fl / f l les souris.
- Souris Traiter avec le tamoxifène comme par le protocole décrit précédemment 22. Injecter 8 semaines d'âge des souris témoins et expérimentaux par voie intraperitoneale (IP) avec 1 mg de tamoxifène (10 mg / ml), dissous dans de l'huile de maïs stérile, pendant 5 jours consécutifs.
- Au jour 14 après la première injection tamoxifène, sacrifiez des souris en utilisant du CO 2 asphyxie en les plaçant dans une chambre reliée à la source de CO 2 gazeux. Laisser le gaz de circuler dans la chambre jusqu'à ce que les souris sont inconscients et tout mouvement cesse. Pour assurer l'euthanasie effectuer la dislocation cervicale.
2. Préparation des tissus et Swiss Rouler
- En utilisant des pinces à dissection et ciseaux, couper une incision dans la peau de la face abdominale. Avec une paire de pinces, maintenir la peau à l'incision et tirez doucement loin du tissu musculaire abdominale. Utilisez une paire de ciseaux pour couper la peau abdominale et exposer les muscles abdominaux.
- Maintenez et tirez la peritoneum avec la pince. Assurez-vous de ne pas être tenue et en tirant sur les intestins. faire avec précaution une incision dans le tissu péritonéal et continuer coupant la peau pour exposer les muscles abdominaux. faire avec précaution une incision dans les muscles abdominaux et continuer à les couper pour exposer les intestins.
- Identifier les deux points et tracer à l'extrémité distale où elle rejoint le rectum / anus. Avec une paire de ciseaux, couper aussi près de l'ouverture anale possible.
- Identifier l'estomac et de tracer, où il rejoint le petit intestin. Avec une paire de ciseaux, coupe sans l'intestin d'environ 1 cm de l'estomac. Transférer la totalité de la longueur de l'intestin grêle et du côlon libéré dans une boîte de Petri contenant une solution saline propre tamponnée au phosphate (PBS).
- Avec une main ou une paire de pinces, maintenir l'extrémité distale du côlon et utiliser l'autre main pour démêler délicatement toute la longueur du côlon de tout tissu conjonctif et / ou de la graisse mésentérique.
- Identifier le caecum(Petite poche entre le petit et le gros intestin) et couper là où le caecum et le côlon rejoignent (l'extrémité proximale du côlon) pour libérer le côlon.
- Avec une main ou une paire de pinces, tenez le petit intestin et utiliser l'autre main pour démêler délicatement toute la longueur de l'intestin grêle, de tout tissu conjonctif et / ou de la graisse mésentérique. Coupez le caecum et jeter s'il n'y a pas besoin.
Remarque: Le processus peut être arrêté ici en incubant les intestins disséqués dans le fixateur de Bouin modifié (éthanol / 5% d'acide acétique à 50% dans dH 2 O) pendant la nuit et suivez la procédure le lendemain. - Manipulation d'un segment de l'intestin (l'intestin grêle ou du côlon), remplir une seringue de 10 ml avec le fixateur de Bouin modifié et fixer une aiguille de gavage à elle. Insérer l'aiguille à environ un demi-centimètre dans l'ouverture antérieure du segment intestinal.
- Tenez l'aiguille de gavage à l'intérieur du segment intestinal en appliquant une pression ferme avec un instrumentsur le segment intestinal. Avec l'autre main tenant la seringue, appliquer une légère pression, mais cohérente pour vider le contenu du segment intestinal en utilisant le fixateur de Bouin modifié. Cette étape permet un nettoyage simultané du segment intestinal et de la fixation immédiate. Utilisez une boîte de Pétri pour recueillir les déchets d'écoulement. Fixation peut être observée par la couleur du côlon tournant opaque.
Remarque: Assurez-vous de ne pas appliquer trop de pression pendant le rinçage ou le segment intestinal pourrait éclater. - Avec des ciseaux, couper ouvrir le segment intestinal longitudinalement le long de la ligne mésentérique. Tenez-le avec une paire de pinces et le rincer brièvement dans une boîte de Pétri contenant du PBS.
- Couper le petit intestin en 3 segments égaux: proximale, moyenne et distale. Le segment proximal est celle qui suit immédiatement l'estomac, et le segment distal est celle juste avant le côlon. Le segment proximal est équivalent au duodénum, le milieu de la jéjunum et distale par rapport à lal'iléon.
- Pour chaque segment de marquer l'extrémité proximale et l'extrémité distale. L'extrémité proximale est celle qui a été initialement dirigé vers l'estomac, et l'extrémité distale pointée vers le côlon.
- Utiliser le dessus d'une boîte de Petri pour placer le segment intestinal nettoyé et ouvert. Placer le segment intestinal avec le côté luminal vers le haut.
- Pour le côlon, identifier la face luminale par des bigarrures / nervures courent sur sa largeur et sont présents à l'extrémité proximale. Les régions moyennes et distales ont des bigarrures qui courent longitudinalement. Pour le petit intestin, identifier le côté luminal par la surface apparaissant rugueuse, qui marque les villosités.
Remarque: Pour le petit intestin, il n'y a pas de démarcation anatomique macroscopique externe de proximale, moyenne et régions distales. Toutefois, ces régions peuvent être identifiées dans les sections peuvent sous le microscope. Les villosités sont les plus longs dans la région proximale et deviennent progressivement plus courtes de manière distale où ils sontla plus courte en longueur. Au microscope, les cryptes coloniques sont les plus courtes dans la région proximale qui peut également être identifié par la présence d'arêtes. Les cryptes coloniques sont le plus grand dans la partie médiane et plus courte dans la région distale mais toujours plus grande que dans la région proximale.
- Pour le côlon, identifier la face luminale par des bigarrures / nervures courent sur sa largeur et sont présents à l'extrémité proximale. Les régions moyennes et distales ont des bigarrures qui courent longitudinalement. Pour le petit intestin, identifier le côté luminal par la surface apparaissant rugueuse, qui marque les villosités.
- Procéder à Swiss rouler le côlon:
- Gardez le côlon plat ouvert et tirez-le avec une pince à partir de son extrémité proximale vers le bord de la boîte de Pétri.
- Gardez côté luminal vers le haut et maintenir l'extrémité proximale avec la pince avec une main et avec l'autre main tenir un cure-dent.
- Enroulez le bord de l'extrémité proximale autour du cure-dent en utilisant la pince et légèrement pincer le bord enveloppé contre le cure-dent pour le maintenir en place.
- Doucement et lentement commencer à rouler le cure-dent avec les doigts pour rouler le côlon autour du cure-dent pour former un rouleau suisse.
- Une fois que toute la longueur du côlon a été mis en place, utiliser une paire de pinces à glisser avec précaution le colon Swiss roll off le cure-dent et dans une / Cassette -embedding tissu de traitement. Placer la cassette dans 10% de formaline tamponnée pendant une nuit à température ambiante.
- Procéder suisse roulant de l'intestin grêle:
- Manipulation d'un segment à la fois, garder le segment ouvert à plat avec le côté luminal et tirez-le avec une pince à partir de son extrémité proximale vers le bord de la boîte de Pétri.
- Procéder au laminage suisse comme décrit pour le côlon.
- Procéder au traitement des tissus fixés au formol pour l'inclusion en paraffine. Procédez comme suit:
REMARQUE: Utilisez un processeur automatisé (voir matériaux et équipement de pour plus de détails).- Alors que le tissu se trouve dans la cassette, rincer avec du PBS jusqu'à ce que le tissu est complètement retiré fixatif.
- Déshydrater le tissu à l'aide d'éthanol dans la séquence suivante: 50% d'éthanol pendant 10 min, 70% d'éthanol pendant 10 min, 80% d'éthanol pendant 10 min, de l'éthanol à 95% pendant 10 minutes, l'éthanol à 100% pendant 10 min, 100% d'éthanol pendant 10 min et 1éthanol à 00% pendant 10 min.
- éthanol d'échange avec du xylène dans la séquence suivante: 2: 1 d'éthanol: xylène pendant 10 - 15 min, 1: 1 éthanol: xylène pendant 10 - 15 min, 1: 2 éthanol: xylène pendant 10 - 15 min, 100% de xylène pour 10 - 15 min, 100% de xylène pendant 10 - 15 minutes et 100% de xylène pendant 10 - 15 min. ATTENTION: Xylène est un danger pour la santé, donc le lieu de travail doit être équipé d'une ventilation locale avec une hotte appropriée et l'équipement de protection approprié doit être porté par le personnel.
- Échange xylène avec de la paraffine. Effectuez les étapes suivantes dans un four à vide fixé pour 54-58 ° C: 2: 1 xylène: paraffine pendant 30 min, 1: 1 xylène: paraffine pendant 30 min, 1: 2 xylène: paraffine pendant 30 min, 100% de paraffine pour 1 - 2 h, et 100% de paraffine pour 1 - 2 h ou toute la nuit.
Remarque: Ne laissez pas la paraffine dépasse 60 ° C pendant des périodes de temps prolongées parce que cela va dégrader les polymères de paraffine et de le rendre dur et cassant. - Incluez dans de nouveaux tissus de paraffine et orient fraîche comme dedésiré avant que la paraffine ne durcisse. Pour les cylindres suisses suivant paraffinization des tissus, il est important de repositionner chaque rouleau sur son côté pendant l'enrobage de paraffine. Cela garantit que lors de la coupe, les sections de la longueur entière de chaque rouleau sera produit.
- Pour la coloration, couper 5 um d'épaisseur des sections en utilisant microtome. Collecter les sections sur des lames chargées et les (cuisson) sécher dans un four à 65 ° C pendant la nuit; laisser refroidir à température ambiante, puis les a utilisés pour la coloration.
Remarque: Le temps de cuisson peut être réduit à 1 - 2 h selon la façon dont fraîchement coupé les diapositives sont. Si moins d'un mois depuis sectionnant, alors il est conseillé de faire cuire pendant une nuit. Si elle a été plus d'un mois, puis 1 - 2 h de cuisson est suffisante pour gagner du temps. Si à court de temps, le soutien pendant la nuit peut toujours être utilisé.
3. Analyse histologique et immunofluorescence
Effectuer des analyses histologiques et immunofluorescence coloration comme décrit précédemment 23,24, avec des modifications. Pour améliorer la protéine fluorescente verte (EGFP) immunofluorescence:
- Cuire les lames dans une étuve à 65 ° C pendant 1 heure pour inactiver l'activité phosphatase alcaline endogène et Déparaffiner ensuite dans le xylène.
- Incuber les sections dans un bain de 3% de peroxyde d'hydrogène dans du methanol pour bloquer les peroxydases endogènes de tissu; puis réhydrater par incubation dans une série décroissante du bain d'alcool (100%, 95%, 70%), suivie par la récupération de l'antigène dans une solution tampon citrate (10 mM de citrate de sodium, 0,05% de Tween-20, pH 6,0) à 125 ° C pendant 10 min en utilisant une chambre decloaking.
- Tracez un cercle autour des coupes de tissus en utilisant un stylo qui fournit barrière hydrophobe marquage et incuber les sections avec un tampon de blocage (2,5% de sérum albumine bovine [BSA] dans du TBS-Tween) pendant 30 min à 37 ° C, puis avec un anticorps primaire contre EGFP (dilution 1 : 500) à 4 ° C pendant une nuit dans une chambre humidifiée en agitant doucement.
- Laver sections et incuber avec un anticorps secondaire fluorescent marqué à la concentration appropriée pendant 30 min à 37 ° C.
- Laver les lames après le traitement d'anticorps et détachants noyaux secondaires avec Hoechst et monter avec un milieu de montage.
- Pour KLF5 / EGFP / Ki-67 co-coloration, les lames de processus tel que décrit dans les étapes 3.1 - 3.3 et effectuer KLF5 coloration par incubation avec un anticorps KLF5 (dilution 1: 150) pendant la nuit.
- Appliquer la détection de polymère AP de lapin aux diapositives que selon le protocole.
- Klf4 révèle la coloration en utilisant une coloration immunohistochimique chromogène selon le protocole du fabricant.
- Effectuer une élution d' anticorps en utilisant le protocole décrit précédemment 25. Incuber les lames à 50 ° C dans Glycine-SDS (pH 2,0) solution avec agitation pendant 1 h.
- Laver les lames avec de l'eau distillée et incuber avec du tampon de blocage (2,5% de BSA dans du TBS-Tween) pendant 30 min à 37 ° C.
- Ajouter Ki-67 (dilution 1: 500) et EGFP (dilution 1:500) des anticorps dirigés simultanément et incuber à 37 ° C pendant 1 heure.
- Effectuer la détection fluorescente avec des anticorps secondaires appropriés avant coloration avec Hoechst (données non présentées) et monter avec un milieu de montage.
- Observer la morphologie histologique des tissus sur coloration des sections 5 um avec hématoxyline et l' éosine (H & E) 26. Pour les images fluorescentes, utiliser des longueurs d'onde d'émission de 535, 646 et 700 pour visualiser EGFP, KLF5 et Ki-67 coloration, respectivement.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La technique de laminage suisse en combinaison avec la coloration immunohistochimique permet une analyse complète de petit ou grand tissu intestinal. L'exemple de coloration H & E d'un gros intestin d'une souris C57BL / 6 (Figure 1) est une illustration de la faisabilité et l'efficacité de cette technique. Comme on le voit sur la figure 1, l'image est capable de capturer toutes les parties du côlon: proximale, médiane et distale. Ainsi, il permet une évaluation histologique complète. Le laminage suisse et la capacité de capturer toute la longueur de la petite ou grande tissu intestinal est extrêmement utile pour l'expression du gène marqueur hétérogène et coloration ou une réponse variable du tissu intestinal à l'insulte.
Un exemple est le schéma de coloration chez les souris EGFP EGFP LGR5 / CREER T2. Dans ce modèle de souris, l'expression de EGFP est entraîné par lePromoteur LGR5, qui est actif seulement dans les cryptes intestinales proliférant activement. De plus, ce modèle de souris se caractérise par une faible (environ 5 - 10%) pénétrance l'expression du transgène. Comme on le voit sur la figure 2, le schéma d'expression de l' EGFP dans le tissu intestinal est variable. Par conséquent, la capacité de capturer une vue élargie du tissu permet d'identifier la zone d'intérêt.
La technique décrite ici est puissant en particulier avec l'application de multifluorophore coloration. Ici, nous montrons un exemple de trifluorophore coloration du tissu intestinal qui a été préparé en utilisant la technique Swiss-roll. L'objectif principal de cette étude était d'étudier le rôle de KLF5 dans le maintien des cellules souches intestinales exprimant LGR5 marqueur. Par conséquent, nous avons supprimé KLF5 à partir des cellules souches intestinales LGR5 positives chez des souris LGR5-EGFP / CREER T2 et recueilli sur les tissus intestinaux jour14 après la première injection du tamoxifène. Pour l'analyse immunohistochimique, les tissus ont été préparés selon le protocole présenté dans ce manuscrit, et la coloration pour EGFP (LGR5 marqueur), KLF5 et Ki-67 a été réalisée. Chez les souris de contrôle, désignées par LGR5-EGFP / CREER T2, tant EGFP-positive (marquée avec des flèches bleues) et cryptes EGFP-négative (marquée avec des flèches blanches) exposées co-coloration pour KLF5 et Ki-67 à deux points de temps examinés , comme représenté sur la figure 3D. En revanche, dans LGR5-EGFP / CREER T2 / KLF5 fl / fl petit tissu intestinal, KLF5 / Ki-67 co-coloration a été absente des cellules souches de la SRC EGFP-positive (marquée par des flèches bleues) , mais présente dans le EGFP négatif cryptes jouxtant les cryptes verts (marqués par des flèches blanches), comme représenté sur la figure 3H. Ceci est un excellent exemple que les techniques de préparation des tissus présentés ici n'a pas d'influence négative sur la qualité de coloration.
Figure 1. Coloration H & E d'un gros intestin d'un C57B L / 6 Souris. On voit ici l'image composite de la longueur totale du gros intestin. La partie entre la flèche noire et la ligne noire marque la partie proximale, entre les lignes noires et orange marque le milieu, et entre la ligne orange et flèche orange marque la partie distale du gros intestin. Barre d' échelle = 1000 pm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. immunofluorescence d'un intestin grêle d'un / CREER T2 Souris LGR5-EGFP. Image composite de EGFP (cellules épithéliales étiquetage LGR5-positifs) coloration des petites sections de l' intestin d'une souris LGR5-EGFP / CREER T2. Exemple de hétérogène immunofluorescence de la protéine marqueur (EGFP) qui marque les cellules épithéliales LGR5-postive dans les cryptes de la souris LGR5-EGFP / CREER T2. Nuclei sont visualisées avec Hoechst. Les flèches blanches marquent cryptes positives pour l'expression de EGFP. Barre d' échelle = 500 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. KLF5 délétion dans LGR5-EGFP / CREER T2 / KLF5 fl / fl Mice Persiste à long terme dans les Cryptes LGR5-EGFP-positives. T2 et LGR5-EGFP / CREER T2 / KLF5 fl / fl souris le jour 14 jours après la première injection du tamoxifène, respectivement. Panneaux AD sont représentatives de la coloration de tissus prélevés sur des souris de contrôle LGR5-EGFP / CREER T2, tandis que les panneaux EH montrent une coloration représentatifs de LGR5-EGFP / CREER T2 / KLF5 fl / fl souris. Panneaux A et E affichage KLF5 immunofluorescence en rouge; panneaux B et F montrent une coloration EGFP en vert; panneaux C et G montrent Ki-67 coloration en jaune; et les panneaux D et H montrent la fusion des images de KLF5, EGFP et Ki-67 taches. Les flèches bleues indiquent cryptes verts; flèches blanches indiquent cryptes non-vertes dans les images fusionnées. LGR5-EGFP / CREER T2 / KLF5 fl / fl souris ont montré une perte à long terme de KLF5 uniquement dans les cellules de la SRC EGFP marqué 14. Barre d'échelle = 50 pm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
La technique de laminage suisse est une méthode puissante pour la préparation de tissu intestinal pour l'évaluation histologique et morphologique sur une grande échelle. Contrairement à la technique de laminage suisse décrit précédemment, qui a été initialement mis au point pour la préparation de coupes congelées 18,19, la procédure présentée ici permet la préparation du tissu intestinal et de fixation rapide pour la fixation au formol et inclusion dans la paraffine (FFPE). Par rapport aux tissus congelés, des tissus FFPE a beaucoup plus longue durée de vie et est le type préféré de tissu pour l'analyse histologique en raison d'une meilleure intégrité des tissus. Les parties critiques du protocole suisse laminage impliquent la flexibilité des tissus pour le matériel et le maintien de l'intégrité Swiss-roll et de la qualité des tissus pour la coloration postfixation. La technique Swiss-roll standard pour FFPE du tissu intestinal est généralement laborieuse et prend du temps (2 jours) 18,19. En outre, cette méthode standard donne habituellement le tissu intestinal qui est relatively raide et pas facile à former dans un rouleau suisse. En effet, une nuit d'incubation du tissu intestinal disséqués dans 10% du formol tamponné est nécessaire avant le laminage des tissus. D'autres modifications de la technique à des fins FFPE ont également été mis au point, mais ils ont un problème majeur de la tendance du tissu intestinal à dérouler et / ou pour le centre du rouleau à être déformée. En effet, le tissu utilisé dans ces techniques est un tissu non fixé frais, ce qui est glissant du mucus produit par l'intestin. La nouvelle technique modifiée représentée ici surmonte ces problèmes en utilisant une forme modifiée de fixateur de Bouin. fixateur de Bouin d'origine est constituée d'un mélange d'acide acétique, d'éthanol, d'acide picrique et de paraformaldehyde (ou formol). Les deux composants les plus dangereux, l'acide picrique et de paraformaldehyde (ou formol), ont été éliminés pour permettre l'utilisation beaucoup plus sûre du fixateur avec un mélange acide / éthanol acétique. L'acide picrique présente un risque d'explosion, et Paraformaldehyde (ou formaline) est un risque de cancer. L'importance de l'utilisation du fixateur de Bouin modifié est qu'il (1) est moins dangereux par rapport à sa formule originale, (2) est facile à préparer avec des réactifs relativement nonexpensive qui sont facilement disponibles dans la plupart des laboratoires, et (3) permet rapidement, presque instantanée, la fixation du tissu lorsqu'il est utilisé pour le rinçage. À la connaissance, il n'y a pas de limites connues à l'aide de cette technique modifiée. En outre, la fixation rapide avec ce mélange réduit énormément la glissance du tissu intestinal, ce qui permet beaucoup plus rapide et plus facile à rouler des tissus. Ce fixateur permet également une excellente conservation de l'intégrité des tissus et de cellules pour l'analyse histologique et immunocoloration. Ainsi, par rapport à d'autres méthodes de préparation des tissus intestinaux, cette technique améliorée surmonte plusieurs questions techniques et des subventions considérablement la vitesse et la facilité d'utilisation améliorée.
En outre, cette modification fixatif est utile d'utiliser d'autres d'épaisseurles tissus qui nécessitent une fixation rapide. En raison de la nature de l'acide acétique et de l'éthanol, qui ont la capacité de pénétration rapide des tissus épais, tout en subissant simultanément la fixation. Nous l'avons utilisé avec succès pour corriger rapidement les tissus épais tels que le foie, la rate et les reins. Par exemple, la fixation d'un ensemble de foie de souris adulte en utilisant le fixatif de Bouin modifié est généralement obtenu sous 15 - 20 min. Ceci peut être facilement évaluée en coupant une section dans le foie et en observant si les régions profondes du foie ont changé de couleur rouge-sang au gris. Le changement de couleur est indicative de la fixation. Cette fixation est ensuite suivie par réticulation à l'aide de la formaline tamponnée pour 24-48 h sans crainte de la composition cellulaire / tissu altéré, que le tissu est déjà fixé à ce stade.
Par comparaison, la méthode traditionnelle de fixation formaline tamponnée seule utilisation sur un ensemble de foie de souris adulte, il faudrait 24-48 heures pour obtenir des tissus profonds FIXATIde suite, avec le risque d'altération de la composition cellulaire des tissus profonds. Les méthodes de fixation rapide des tissus d'épaisseur supérieure a l'avantage de réduire au minimum l'altération des composants cellulaires en réponse à des conditions de stress, telles que l'hypoxie, après le retrait de l'organe / tissus du corps. Nous prévoyons que le fixateur modifié peut être utilisé en perfusion des animaux comme un moyen encore plus rapide de la fixation d'épaisseur des tissus / organes est souhaitée. Ainsi, en conclusion, cette méthode et fixateur modifiée offrent de multiples avantages par rapport aux méthodes traditionnelles utilisées pour la récolte de tissu intestinal et de la fixation et le fixateur modifié peut être utilisé pour fixer rapidement d'autres tissus / organes épais.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stainless Steel Dissecting Kits | VWR | 25640-002 | |
| Decloaking Chamber | Biocare Medical | DC2012 | |
| Syringe 10 ml | VWR | 89215-218 | |
| Swingsette Tissue embedding/processing cassette with lid | Simport | M515 | |
| Superfrost Plus Slides [size: 25 x 75 x 1 mm] | VWR | 48311-703 | |
| Manual Slide Staining Set | Tissue-Tek/Sakura | 4451 | |
| Staining Dish Green | Tissue-Tek/Sakura | 4456 | |
| Staining Dish White | Tissue-Tek/Sakura | 4457 | |
| 24-Slide Slide Holder with Detachable Handle | Tissue-Tek/Sakura | 4465 | |
| Oven | Thermo Scientific | 6243 | for baking slides at 65 degree |
| Dissection microscope | Zeiss | Stemi 2000C | |
| Fluorescence Microscope | Nikon | Eclipse 90i | Bright and fluoerescent light, with objectives: 10X, 20X |
| PAP Pen Super-Liquid Blocker Mini | Fisher Scientific | DAI-PAP-S-M | |
| Ethanol 200 proof | AAPR | 111000200 | |
| Methanol | VWR | BDH1135-4LP | |
| Glacial acetic acid | AAPR | 281000ACS | |
| Xylene | Fisher Scientific | X5P-1GAL | |
| Hydrogen peroxide 25% solution in water | ACROS | 202465000 | |
| 10% bufered formalin | Fisher Scientific | 22-026-213 | |
| Bovine serum fraction V, heat shock | Roche | 3116956001 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P7949 | |
| Sodium citrate | Fisher Scientific | S279 | |
| Gavage needle | VWR | 20068-624 | |
| Rabbit anti Klf5 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-22797 | Dilution 1:150 |
| Chicken anti EGFP antibody | Millipore | AB16901 | Dilution 1:500 |
| Rabbit anti Ki67 antibody | Biocare Medical | CRM325B | Dilution 1:500 |
| Mach3 rabbit AP polymer detection kit | Biocare Medical | M3R533L | |
| Warp red chromogen kit | Biocare Medical | WR806 H | |
| Lgr5-EGFP/CreERT2 mice | Jackson labs | 008875 | |
| Automated processor | Leica | Leica TP1020 |
References
- van der Flier, L. G., Clevers, H. Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium. Annu Rev Physiol. 71, 241-260 (2009).
- Bjerknes, M., Cheng, H. Methods for the isolation of intact epithelium from the mouse intestine. Anat Rec. 199, 565-574 (1981).
- Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449 (7165), 1003-1007 (2007).
- van der Flier, L. G., Haegebarth, A., Stange, D. E., van de Wetering, M., Clevers, H. OLFM4 is a robust marker for stem cells in human intestine and marks a subset of colorectal cancer cells. Gastroenterology. 137 (1), 15-17 (2009).
- van der Flier, L. G., et al. Transcription factor achaete scute-like 2 controls intestinal stem cell fate. Cell. 136 (5), 903-912 (2009).
- Sangiorgi, E., Capecchi, M. R. Bmi1 is expressed in vivo in intestinal stem cells. Nat Genet. 40 (7), 915-920 (2008).
- Montgomery, R. K., et al. Mouse telomerase reverse transcriptase (mTert) expression marks slowly cycling intestinal stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (1), 179-184 (2011).
- Takeda, N., et al. Interconversion between intestinal stem cell populations in distinct niches. Science. 334 (6061), 1420-1424 (2011).
- May, R., et al. Identification of a novel putative gastrointestinal stem cell and adenoma stem cell marker, doublecortin and CaM kinase-like-1, following radiation injury and in adenomatous polyposis coli/multiple intestinal neoplasia mice. Stem Cells. 26 (3), 630-637 (2008).
- Powell, A. E., et al. The pan-ErbB negative regulator Lrig1 is an intestinal stem cell marker that functions as a tumor suppressor. Cell. 149 (1), 146-158 (2012).
- Pearson, R., Fleetwood, J., Eaton, S., Crossley, M., Bao, S. Kruppel-like transcription factors: a functional family. Int J Biochem Cell Biol. 40 (10), 1996-2001 (2008).
- McConnell, B. B., Yang, V. W. Mammalian Kruppel-like factors in health and diseases. Physiol Rev. 90 (4), 1337-1381 (2010).
- McConnell, B. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. The diverse functions of Kruppel-like factors 4 and 5 in epithelial biology and pathobiology. Bioessays. 29 (6), 549-557 (2007).
- Nandan, M. O., Ghaleb, A. M., Bialkowska, A. B., Yang, V. W. Kruppel-like factor 5 is essential for proliferation and survival of mouse intestinal epithelial stem cells. Stem Cell Res. 14 (1), 10-19 (2015).
- Gelberg, H. B. Comparative anatomy, physiology, and mechanisms of disease production of the esophagus, stomach, and small intestine. Toxicol Pathol. 42 (1), 54-66 (2014).
- De Robertis, M., et al. The AOM/DSS murine model for the study of colon carcinogenesis: From pathways to diagnosis and therapy studies. J Carcinog. 10 (9), (2011).
- Magnus, H. A. Observations on the presence of intestinal epithelium in the gastric mucosa. The Journal of Pathology and Bacteriology. 44 (2), 389-398 (1937).
- Moolenbeek, C., Ruitenberg, E. J. The "Swiss roll": a simple technique for histological studies of the rodent intestine. Lab Anim. 15 (1), 57-59 (1981).
- Park, C. M., Reid, P. E., Walker, D. C., MacPherson, B. R. A simple, practical 'swiss roll' method of preparing tissues for paraffin or methacrylate embedding. J Microsc. 145, Pt 1 115-120 (1987).
- Summersgill, B., Clark, J., Shipley, J. Fluorescence and chromogenic in situ hybridization to detect genetic aberrations in formalin-fixed paraffin embedded material, including tissue microarrays. Nat Protoc. 3 (2), 220-234 (2008).
- Takeda, N., et al. Cardiac fibroblasts are essential for the adaptive response of the murine heart to pressure overload. J Clin Invest. 120 (1), 254-265 (2010).
- el Marjou, F., et al. Tissue-specific and inducible Cre-mediated recombination in the gut epithelium. Genesis. 39 (3), 186-193 (2004).
- McConnell, B. B., et al. Kruppel-like factor 5 is important for maintenance of crypt architecture and barrier function in mouse intestine. Gastroenterology. 141 (4), 1302-1313 (2011).
- Nandan, M. O., et al. Kruppel-like factor 5 is a crucial mediator of intestinal tumorigenesis in mice harboring combined ApcMin and KRASV12 mutations. Mol Cancer. 9 (63), (2010).
- Pirici, D., et al. Antibody elution method for multiple immunohistochemistry on primary antibodies raised in the same species and of the same subtype. J Histochem Cytochem. 57 (6), 567-575 (2009).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. CSH Protoc. 2008, pdb prot4986 (2008).
