This protocol provides step-by-step instruction on how to generate parabiotic zebrafish embryos of different genetic backgrounds. When combined with the unparalleled imaging capabilities of the zebrafish embryo, this method provides a uniquely powerful means to investigate cell-autonomous versus non-cell-autonomous functions for candidate genes of interest.
parabiosis quirúrgica de dos animales de diferentes orígenes genéticos crea un escenario único para el estudio de células intrínseca frente a las funciones de las células extrínseca de genes candidatos de interés, los comportamientos migratorios de las células, y las señales secretadas en los entornos genéticos distintos. Porque los animales parabiotic comparten una circulación común, nada de sangre o factor transmitida por la sangre de un animal se intercambiarán con su pareja y viceversa. Así, las células y los factores moleculares derivadas de uno antecedentes genéticos pueden ser estudiados en el contexto de un segundo fondo genético. Parabiosis de ratones adultos se ha utilizado ampliamente para la investigación del envejecimiento, cáncer, diabetes, obesidad, y el desarrollo del cerebro. Más recientemente, parabiosis de embriones de pez cebra se ha utilizado para estudiar la biología del desarrollo de la hematopoyesis. En contraste con los ratones, la naturaleza transparente de embriones de pez cebra permite la visualización directa de las células en el contexto parabiotic, por lo que es un método única y poderosa para la investigación de fmecanismos celulares y moleculares undamental. La utilidad de esta técnica, sin embargo, está limitada por una curva de aprendizaje para la generación de los embriones de pez cebra parabiotic. Este protocolo proporciona un método paso a paso sobre cómo fusionar quirúrgicamente el blástulas de dos embriones de pez cebra de diferentes orígenes genéticos para investigar el papel de los genes candidatos de interés. Además, los embriones de pez cebra parabiotic son tolerantes a choque térmico, por lo que el control temporal de la expresión génica posible. Este método no requiere una sofisticada puesta a punto y tiene amplias aplicaciones para el estudio de la migración celular, la especificación del destino, y la diferenciación in vivo durante el desarrollo embrionario.
Creación de mosaicos genéticos (quimeras) entre los de tipo salvaje y animales modificados genéticamente es una estrategia bien establecida y clásica para la investigación de células intrínseca frente funciones de las células extrínseca de genes candidatos 1-6. Blastula trasplante en el pez cebra ha sido ampliamente utilizado para generar embriones quiméricos para estudios de células autonomía 7-9. Dependiendo del tejido de interés, sin embargo, puede ser un reto para apuntar predecible células del donante en el tejido deseado (por ejemplo, sangre) 1-3, 7-9. Genetistas de ratón han utilizado mucho los métodos quirúrgicos parabiotic para generar organismos unidos con una circulación compartida 10-14. Debido a que los animales parabiotic comparten un torrente sanguíneo común, las interacciones entre las células que se originaron de un animal con células de los demás animales de un fondo genético diferente pueden ser estudiados 10-16. Recientemente, el grupo de Karima Kissa elegantemente demostrado la capacidad de crecomió embriones de pez cebra unidos y luego utilizar este sistema para estudiar madre hematopoyéticas y la migración de células progenitoras (HSPC) 15. Además, parabiosis pez cebra se utilizó recientemente para investigar el papel de cadherina endotelial 5 en células madre hematopoyéticas de la emergencia (HSC) y la migración, 16 y para estudiar el papel de las células del estroma en el nicho de HSPC durante el desarrollo de pez cebra 17.
A diferencia de los ratones, embriones de pez cebra son transparentes y permiten la visualización directa de las células durante el desarrollo parabiotic, haciendo que el sistema únicamente de gran alcance. La utilidad de parabiosis en el pez cebra, sin embargo, está limitada por una curva de aprendizaje, y la cirugía parabiotic en los embriones delicados puede ser técnicamente difícil sin una instrucción detallada y demostración visual. El objetivo de este protocolo es proporcionar un conjunto de instrucciones claras, paso a paso para acompañar tutoriales basados en vídeo sobre cómo generar embriones de pez cebra para el estudio de parabioticfunciones de las células extrínseca de un gen (s) candidato por fusión quirúrgica de desarrollar blástulas temporal, celular intrínseco, o. modificaciones clave y recomendaciones adicionales para aumentar la supervivencia parabiont y nuevas aplicaciones experimentales se incluyen.
Parabiotic fusión ha sido una herramienta poderosa para investigar las funciones celulares de genes candidatos en modelos murinos adultos y embriones de pollo de 10-14. Más recientemente, un método de fusión de blástula se ha descrito para la generación de embriones de pez cebra unidos 15. En el presente protocolo, tutoriales basados en vídeo se utilizan para demostrar y describir la metodología para la creación de embriones de pez cebra parabiotic de diferentes orígenes genéticos …
The authors have nothing to disclose.
We thank Julie R. Perlin for helpful comments on the manuscript. D.I.S. is supported by grants from the American Society of Hematology, the Cooley’s Anemia Foundation, and the NIH (K01DK085217 and R03DK100672). E.J.H. is a Howard Hughes Medical Institute Fellow of the Helen Hay Whitney Foundation. B.L. is a Howard Hughes Medical Institute Medical Research Fellow. B.W.B. is supported by an Irvington Fellowship from the Cancer Research Institute and a Young Investigator Award from the Conquer Cancer Foundation of ASCO. L.I.Z. is supported by grants from the NIH (R01CA103846, P01HL032262, and R01HL04880), Taub Foundation for MDS Research, Harvard Stem Cell Institute, and is an investigator of the Howard Hughes Medical Institute.
Methyl cellulose | Sigma | M0387 |
Individual components for E3/HCR: | For 1L: 14,61g NaCl, 0,63g KCl, 2,43g CaCl2-2H2O, 1,99g MgSO4 | |
NaCl (Sodium chloride) | Sigma-Aldrich | S9888 |
KCl (Potassium chloride) | Sigma-Aldrich | P9541 |
CaCl2 (Calcium chloride dihydrate) | Sigma-Aldrich | 223506 |
MgSO4 (Magnessium sulfate heptahydrate) | Sigma-Aldrich | 230391 |
Hepes (1M ) buffer solution | ThermoFisher | 15630-080 |
Name | Company | Catalog Number |
Antibiotics: | ||
Pen/Strep | gibco by Life technologies | 15140-120 |
Ampicilin sodium salt | Sigma Life Science | A0166 |
Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus | Sigma Life Science | K1377 |
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number |
50 mg/ml Pronase from Streptomyces griseus | Roche | 11459643001 |
capillary glass used for needles (Capillary Glass & Filaments) | Sutter Instrument | ITEM#: BF 100-50-10 |
Teasing needles with wooden handles | Fisher Scientific | S07894 |
Glass Pasteur pipettes | Fisherbrand | 13-678-20A |
10 mL pipette pump (green) (Pipette Pump Pipettor) | Novatech International | F37898-0000 |
100 mm diameter/ 20 mm deep plastic petri dishes (PETRI DISH, 100/20 MM, PS, CLEAR, WITH VENTS, HEAVY DESIGN, 15 PCS./BAG ) |
Greiner Bio-one | 664102 |
Dextran, Cascade Blue, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable | ThermoFisher | D-1976 |
PTU. working stock is 0.003% (50X is 0.15%). for 500ml, 0.75 g N-Phenylthiourea | Sigma-Aldrich | P7629 |
Tricaine (powder) (Tricaine Methanesulfonato, Tricaine-S) | Western Chemical Inc | MS 222 |
LMP agarose (Ultrapure LMP agarose) | Invitrogen | 16520100 |
plastic transfer pipette (just the wide ended one I think) | Fisherbrand | 137115AM |
Glass-bottom 6-well plates used for imaging | MatTek | P06G1.5-20-F |
plastic western gel loading tip fixed on the end of a wood-handled dissecting needle (GELoader tips) | Eppendorf | 22351656 |
glass cover slips, slides and vacuum grease if mounting for an upright microscope: | ||
Vaccum grease ( Dow Corning® high-vacuum silicone grease colorless, weight 5.3 oz (tube) ) |
Dow Corning | Z273554 |
Glass cover slips | Corning Life Sciences | 2960-244 |