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Immunology and Infection

अस्थि मज्जा पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं का रेट्रोवायरल transduction टी सेल रिसेप्टर Retrogenic चूहे उत्पन्न करने के लिए

Published: July 11, 2016 doi: 10.3791/54196
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Pediatrics, Baylor College of Medicine

Introduction

टी सेल रिसेप्टर (TCR) मनुष्यों और चूहों के प्रदर्शनों की सूची 1 एक्स 10 8 और 2 एक्स 10 6 अद्वितीय TCRs क्रमश: 1,2 में अनुमान लगाया गया है। यह बड़ी विविधता टी कोशिकाओं आत्म पेप्टाइड्स के साथ ही प्रमुख उतक अनुरूपता जटिल (एमएचसी) प्रतिजन कोशिकाओं (APCs) पर द्वारा प्रस्तुत रोगजनकों से निकाली गई प्रतिजन epitopes का एक विशाल सरणी पहचान करने के लिए अनुमति देता है। अद्वितीय पेप्टाइड एमएचसी परिसरों के साथ TCRs की बातचीत में सूक्ष्म अंतर हुक्म है कि क्या एक टी सेल apoptosis, निष्क्रियता, सक्रियण, भेदभाव, साइटोकाइन उत्पादन या cytotoxicity से गुजरना होगा। हालांकि, बड़े TCR प्रदर्शनों की सूची की वजह से, कैसे एक विशिष्ट TCR एक विशेष प्रतिजन का जवाब देंगे के विश्लेषण के एकल TCR सिस्टम के उपयोग की आवश्यकता है।

विभिन्न TCR ट्रांसजेनिक चूहों एक विवो मॉडल 3-9 में एक भी TCR के समारोह का अध्ययन करने के क्रम में उत्पन्न किया गया है। हालांकि, वहाँ सहित ट्रांसजेनिक चूहों TCR करने के लिए निरंतर कर रहे हैंलागत, समय एक भी ट्रांसजेनिक माउस और germline डीएनए 10 में यादृच्छिक ट्रांस्जीन प्रविष्टि के तथाकथित संस्थापक प्रभाव उत्पन्न करने के लिए की लंबाई। इसलिए, अपेक्षाकृत कुछ TCR ट्रांसजेनिक चूहों किसी भी प्रतिजन के लिए उत्पन्न किया गया है और एक ही मिलान के लिए उच्च और निम्न TCR समानता के कार्यात्मक निहितार्थ शायद ही कभी संबोधित कर रहे हैं। और स्क्रीन करने के लिए एक तेजी से दृष्टिकोण की आवश्यकता का पता व्यक्तिगत रूप से या संयोजन में कई TCRs का अध्ययन करने के लिए, retrogenic ( 'रेट्रो' रेट्रोवायरस से और ट्रांसजेनिक से 'Genic') चूहों ट्रांसजेनिक चूहों 11-13 TCR के लिए एक विकल्प के रूप में उपयोग किया गया है।

2A पेप्टाइड आम सहमति के मूल भाव के कई वायरस के भीतर पाया, एक 2A-एएसपी-वैल / इले-भरमार एक्स-Asn-प्रो-Gly -2 बी-प्रो से मिलकर बनता है, जिसमें दरार 2A की ग्लाइसिन और 2 बी के प्रोलाइन के बीच होता है सीआईएस -acting hydrolase गतिविधि से, अनुवाद 10,14-16 दौरान ribosomal लंघन हो जाती है। एक विस्तृत चित्र ग चित्रण के लिएविभिन्न 2A पेप्टाइड (F2A, E2A, T2A और P2A) की leavage संदर्भों 10 के लिए कृपया देखें - इस तरीके में 12, 2 cistrons (TCR अल्फा और बीटा TCR) एक एकल वेक्टर में stoichiometric अनुवाद में जिसके परिणामस्वरूप जोड़ा जा सकता है। इस दृष्टिकोण का उपयोग, हम व्यक्त करने के लिए और सीधे विवो में कई विशिष्ट प्रतिजन TCRs की तुलना में सक्षम हैं।

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Protocol

आचार कथन: हर संभव प्रयास विकिरण और पूंछ नस में इंजेक्शन के दौरान एक न्यूनतम करने के लिए पशु परेशानी या तनाव रखने के लिए बनाया गया है। चूहों इन प्रयोगों में कोशिकाओं का एक स्रोत के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं; इस तरह के रूप में कोई प्रक्रियाओं या जोड़तोड़ इच्छामृत्यु से अलग कर रहे हैं। चूहे मौत की पुष्टि करने के लिए ग्रीवा अव्यवस्था के बाद सीओ 2 साँस लेना द्वारा euthanized किया जाएगा। यह प्रक्रिया पशु चिकित्सा अमेरिकन मेडिकल एसोसिएशन के इच्छामृत्यु पर पैनल की सिफारिशों के अनुरूप है।

1. तैयार रेट्रोवायरल का निर्माण

  1. उप-क्लोन टी सेल रिसेप्टर (TCR) अल्फा और बीटा चेन, एक 2A लिंकर द्वारा अलग एक MSCV आधारित रेट्रोवायरल 11 वेक्टर (उदाहरण के लिए, pMIAII या pMIGII) 11 में।
    नोट: 2A लिंकर एक भी खुला पढ़ने फ्रेम से अल्फा और बीटा TCR चेन की stoichiometric और सहमत अभिव्यक्ति के लिए अनुमति देता है। वेक्टर एक IRES फ्लोरोसेंट प्रोटीन कैसेट (Ametrine या GFP) है कि करने के लिए प्रयोग किया जाता है शामिलtransduced कोशिकाओं और पारगमन दक्षता को ट्रैक। एक विस्तृत प्रोटोकॉल के लिए कृपया Holst एट अल देखें। 11
  2. व्यावसायिक रूप से प्राप्त प्लाज्मा प्रस्तुत करने का किट या इसी तरह के एक उत्पाद का उपयोग प्लास्मिड डीएनए अलग। 1 के एक काम एकाग्रता का प्रयोग करें - 2 माइक्रोग्राम μl -1।

2. रेट्रोवायरल निर्माता सेल लाइनों की पीढ़ी

  1. एक दो कदम प्रक्रिया का उपयोग रेट्रोवायरल निर्माता सेल लाइनों का उत्पादन।
    नोट: एक विस्तृत प्रोटोकॉल के लिए, देखने के लिए कृपया Holst एट अल 11।।
    1. तीन plasmids (pVSVG, PEQ-Pam3 (ई) और ब्याज में 11 वेक्टर) के साथ 293T कोशिकाओं के क्षणिक अभिकर्मक से रेट्रोवायरस पैदा करते हैं और जीपी + E86 ecotropic रेट्रोवायरल निर्माता सेल लाइन transduce को 293T कोशिकाओं से सतह पर तैरनेवाला रेट्रोवायरल ले।
    2. FACS द्वारा फ्लोरोसेंट व्यक्त जीपी + E86 उत्पादक कोशिकाओं के शीर्ष 40% अलग करने और वायरस का एक स्रोत के रूप में transdcuced-जीपी + E86 उत्पादक कोशिकाओं प्रचार।
      नोट: पीढ़ीउच्च अनुमापांक उत्पादकों अस्थि मज्जा कोशिकाओं के कुशल पारगमन के लिए महत्वपूर्ण है। एक पूरा प्रोटोकॉल के लिए Holst एट अल देखने के लिए कृपया। 11

3. Retrovirus की मध्यस्थता स्टेम सेल जीन स्थानांतरण (दिवस -5)

  1. बाहर गला लें और पूर्ण DMEM में संस्कृति 0.5 -1.0 एक्स 10 6 प्रत्येक जीपी + E86 निर्माता सेल लाइन का 10% (/ खंड खंड) FBS इस प्रोटोकॉल के दिन 0 से दो मिला हुआ 150 मिमी प्लेट के लिए पर्याप्त विकास की अनुमति है।
    नोट: विगलन 0.5 - डे 5. यह भी आदेश जीपी + E86 का विस्तार करने में संस्कृति के 5 दिनों के लिए अनुमति देता है पर 50% confluency - एक 10 सेमी की थाली में 1.0 x 10 6 प्रत्येक जीपी + E86 निर्माता सेल लाइन के 30 के लिए अनुमति देगा 0 दिवस से दो मिला हुआ 150 मिमी प्लेट के लिए निर्माता सेल लाइनों।
    1. 5% feta बछड़ा सीरम, और सिप्रोफ्लोक्सासिन (10 माइक्रोग्राम / एमएल) माइकोप्लाज्मा संक्रमण से बचने के लिए युक्त पूरा टिशू कल्चर मीडिया में संस्कृति रेट्रोवायरल निर्माता सेल लाइन।
      नोट: जब generatin सिप्रोफ्लोक्सासिन का उपयोग बंदजी अस्थि मज्जा पारगमन के लिए वायरल सतह पर तैरनेवाला। निर्माता सेल लाइन के ओवर-विकास से बचें, यह नकारात्मक अस्थि मज्जा पारगमन क्षमता को प्रभावित करेगा।

5-फ्लूरोरासिल (5-फू) (डे -3) के साथ 4. इंजेक्षन दाता चूहों

  1. दाता चूहों का वजन (5 - 12 सप्ताह पुराने) 5-फू की राशि की आवश्यकता का निर्धारण करने के लिए। कम अस्थि मज्जा उपज में उम्र परिणामों के 5 हफ्तों से युवा चूहों का उपयोग करना। एक भी TCR की अभिव्यक्ति सुनिश्चित करने के लिए इस तरह के एस.सी.आई.डी, खपरैल या TCR अल्फा अस्थि मज्जा दाताओं के रूप में चूहों की कमी के रूप में एक टी सेल की कमी माउस तनाव का उपयोग करें।
  2. टिशू कल्चर हुड में कार्य करना, क्रम में 10 मिलीग्राम मिलीलीटर की एक पर्याप्त राशि -1 5-फू का काम कर समाधान शरीर के वजन के प्रति ग्राम 0.15 मिलीग्राम 5-फू वितरित करने के लिए बनाने के लिए बाँझ पीबीएस के साथ 5-फू शेयर पतला।
  3. एक 37 जी सुई के साथ एक 1 मिलीलीटर सिरिंज का प्रयोग, intraperitoneal दाता माउस प्रति शरीर के वजन के प्रति ग्राम इंजेक्षन 0.15 मिलीग्राम 5-फू।
    नोट: का प्रयोग एक प्राप्तकर्ता प्रति 1 दाता माउस शुरू करते हैं और समायोजित करने के लिएसेल उपज के अनुसार दाता चूहों की संख्या। संवर्धन और अस्थि मज्जा progenitors के अलगाव के लिए 5-फू उपचार के लिए एक वैकल्पिक विधि Viret एट अल में वर्णित के रूप में वंश सकारात्मक कोशिकाओं के नकारात्मक चयन है।

5. अस्थि मज्जा निष्कर्षण प्रक्रिया दिवस (0)

  1. हड्डी अलगाव के लिए विच्छेदन कैंची और संदंश प्राप्त करते हैं। एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में हड्डियों को इकट्ठा करने के लिए मीडिया (HbSS 5% एफसीएस (/ खंड खंड के साथ पूरक)) तैयार करें। 50 मिलीलीटर बर्फ पर मीडिया वाले शंक्वाकार रखें। सीओ द्वारा चूहों euthanize 2 साँस लेना मौत की पुष्टि करने के लिए गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा पीछा किया। पंजा चुटकी सुनिश्चित करने के लिए कोई सजगता पता चला रहे हैं।
  2. शल्य साइट और इथेनॉल या मेथनॉल के साथ सर्जिकल उपकरण जीवाणुरहित। पहली बार कटौती करके और श्रोणि करधनी के तहत ध्यान से फीमर, टिबिया, प्रगंडिका, और श्रोणि करधनी निकालें। वापस नीचे टिबिया को फीमर के साथ काटा। कैंची और संदंश का उपयोग कर साफ हड्डियों प्राप्त करने के लिए सभी आसपास के ऊतक निकालें। रखनाHBSS + 5% (/ खंड खंड) FBS में हाइड्रेटेड हड्डियों।
  3. जोड़ों में कटौती, दोनों एक हड्डी बंद सिरों में कटौती करने के लिए सुनिश्चित कर रही द्वारा हड्डियों को अलग करें। एक 25 गेज सुई एक 10 मिलीलीटर HBSS + 5% (/ खंड खंड) युक्त सिरिंज FBS से जुड़ी डालें। दबाव लागू करते हैं और एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार में एक 70 माइक्रोन झरनी आराम के माध्यम से सभी अस्थि मज्जा फ्लश।
  4. समय समय पर, एक 1 मिलीलीटर या 3 मिलीलीटर सिरिंज से सवार का उपयोग कर 70 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से अस्थि मज्जा धक्का। HBSS + 5% (/ खंड खंड) FBS के साथ झरनी कुल्ला। यह एक एकल कक्ष निलंबन कि हड्डी के टुकड़े और ऊतकों की नि: शुल्क है सुनिश्चित करेगा। कोशिकाओं को एक बाँझ हुड में प्रक्रिया के प्रदर्शन से बाँझ रखें।
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 300 XG पर अपकेंद्रित्र अस्थि मज्जा कोशिकाओं।

6. अस्थि मज्जा संस्कृति (0 दिन)

  1. छानना या महाप्राण मीडिया और 1 मिलीलीटर अमोनियम क्लोराइड आधारित लाल रक्त lysis बफर (या आरबीसी lysis बफर समकक्ष) प्रति 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में resuspend सेल गोली। कमरे पर 1 मिनट ऊष्मायन के बादतापमान, पूरा DMEM 20% (/ खंड खंड) FBS की 10 मिलीलीटर जोड़कर लाल सेल बफर बुझा लेते हैं।
  2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 300 XG पर अपकेंद्रित्र कोशिकाओं।
  3. छानना या महाप्राण सतह पर तैरनेवाला और resuspend 5 मिलीलीटर पूरा DMEM 20% (/ खंड खंड) FBS में अस्थि मज्जा। एक Neubauer गिनती चैम्बर के साथ कोशिकाओं की गणना।
    नोट: जनरल उपज होना चाहिए लगभग 5 - 10 माउस प्रति x 10 6 कोशिकाओं; हालांकि, उपज चूहों के विभिन्न प्रकारों के बीच भिन्न हो सकते हैं।
  4. पूरा DMEM 20% (/ खंड खंड) FBS आईएल -3 के साथ पूरक के 30 मिलीलीटर में प्रति 150 मिमी प्लेट 4 एक्स 10 7 कोशिकाओं के घनत्व पर प्लेट अस्थि मज्जा कोशिकाओं (20 ग्राम मिलीलीटर -1), आईएल -6 (50 जी मिलीलीटर -1) और एस सी एफ (50 ग्राम मिलीलीटर -1)।
    नोट: हौसले thawed-aliquoted साइटोकिन्स का प्रयोग करें। साइटोकिन्स कि अधिक से अधिक 2 सप्ताह के लिए जमे हुए किया गया है और एक बार से अधिक thawed या रखा 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रयोग न करें।
  5. 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर अस्थि मज्जा रातोंरात (लगभग 24 घंटे) सेते हैं।

  1. प्लेट 3 एक्स 10 6 रेट्रोवायरल निर्माता प्रति 150 मिमी प्लेट 18 मिलीलीटर पूरा DMEM 20% (/ खंड खंड) FBS में कोशिकाओं।
  2. रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर रेट्रोवायरल उत्पादक कोशिकाओं को सेते हैं। (- 3 दाता चूहों लगभग 2) 15 लाख अस्थि मज्जा कोशिकाओं के लिए एक 150 मिमी प्लेट आशा।

8. रेट्रोवायरल सतह पर तैरनेवाला (1 दिन)

  1. अगले दिन (लगभग 24 घंटा बाद में), निर्माता प्लेट (चरण 7 में सेट अप) से रेट्रोवायरल सतह पर तैरनेवाला फसल को रेट्रोवायरल सतह पर तैरनेवाला एक 10 मिलीलीटर सिरिंज और फिल्टर एक 0.45 का उपयोग कर के साथ 150 एमएम की थाली से दूर सीधे ड्राइंग द्वारा -μm सिरिंज फिल्टर।
  2. ध्यान से ताजा पूरा DMEM 20% (/ खंड खंड) FBS की 18 मिलीलीटर के साथ हटा दिया रेट्रोवायरल सतह पर तैरनेवाला जगह।
  3. अनुपूरक आईएल -3 के साथ छान रेट्रोवायरल सतह पर तैरनेवाला (20 ग्राम मिलीलीटर -1), आईएल -6 (50 ग्राम मिलीलीटर -1), MSCF (50 ग्राम मिलीलीटर -1) और Hexadimethrine ब्रोमाइड (Polybrene) (6 &# 956; छ मिलीलीटर -1)।
    नोट: Hexadimethrine ब्रोमाइड ताजा हर 2 महीने रेट्रोवायरल पारगमन की प्रभावकारिता में एक बूंद से बचने के लिए किया जाना चाहिए।

9. अस्थि मज्जा हार्वेस्ट दिवस (1)

  1. कदम 8.3 पूरा करने के बाद, चरण 6.4 से अस्थि मज्जा कोशिकाओं फसल और बाँझ 50 मिलीलीटर ट्यूबों में गैर पक्षपाती कोशिकाओं से युक्त मीडिया को हस्तांतरण।
  2. 10 मिलीलीटर पीबीएस के साथ सख्ती प्लेटें धोने और कदम 9.1 से 50 मिलीलीटर शंक्वाकार में इकट्ठा। यदि आवश्यक हो, धोने कदम दोहराएँ।
  3. अपकेंद्रित्र 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 300 XG पर कोशिकाओं, सतह पर तैरनेवाला छानना, एक छोटी मात्रा में resuspend कोशिकाओं (1 - 3 एमएल) पूरा DMEM 20% (/ खंड खंड) FBS, और गिनती। साइटोकिन्स और Hexadimethrine ब्रोमाइड युक्त रेट्रोवायरल सतह पर तैरनेवाला के 1 मिलीलीटर प्रति 1 x 10 6 कोशिकाओं में दिन 0. Resuspend अस्थि मज्जा से 75% वसूली - 50 आशा।

10 अस्थि मज्जा पारगमन दिवस (1)

  1. प्लेट रेट्रोवायरल सतह पर तैरनेवाला / हड्डी एमएएक छह अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट में अच्छी तरह से प्रति 3 मिलीलीटर की एक मात्रा में rrow मिश्रण। लपेटें प्लास्टिक की चादर में प्लेटों कदम 10.2 में centrifugation के दौरान गैस विनिमय कम से कम।
  2. 60 मिनट के एक 37 डिग्री सेल्सियस के लिए 1,000 XG पर लिपटे छह अच्छी तरह प्लेटें स्पिन।
  3. स्पिन के बाद पूरा हो गया, प्लास्टिक की चादर को हटा दें और 24 घंटे के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस सीओ 2 इनक्यूबेटर में प्लेटें जगह है।

11. रेट्रोवायरल तैरनेवाला और पारगमन (2 दिन)

  1. 24 घंटे के बाद, वायरल निर्माता सेल लाइन से ताजा वायरल सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा। एक 10 मिलीलीटर सिरिंज और एक 0.45 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर का उपयोग रेट्रोवायरल सतह पर तैरनेवाला फ़िल्टर। अनुपूरक आईएल -3 के साथ छान रेट्रोवायरल सतह पर तैरनेवाला (20 ग्राम मिलीलीटर -1), आईएल -6 (50 ग्राम मिलीलीटर -1) और एस सी एफ (50 ग्राम मिलीलीटर -1) और Hexadimethrine ब्रोमाइड (6 ग्राम मिलीलीटर -1)।
  2. अगला, ध्यान विंदुक के साथ हटाने या अस्थि मज्जा कोशिकाओं से युक्त छह अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से मीडिया के शीर्ष 2 मिलीलीटर aspirate।
    नोट: कार्य सावधानी से अस्थि मज्जा, जो आम तौर पर अच्छी तरह से के बीच में केंद्रित है aspirate के लिए नहीं। वैकल्पिक रूप से, सतह पर तैरनेवाला हटा किसी भी खो अस्थि मज्जा कोशिकाओं को ठीक करने के लिए नीचे काता जा सकता है।
  3. अच्छी तरह से अस्थि मज्जा 6 अच्छी तरह से थाली में प्रत्येक के लिए ताजा वायरल सतह पर तैरनेवाला युक्त साइटोकिन्स और Hexadimethrine ब्रोमाइड के 3 मिलीलीटर जोड़ें। प्लास्टिक में प्लेटों लपेटें, और 60 मिनट के एक 37 डिग्री सेल्सियस के लिए 1,000 XG पर स्पिन पारगमन को दोहराएँ। प्लेटों खोलना, और 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 रातोंरात (के बारे में 24 घंटा) पर कोशिकाओं सेते हैं।

12. ताजा पूरक DMEM के अलावा (3 दिन)

  1. 24 घंटे के बाद, कदम 11.2 में के रूप में छह अच्छी तरह से थाली अस्थि मज्जा की कोशिकाओं, जिसमें से प्रत्येक में अच्छी तरह से मीडिया के शीर्ष 2 मिलीलीटर को हटा दें। हटा मीडिया ताजा DMEM 20% (/ खंड खंड) FBS आईएल -3 के अंतिम सांद्रता के साथ पूरक के साथ (छ मिलीलीटर -1 50) बदलें (20 ग्राम मिलीलीटर -1), आईएल -6 (50 ग्राम मिलीलीटर -1) और एससीएफ ।
  2. अस्थि मज्जा सेते37 एक और 24 घंटे के लिए डिग्री सेल्सियस सीओ 2 इनक्यूबेटर में प्लेटें।

13. हार्वेस्ट transduced अस्थि मज्जा (4 दिन)

  1. 24 घंटे के बाद, छह अच्छी तरह प्लेटों से अस्थि मज्जा कोशिकाओं को इकट्ठा। सभी गैर-पक्षपाती कोशिकाओं को दूर करने के लिए पीबीएस के साथ सख्ती प्लेटें धोने।
    1. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 300 XG पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला छानना।
    2. पीबीएस + 0.5% (/ खंड खंड) की एक छोटी मात्रा (1 मिलीलीटर) में अस्थि मज्जा गर्मी निष्क्रिय FBS Resuspend। बर्फ पर कोशिकाओं रखें।
  2. प्रत्येक अस्थि मज्जा हालत की एक 10 μl नमूना ले लो और एक Neubauer गिनती कक्ष का उपयोग कोशिकाओं की गिनती। यह मानते हुए 1 - प्राप्तकर्ता प्रति 2 दाता, उपज प्राप्तकर्ता माउस के अनुसार कम से कम 4 x 10 6 कोशिकाओं हस्तांतरण करने के लिए पर्याप्त होगा। पीबीएस + 0.5% (/ खंड खंड) गर्मी निष्क्रिय FBS की पर्याप्त मात्रा में अस्थि मज्जा Resuspend 200 इंजेक्षन करने के लिए - माउस प्रति 300 μl।
    1. एक पारगमन दक्षता के साथ कम से कम 2 x 10 6 कोशिकाओं इंजेक्षन25% के माउस प्रति नसों (8 x10 6 कोशिकाओं के लिए ऊपर इंजेक्षन कर सकते हैं)।
      नोट: हम नियमित रूप से अस्थि मज्जा कोशिकाओं के दो 6 अच्छी तरह प्लेटें प्रति पांच प्राप्तकर्ता चूहों इंजेक्षन। उपज काफी कम है, तो अधिक दाता चूहों जब तक पर्याप्त संख्या में अस्थि मज्जा से प्राप्त किया जा सकता है इस्तेमाल किया जाना चाहिए। आदेश में इष्टतम पुनर्गठन को प्राप्त करने के लिए, कम से कम 5 x 10 5 transduced (फ्लोरोसेंट सकारात्मक) प्रत्येक प्राप्तकर्ता में इंजेक्ट किया जाना चाहिए।
  3. एक माइक्रो pipettor के साथ, प्रत्येक अस्थि मज्जा हालत की एक 10 μl नमूना लेने के लिए और फ्लोरोसेंट मार्कर (चित्रा 1 ए) 11 की अभिव्यक्ति पर आधारित प्रवाह cytometry द्वारा पारगमन क्षमता का विश्लेषण।
    नोट: आम तौर पर, फ्लोरोसेंट सकारात्मक कोशिकाओं का प्रतिशत 25% और 70% के बीच, निर्माण और रेट्रोवायरल अनुमापांक पर निर्भर करता है। आवश्यक ट्रांसड्यूस अस्थि मज्जा की कोशिकाओं की संख्या में पुनर्गठित करने के लिए एक उप-घातक चमकाना माउस पारगमन दक्षता के आधार पर भिन्न हो सकते हैं। कम Transduction दक्षता, अधिक अस्थि मज्जा की कोशिकाओं की आवश्यकता है और इसके विपरीत, उच्च अस्थि मज्जा पारगमन दक्षता, कोशिकाओं की कम संख्या के पुनर्गठन के लिए जरूरी है। 25% से नीचे पारगमन दक्षता सबऑप्टिमल है और अपर्याप्त पुनर्गठन और अस्तित्व में हो सकता है। आदेश में इष्टतम अस्थि मज्जा वसूली और पारगमन दक्षता सुनिश्चित करने के लिए, हौसले से तैयार टिशू कल्चर मीडिया और साइटोकिन्स का उपयोग करें। जब retrogenic प्रणाली का उपयोग एक नया TCR व्यक्त, विवो में है कि TCR के चयन अज्ञात है। प्रत्येक व्यक्ति TCR आत्मीयता के आधार पर, थाइमस और परिधीय टी सेल अभिव्यक्ति में TCR चयन 17 अलग अलग होंगे।

14. माउस विकिरण, अस्थि मज्जा इंजेक्शन और देखभाल

  1. चूहों अस्थि मज्जा इंजेक्शन से पहले दिन (13 कदम के रूप में एक ही दिन) चमकाना। निम्नलिखित खुराक का उपयोग करें: C57BL / 6 चूहों (और अन्य जंगली प्रकार उपभेदों), 900 rads; Rag1 - / - चूहों, 500 rads; SCID चूहों, 300 rads)।
    1. Amoxicillin पर प्लेस प्राप्तकर्ता चूहों (50 मिलीग्राम / किग्रा / दिन) या विकिरण से पहले एक और एंटीबायोटिक जल उपचार, और अस्थि मज्जा इंजेक्शन के बाद पहले दो हफ्तों के लिए एंटीबायोटिक दवाओं पर रहते हैं।
      नोट: इष्टतम विकिरण खुराक अनुभव से निर्धारित किया जा सकता है।
  2. इंजेक्शन के लिए, कुंद सुइयों का उपयोग तुरंत इंजेक्शन से पहले, उसके बाद सुई को 27 गेज इंजेक्शन के लिए, बदलने हवा का आवेश से बचने के लिए किसी भी हवाई निष्कासित एक 1 मिलीलीटर सिरिंज में कदम 13.1 से कोशिकाओं को लोड। एक हीटिंग दीपक के तहत गर्मी चूहों और नसों माउस प्रति अस्थि मज्जा का 0.2 मिलीग्राम इंजेक्षन।
    नोट: कोशिकाओं समय के किसी भी लम्बाई या कोशिकाओं के आदी हो जाएगा के लिए सिरिंज में बैठने की अनुमति न दें।
  3. साप्ताहिक चूहों पर नजर रखने के लिए सुनिश्चित करें कि वे स्वस्थ रहते हैं।
  4. 5 के बाद - 6 सप्ताह, GFP + / Ametrine + और ​​TCR सह अभिव्यक्ति (चित्रा 1 बी) 11 के आधार पर पुनर्गठन के लिए जाँच करने के लिए चूहों खून बहाना।

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Representative Results

अस्थि मज्जा पारगमन दक्षता प्रोटोकॉल के चरण में 13.3 पर जाँच की है इससे पहले कि अस्थि मज्जा पूंछ नस चतुर्थ में इंजेक्ट किया जाता प्रतिनिधि अस्थि मज्जा पारगमन आंकड़ा (चित्रा 1 ए) में, काटा अस्थि मज्जा का लगभग 10 μl के 100 μl के लिए जोड़ा गया पीबीएस और Ametrine अभिव्यक्ति के लिए विश्लेषण किया। आम तौर पर फ्लोरोसेंट सकारात्मक कोशिकाओं का प्रतिशत निर्माण और रेट्रोवायरल अनुमापांक के आधार पर, 25% और 70% के बीच है। 6 सप्ताह के अस्थि मज्जा इंजेक्शन के बाद, चूहों अस्थि मज्जा पुनर्गठन (चित्रा 1 बी) निर्धारित करने के लिए लहूलुहान कर रहे हैं। लगभग परिधीय रक्त का 25 μl लाल सेल lysed और विरोधी TCRβ साथ सना हुआ था। चित्रा 2B में सभी TCR सकारात्मक कोशिकाओं सादृश्यपूर्वक Ametrine फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करते हैं।

आकृति 1
figuपुन 1. अस्थि मज्जा पारगमन और परिधीय TCR Retrogenic टी कोशिकाओं का उदाहरण है। ए) पारगमन अस्थि मज्जा की कोशिकाओं की दक्षता में अस्थि मज्जा हस्तांतरण के दिन पर फ्लोरोसेंट मार्कर (Ametrine) के आधार पर विश्लेषण किया है। काटा अस्थि मज्जा का लगभग 10 μl पीबीएस के 100 μl को जोड़ा गया और Ametrine अभिव्यक्ति के लिए विश्लेषण किया गया था। एक सफल अस्थि मज्जा पारगमन 25% और 70%। बी) TCR retrogenic टी कोशिकाओं परिधीय रक्त में 6 सप्ताह के बाद अस्थि मज्जा पुनर्गठन का उदाहरण के बीच फ्लोरोसेंट सकारात्मक कोशिकाओं का एक प्रतिशत निकलेगा। परिधीय रक्त प्राप्त किया गया था और लाल रक्त कोशिकाओं आरबीसी lysis बफर के साथ lysed थे। शेष कोशिकाओं TCRβ के लिए दाग रहे थे। Ametrine अभिव्यक्ति और विरोधी TCRβ 6 सप्ताह के बाद अस्थि मज्जा पुनर्गठन धुंधला करने के लिए प्रतिनिधि विश्लेषण। टी का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करेंउसका आंकड़ा।

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Discussion

प्रोटोकॉल में, इष्टतम अस्थि मज्जा स्वास्थ्य, पारगमन दक्षता और पुनर्गठन सुनिश्चित करने के लिए विस्तार के लिए कई महत्वपूर्ण कदम हम। पहला महत्वपूर्ण कदम पीढ़ी और जीपी + E86 वायरल उत्पादक कोशिकाओं के समुचित रखरखाव है। जल्दी पारित होने के निर्माता सेल लाइनों का प्रयोग करें और 80% confluency या उपयोग करने के लिए कम से पहले पर बनाए रखें। जब ताजा जीपी + E86 वायरल उत्पादक कोशिकाओं कर रही है, यह सुनिश्चित 293T कोशिकाओं जल्दी पारित होने और 24 के लिए संस्कृति में बढ़ रहे हैं - 48 घंटा। पारगमन के चरण के दौरान भी कई जीपी + E86 चढ़ाना कोशिकाओं वायरल अनुमापांक कम होगी। वायरल अनुमापांक निर्धारित Holst एट अल। 11 में वर्णित के रूप में सुनिश्चित करने के लिए जीपी + E86 मजबूत वायरल निर्माता हैं। इसके अतिरिक्त, काटा अस्थि मज्जा से लाल रक्त कोशिकाओं को हटाने के पारगमन दक्षता में सुधार। अस्थि मज्जा progenitors के स्वास्थ्य को सुनिश्चित करने प्रोटोकॉल की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है। यह अंत करने के लिए, हमेशा ताजा मीडिया (4 डिग्री सेल्सियस के बाद से एफसीएस पूरक पर कम से कम 4 सप्ताह) और ताजा साइटोकिन्स (कम उपयोग करें2 सप्ताह की तुलना में जब 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा)। Hexadimethrine ब्रोमाइड भी गिरावट के प्रति संवेदनशील एक बार यह समाधान में है, हर 2 महीने है और नए सिरे से बनाया जाना चाहिए। अन्य जानकारी है कि इष्टतम अस्थि मज्जा स्वास्थ्य और पारगमन सुनिश्चित करेगा स्पिन पारगमन से पहले सेंट्रीफ्यूज पूर्व वार्मिंग शामिल हैं। 37 डिग्री सेल्सियस पर स्पिन transduce और प्लास्टिक की चादर के साथ प्लेटों को कपड़े में लपेटकर जितना संभव हो उतना गैस विनिमय कम करने के लिए। इसके अलावा, अस्थि मज्जा 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर के बाहर या इस रूप में समय की विस्तारित अवधि के कोशिका मृत्यु बढ़ाने के लिए और अस्थि मज्जा पारगमन और पुनर्गठन कमी होगी लिए बर्फ पर बैठने देना नहीं है। अस्थि मज्जा की कोशिकाओं 4 दिन (चरण 13) पर काटा गया है के बाद, केवल तुरंत चूहों इंजेक्शन लगाने से पहले सीरिंज लोड। अंत में, यह सुनिश्चित करें कि चूहों पर एंटीबायोटिक दवाओं से पहले या विकिरण के दिन दिन रखा जाता है।

इस रेट्रोवायरल मध्यस्थता पारगमन प्रोटोकॉल का उपयोग अस्थि मज्जा पूर्वज है, जिसके परिणामस्वरूप कोशिकाओं के पारगमन के लिए अनुमति देता हैटी सेल रिसेप्टर retrogenic चूहों की पीढ़ी। Retrogenic चूहों TCR ट्रांसजेनिक चूहों और लागत एक भी TCR ट्रांसजेनिक पैदा करने की तुलना में काफी कम से कम उत्पन्न करने के लिए तेजी से कर रहे हैं। हालांकि, retrogenic चूहों नस्ल नहीं किया जा सकता और प्रत्येक प्रयोग 10 के साथ नए सिरे से उत्पन्न करना चाहिए। परिधीय टी कोशिकाओं की संख्या retrogenic चूहों में कम से TCR ट्रांसजेनिक चूहों में देखा जाता है हालांकि TCR के नियमन के TCR retrogenic और TCR ट्रांसजेनिक्स 10 के बीच बराबर है। TCR retrogenic सिस्टम एक ही कॉलोनी के भीतर और यहां तक ​​कि एक ही प्रयोग के भीतर कई TCRs की अभिव्यक्ति के लिए अनुमति देता है। TCR retrogenic यहां वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग एक अन्वेषक परीक्षण और विकास और कई नव पहचान MHC वर्ग मैं या द्वितीय प्रतिबंधित TCRs की कार्यक्षमता स्क्रीन करने के लिए अनुमति देता है। "Humanized माउस" मॉडल 18,19 के विकास के साथ, TCR retrogenic आगे क्लोन मानव TCRs के उपयोग का विस्तार किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, 2A जुड़े हुए निर्माणों गएक भी CD3 चेन, interleukins और कैमेरिक प्रतिजन रिसेप्टर्स 20-24 सहित अन्य मल्टी प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा।

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की।

Acknowledgments

यह काम एनआईएच (5K22A1119151-01 और 1R56DK104903-01) एमएलबी, बीसीएम में मधुमेह अनुसंधान केंद्र (P30-DK079638) के पायलट / व्यवहार्यता कार्यक्रम, JDRF 1-एफ ए सी-2014-243-AN APF, एडीए करने से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया 1-15-JF-07, इम्यूनोलॉजी फैलोशिप एमबी करने के लिए, और रॉबर्ट और जेनिस McNair फाउंडेशन में एएआई करियर।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM, high glucose + glutamine Corning Cellgro 10-013-CV Dulbecco's Modification of Eagle's Medium with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate
FBS Atlanta Biological S11550
Trypsin-Versene Lonza 17-161F
0.45 µm syringe filter Thermo Scientific 194-2545
polybrene Sigma H9268-10G Sterile Filtered in dH2O
Ciprofloxacin  VWR AAJ61970-06
5-fluorouracil (5-FU) VWR AAA13456-06
Sodium Pyruvate Corning Cellgro 25-000-CI
MEM nonessential Amino Acids Corning Cellgro 25-025-CI
HEPES 1 M solution Corning Cellgro 25-060-CI
2-Mercaptoethanol Gibco by Life Technologies 21985-023
Pen/Strept Corning Cellgro 30-002-CI
L-glutamine Corning Cellgro 25-005-CI
150 mm tissue culture dishes Greiner Bio-one 639160
Tisue culture-treated 6-well flat plate Greiner Bio-one 657160
70 µm nylon cell strainers Falcon 352350
Mouse IL-3 Invitrogen PMC0033
Human IL-6 Invitrogen  PHC0063
Mouse Stem Cell Factor Invitrogen PMC2113L
10x PBS Corning Cellgro 46-D13-CM
HANKS Buffer Corning Cellgro 21020147
BD 10 ml Syringe BD 300912
BD 1 ml Syringe BD 309659
27 G x 1/2 BD Precision Glide Needle BD 305109
30 G x 1/2 BD Precision Glide Needle BD 305106

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References

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इम्यूनोलॉजी अंक 113 टी सेल रिसेप्टर (TCR) प्रमुख उतक अनुरूपता जटिल (एमएचसी) Retrovirus अस्थि मज्जा पारगमन Retrogenic
अस्थि मज्जा पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं का रेट्रोवायरल transduction टी सेल रिसेप्टर Retrogenic चूहे उत्पन्न करने के लिए
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Lee, T., Shevchenko, I., Sprouse, M. L., Bettini, M., Bettini, M. L. Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice. J. Vis. Exp. (113), e54196, doi:10.3791/54196 (2016).

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