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Immunology and Infection

골수 전구 세포의 레트로 바이러스 형질 도입은 T 세포 수용체 Retrogenic 마우스를 생성하는

Published: July 11, 2016 doi: 10.3791/54196
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Pediatrics, Baylor College of Medicine

Introduction

인간 및 마우스의 T 세포 수용체 (TCR) 레파토리는 1 × 108, 2 × 106 고유 TCR도 각각 1.2로 추정되었다. 이 넓은 다양성은 T 세포는자가 펩티드에서뿐만 아니라 항원 제시 세포 (APC를)의 주 조직 적합성 복합체 (MHC)에 의해 제공 병원체 유래의 항원 에피토프의 광대 한 배열을 인식 할 수있다. 독특한 펩타이드 MHC 단지와 TCR도의 상호 작용의 미묘한 차이는 T 세포가 사멸, 아네 르기, 활성화, 분화, 사이토 카인 생산 세포 독성을 받아야할지 여부를 지시. 그러나, 큰 TCR 레퍼토리 특정 TCR 특정 항원에 응답하는 방법의 분석은 하나의 TCR 시스템의 사용을 필요로한다.

다양한 TCR 유전자 변형 마우스를 생체 내 모델 3-9 단일 TCR의 기능을 연구하기 위해 생성되었다. 그러나, 포함하는 형질 전환 마우스를 TCR 할주의 사항이있다선정 된 하나의 트랜스 제닉 마우스 생식선 DNA (10)에 임의의 형질 전환 유전자 삽입 소위 창시자 효과를 생성하는 시간의 길이. 따라서, 비교적 적은 TCR 형질 전환 마우스는 임의의 주어진 항원에 대해 생성 된 동일한 에피토프에 대한 고 및 저 TCR 친화력의 기능적 의미는 거의 언급하지 않는다. 화면 빠른 접근을위한 필요성을 해결 개별적으로 또는 조합하여 복수의 TCR도 공부 (레트로 바이러스 '레트로'형질 전환에서 '제닉') retrogenic 마우스는 형질 전환 마우스 11-13 TCR의 대안으로 이용되어왔다.

여러 바이러스에서 발견 된 2A 펩타이드 합의 모티브 분열은 2A의 글리신과 2B의 프롤린 사이에 발생하는에서, 2A-ASP를-발 / 일드 - 공급 과잉-X-ASN-프로의 Gly-2B-프로 구성 시스 -acting 가수 분해 효소 활동에서 번역 10,14-16 동안 리보솜 건너 뛰기 결과. 은 C를 나타내는 상세한 다이어그램이러한 방식으로, 하나의 벡터 화학 양론 번역의 결과로 연결될 수 2 시스 트론 (TCR 알파와 TCR 베타) (12) -를 다양한 2A 펩티드 (F2A, E2A, T2A 및 P2A)의 leavage 참고 문헌 10를 참조하십시오. 이 방법을 활용하여, 우리는 표현하고 직접 생체 내에서 여러 항원 특정 TCR도 비교 할 수 있습니다.

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Protocol

윤리 정책 : 모든 노력이 조사와 꼬리 정맥 주사시 최소한으로 동물의 불편이나 스트레스를 유지한다. 마우스는 실험에서 세포의 공급원으로서 사용된다; 같은 어떠한 절차 나 조작은 안락사 따로 없습니다. 마우스는 죽음을 확인하기 위해 자궁 경부 전위 다음 CO 2 흡입에 의해 안락사됩니다. 이 절차는 미국 수의학 협회의 안락사에 대한 패널의 권고와 일치한다.

1. 레트로 바이러스가 구축 준비

  1. 서브 클론 T 세포 수용체 (TCR) 알파 및 베타 사슬하는 MSCV 계 11 레트로 바이러스 벡터 (예 pMIAII 또는 pMIGII) (11)로하는 2A 링커에 의해 분리된다.
    참고 : 2A 링커는 단일 오픈 리딩 프레임의 알파와 베타 TCR 체인의 화학 양론과 조화 된 표현이 가능합니다. 벡터는 사용하는 IRES 형광 단백질 카세트 (ametrine 또는 GFP)을 포함형질 도입 된 세포 및 형질 도입 효율을 추적. 자세한 프로토콜에 대한 홀스트 등을 참조하시기 바랍니다. (11)
  2. 상업적으로 얻은 플라즈마 준비 키트 또는 유사한 제품을 사용하여 플라스미드 DNA를 분리합니다. 하나의 작업 농도 사용 - 2 μg의 μl를 -1.

레트로 바이러스 생산자 세포주의 2 세대

  1. 레트로 바이러스 생산 세포주를 생성하기 위하여 두 단계의 과정을 이용한다.
    참고 :. 자세한 프로토콜은, 홀스트 등 (11)을 참조하시기 바랍니다.
    1. 세 플라스미드 (pVSVG, PEQ-Pam3 (-E) 및이자 (11)의 벡터) 293T 세포의 과도 형질 전환에 의해 레트로 바이러스를 생성하고, GP + E86 ecotropic 레트로 바이러스 생산 세포주를 형질 도입 할 293T 세포에서 레트로 바이러스 상등액을.
    2. FACS에 의해 형광 발현 GP + E86 프로듀서 세포의 상위 40 %를 분리하고 바이러스의 소스로 transdcuced-GP + E86 생산 세포를 전파.
      참고 : 생성고역가의 생산자들은 골수 세포의 효율적인 형질 도입 중요하다. 완전한 프로토콜 홀스트 등을 참조하시기 바랍니다. (11)

3. 레트로 바이러스 매개 줄기 세포 유전자 전송 (일 -5)

  1. 10 % (부피 / 권) FBS이 프로토콜의 일 0으로이 합류 150 mm 플레이트 충분한 성장을 할 수 있도록 밖으로 해동하고 완전한 DMEM의 각 GP + E86 생산 세포주의 배양 0.5 -1.0 × 10 (6).
    참고 : 해동 0.5 - 또한 GP + E86를 확장하기 위해 문화의 오일을 허용이 날 5에서 50 % 컨 플루 - 10cm의 플레이트의 각 GP + E86 생산 세포주의 1.0 × 10 6 30 수 일 0으로이 합류 150 mm 플레이트에 생산​​ 세포주.
    1. 5 % 태아 송아지 혈청 및 마이코 플라스마 오염을 방지 할 시프로플록사신 (10 μg의 / ㎖)을 포함하는 전체 조직 배양 배지에서 배양 레트로 바이러스 생산 세포주.
      참고 : generatin 때 시프로플록사신의 사용을 중지g 골수 전달의 바이러스 상층 액. 이 부정적인 골수 전달 효율에 영향 바와 같이, 생산자 세포주의 과다 성장을 피한다.

5- 플루오로 우라실 (5-FU) (주 -3) 4.를 주입 기증자 마우스

  1. 요구되는 5-FU의 양을 결정하기 위해 - (12 주 이전 5) 도너 마우스 무게. 낮은 골수 수율 나이 결과 오주 미만의 마우스를 사용. 단일 TCR의 발현을 보장하기 위해, 같은 SCID, RAG 또는 TCR 알파 골수 기증자로 결핍 마우스로 T 세포 결핍 마우스의 피로를 사용합니다.
  2. 조직 배양 후드에서 작동하는 10 밀리그램 ml의 충분한 양 -1 체중 g 당 0.15 mg의 5-FU를 전달하는 5-FU의 작업 용액을 만들기 위해 멸균 PBS로 5-FU 스톡을 희석.
  3. 37 G 바늘 1 mL를 주사기를 사용하여, 복강 공여자 마우스 당 체중 g 당 0.15 mg의 5-FU를 주입.
    참고 :받는 사람 당 사용 1 기증자 마우스 시작하고 조정셀 수율에 따라 기증자 마우스의 수. 골수 전구 세포의 농축 및 분리에 대한 5-FU 처리하는 다른 방법은 Viret 등의 알에 기재된 리니지 양성 세포의 네거티브 선택이다.

5. 골수 추출 절차 (일 0)

  1. 뼈 격리를 위해 해부 가위와 집게를 가져옵니다. 50 ML 원뿔 튜브에 뼈를 수집 미디어 (HBSS 5 % FCS (부피 /의 부피와 보충)) 준비합니다. 얼음에 미디어를 포함하는 50 ML 원뿔을 유지합니다. CO에 의해 죽음을 확인하기 위해 자궁 경부 전위 다음 2 흡입 쥐를 안락사. 더 반사가 감지되지 보장하기 위해 발을 꼬집어.
  2. 수술 부위와 에탄올 또는 메탄올과 수술 도구를 소독. 먼저 절단 및 골반 거들에 따라 신중하게 대퇴골, 경골, 상완골, 골반 거들을 제거합니다. 다시 아래 경골의 대퇴골을 따라 잘라. 깨끗한 뼈를 얻기 위해 가위와 집게를 사용하여 모든 주변 조직을 제거합니다. 유지HBSS + 5 % (부피 / 부피의) FBS 수화 뼈.
  3. 모두 각각의 뼈를 종료 잘라 확인하고, 관절에서 절단하여 뼈를 분리합니다. HBSS + 5 % (부피 / 부피)를 포함하는 10 ML의 주사기 FBS에 부착 된 25 게이지 바늘을 삽입합니다. 압력을 적용하고 50 ML 원뿔에서 70 μm의 여과기 휴식을 통해 모든 골수를 세척합니다.
  4. 주기적으로, 1 mL의 3 mL의 주사기의 플런저를 사용하여 70 ㎛의 필터를 통해 골수를 누른다. HBSS + 5 % (부피 / 권) FBS와 스트레이너를 씻어. 이것은 뼈 조각 및 조직이 없도록 단일 세포 현탁액을 보장한다. 멸균 후드의 절차를 수행하여 무균 세포를 유지합니다.
  5. 4 ℃에서 10 분 동안 300 XG에 원심 분리기 골수 세포.

6. 골수 문화 (0 일)

  1. 캔트 또는 흡인 미디어 50 ML 원뿔 튜브 당 1 ml의 염화 암모늄을 기반으로 적혈구 용해 버퍼 (또는 RBC 용해 버퍼 상당)에 재현 탁 세포 펠렛. 룸에서 1 분 배양 후온도는 완전 DMEM 20 % (부피 / 부피) 10 ml의 FBS를 첨가하여 적혈구 용해 완충액을 해소.
  2. 4 ℃에서 10 분 동안 300 XG에 원심 분리기 세포.
  3. 가만히 따르다 5 ml의 완전한 DMEM 20 % (부피 / 부피) FBS의 대기음 뜨는 및 재현 탁 골수. 노이 바 우어 계산 챔버와 세포를 계산합니다.
    참고 : 일반 수율이 있어야합니다 약 5 - 마우스 당 × 10 6 셀 (10); 그러나, 수율은 쥐의 다른 변종에 따라 다를 수 있습니다.
  4. IL-3이 보충 된 완전 DMEM 20 % (부피 / 부피) FBS 30 mL를 150-mm 플레이트 당 4 × 107 세포의 밀도로 접시의 골수 세포 (20g 용액 1), IL-6 (50 g ml의 1) 및 SCF (50g ml의 1).
    참고 : 갓 해동-분주 사이토 카인을 사용합니다. 2 주 이상 4 ° C에서 냉동 번 이상 해동 또는 보관 된 사이토 카인을 사용하지 마십시오.
  5. 5 % CO 2, 37 ℃에서 밤새 골수 (약 24 시간)을 인큐베이션.

  1. 플레이트 18 ml의 완전한 DMEM 20 % (부피 / 권) FBS에서 150 mm 플레이트 당 3 × 10 6 레트로 바이러스 생산 세포.
  2. 하룻밤 37 ° C에서 레트로 바이러스 생산 세포를 품어. (- 3 기증자 마우스 약 2) 15000000 골수 세포에 대해 하나의 150-mm 판을 기대하고 있습니다.

8. 레트로 바이러스 상층 액 (1 일)

  1. 다음날 (약 24 시간 이상), 10 ml의 주사기와 필터는 0.45를 이용하여 150 mm 플레이트에서 직접 레트로 바이러스 상등액을 그림으로써 (7 단계에서 설정) 생산자 판에서 레트로 바이러스 뜨는을 수확 -μm 주사기 필터.
  2. 조심스럽게 신선한 완전한 DMEM 20 % (부피 / 부피) FBS 18 ㎖로 제거 된 레트로 바이러스 뜨는을 교체합니다.
  3. (g ml의 -1 20) IL-6 (50g ml의 1), MSCF (50g ml의 1) 및 Hexadimethrine 브로마이드 (폴리 브렌) (6을 IL-3 필터링 된 레트로 바이러스 상층 액을 보충# 956; g ml의 1).
    주 : Hexadimethrine 브로마이드 레트로 바이러스 형질 도입의 효율의 저하를 방지하기 위해 2 개월마다 신선한하여야한다.

9. 골수 수확 (1 일)

  1. 단계 8.3를 완료 한 후, 단계 6.4로부터의 골수 세포를 수확하고 멸균 된 50 ㎖의 튜브에 비 부착 세포를 포함하는 미디어 전송.
  2. 10 ml의 PBS에 적극적으로 접시를 씻으 단계 9.1에서 50 ML 원뿔에서 수집합니다. 필요한 경우, 세척 공정을 반복한다.
  3. 원심 분리기는 4 ° C에서 10 분 동안 300 XG에 세포가 뜨는을 가만히 따르다, 작은 볼륨에 resuspend 세포 (1-3 ml)을 완료 DMEM 20 % (부피 / 부피) FBS, 그리고 계산합니다. 사이토 카인 및 Hexadimethrine 브로마이드를 함유하는 레트로 바이러스 상층 액 1 ㎖ 당 1 × 106 세포로 재현 탁 0 일 골수 75 % 복구 - 50 예상된다.

10. 골수 형질 도입 (1 일)

  1. 레트로 바이러스 상등액 / 뼈 엄마 플레이트여섯 웰 조직 배양 플레이트에 웰 당 3 ㎖의 부피에서 rrow 혼합물. 단계 10.2에서 원심 분리 동안 가스 교환을 최소화하기 위해 플라스틱 포장의 판을 바꿈.
  2. 60 분 37 ° C 1,000 XG에서 랩 여섯 웰 플레이트 스핀.
  3. 스핀가 완료되면 플라스틱 포장을 제거하고 24 시간 동안 37 ° C CO 2 배양기에서 접시를 놓습니다.

(11) 레트로 바이러스 뜨는 및 형질 도입 (2 일)

  1. 24 시간 후, 바이러스 생산 세포주에서 신선한 바이러스 상층 액을 수집합니다. 10 mL의 주사기와 0.45 μm의 주사기 필터를 사용하여 레트로 바이러스 상등액을 필터. IL-3 필터링 된 레트로 바이러스 상층 액 (용액 20g-1), IL-6 (50g 용액 -1) 및 SCF 보충 (50g 용액 -1) 및 Hexadimethrine 브로마이드 (6g 용액 1).
  2. 다음, 조심스럽게 피펫으로 제거하거나 골수 세포를 포함하는 6 웰 플레이트의 각 웰로부터 매체의 상단이 용액을 흡인.
    주 : 작업은 신중 보통 웰의 중앙에 집중되어 골수를 대기음 없다. 이와 달리, 제거 된 상등액을 어떤 손실 골수 세포를 회수하기 위해 스핀 다운된다.
  3. 잘 골수 6 웰 플레이트의 각에 신선한 바이러스 상층 액을 포함하는 사이토 카인 및 Hexadimethrine 브로마이드 3 ㎖를 추가합니다. 플라스틱 접시를 감싸, 60 분, 37 ° C를 1,000 XG에서 스핀 전달을 반복합니다. 접시를 풀다, 37 ° C, 5 % CO 2 밤새 (약 24 시간)에서 세포를 배양한다.

신선한 보충 DMEM의 12 추가 (3 일)

  1. 24 시간 후, 단계 11.2에서와 골수 세포를 포함하는 6 웰 플레이트의 각 웰로부터 매체의 상단이 용액을 제거한다. (g ml의 -1 50) IL-3의 최종 농도로 보충 신선한 DMEM 20 % (부피 / 부피) FBS와 (20g ml의 -1) 제거 된 미디어를 교체, IL-6 (50 g ml의 1) 및 SCF .
  2. 골수를 품어또 다른 24 시간 동안 37 ° C CO 2 배양기에서 접시.

13. 수확 형질 골수 (4 일)

  1. 24 시간 후에, 6- 웰 플레이트에서 골수 세포를 수집한다. 모든 비 부착 세포를 제거하기 위해 PBS에 격렬 판을 씻는다.
    1. 4 ° C에서 10 분 동안 300 XG에 세포를 원심 분리기와 뜨는을 가만히 따르다.
    2. PBS + 0.5 % (부피 / 부피)의 소량 (1 mL) 중 골수 열 - 불 활성화 FBS를 재현 탁. 얼음에 세포를 유지합니다.
  2. 각 골수 조건의 10 μL 샘플을 채취하고 노이 바 우어 계산 챔버를 사용하여 세포를 계산합니다. 1 가정 -받는 사람 당 2 기증자, 수율은받는 사람 마우스 당 최소 4 × 10 6 세포를 전송하기에 충분합니다. 마우스 당 300 μL - 200에 주입하는 PBS + 0.5 % (vol / vol) 열 활성화 된 FBS 충분한 양의 골수 재현 탁.
    1. 전달 효율을 갖는 적어도 2 × 106 세포를 주입25 %의 정맥 마우스 당 (8 X10 6 셀을 삽입 할 수 있습니다).
      참고 : 우리는 일상적으로 골수 세포의 두 6 웰 플레이트에 5받는 사람 쥐를 주입. 수율이 실질적으로 낮은 경우 충분한 골수 수가 얻어 질 때까지 더 공여 마우스는 사용되어야한다. 최적의 재구성을 달성하기 위해, 적어도 5 × 5는 형질 도입 (양의 형광체)를 각 수신자에 주입한다.
  3. 마이크로 피펫으로, 각각의 골수 조건의 10 μl의 샘플을 채취하여 형광 마커 (그림 1A) (11)의 발현에 따라 유동 세포 계측법에 의해 전달 효율을 분석 할 수 있습니다.
    주 : 일반적으로, 형광 양성 세포의 비율은 구조 및 레트로 바이러스 역가에 따라 25 %에서 70 % 사이이다. 필요한 형질 도입 골수 세포의 수는 서브 - 치명적 조사하는 마우스 전달 효율에 따라 달라질 수 재구성. 트란 낮은sduction 효율이보다 골수 세포를 요구하고, 반대로 골수 전달 효율이 높아 세포의 낮은 숫자는 재구성에 필요한. 25 % 아래의 전달 효율이 최적이며, 부족 재구성과 생존의 원인이 될 수 있습니다. 최적 골수 회복 전달 효율을 확보하기 위해, 새로 제조 된 조직 배양 배지 및 사이토 카인을 사용한다. retrogenic 체계를 이용하여 새로운 TCR을 발현 할 때, 생체 내에서 그 TCR의 선택은 알려져 있지 않다. 개별 TCR의 친화도에 따라 흉선 및 말초 T 세포 발현 TCR 선택 17 달라진다.

14. 마우스 조사, 골수 주입 및 관리

  1. 쥐에게 골수 주입 전날 (13 단계로 당일)을 조사. 다음 용량 사용 C57BL / 6 마우스 (및 기타 야생형 균주), 900 래드, Rag1을 - / - 마우스, 500 래드; SCID 마우스, 300 래드).
    1. 아목시실린에 배치받는 사람 마우스 (50 ㎎ / ㎏ / 일) 또는 조사 전에 다른 항생제 물 처리, 골수 주입 후 첫 2 주 동안 항생제를 계속.
      주 : 최적의 조사량은 경험적으로 결정될 수있다.
  2. 주사를 들어, 바로 주입하기 전에, 다음, 주사 27 게이지에 바늘을 변경 공기 색전증을 방지하기 위해 모든 공기를 추방 무딘 바늘을 사용하여 1 ML의 주사기에 단계 13.1에서 세포를로드합니다. 가열 램프 아래에서 열 및 마우스 당 정맥 마우스 골수 0.2 ml를 주입.
    참고 : 세포가 시간의 길이 또는 정착 할 셀의 주사기에 앉아 않도록하십시오.
  3. 그들이 건강을 유지하도록 주간 생쥐를 모니터링합니다.
  4. 오 후 - 육주, GFP + / ametrine + 및 TCR 공동 식 (그림 1B) (11)에 기초하여 재구성을 확인하기 위해 쥐를 피.

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Representative Results

골수 대표 골수 전달도 (도 1a)에있어서 꼬리 정맥에서 정맥 내로 주입되기 전에 골수 전달 효율은 수확 된 골수의 약 10 μL 중 100 ㎕를 첨가하고, 프로토콜의 단계 133에서 판정한다 PBS 및 ametrine 발현을 분석 하였다. 일반적으로 형광 양성 세포의 비율은 구조 및 레트로 바이러스 역가에 따라 25 %에서 70 % 사이이다. 6주 골수 주사 후, 마우스 골수 재구성 (도 1b)를 결정하기 위해 혈액을 채취한다. 약 말초 혈액의 25 μL은 적혈구가 용해 및 안티 TCRβ로 염색했다. 도 2b에 모든 TCR 양성 세포 concordantly ametrine 형광 단백질을 발현.

그림 1
Figu골수 형질 도입 및 주변 Retrogenic TCR T 세포의 1 예 재. 골수 세포의 A) 형질 도입 효율 골수 전송 당일 형광 마커 (ametrine)에 기초하여 분석된다. 채취 된 골수 약 10 μL의 PBS를 100 ㎕를 첨가하고 ametrine 발현에 대해 분석 하였다. 성공적인 골수 전달 25 % 및 70 %. B) 6- 주 골수 재구성 게시 말초 혈액 retrogenic TCR T 세포의 실시 예 사이의 형광 양성 세포의 백분율을 수득한다. 말초 혈액을 수득하고, 적혈구는 적혈구 용해 완충액으로 용해시켰다. 나머지 세포는 TCRβ에 대한 염색 하였다. ametrine 식 6 주 골수 재구성을 게시 염색 안티 TCRβ에 대한 대표적인 분석. t의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오그의 그림.

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Discussion

프로토콜에서, 최적의 골수 건강, 전달 효율 및 재구성을 보장하기 위해 여러 세부 중요한 단계를 우리. 첫 번째 중요한 단계는 생성 및 GP + E86 바이러스 생산자 세포의 적절한 유지된다. 초기 통로 생산 세포주를 사용하여 80 % 컨 플루 이하 사용하기 전에에서 유지한다. 48 시간 - 신선한 GP + E86 바이러스 생산 세포를 만드는 경우, 293T 세포가 초기 통로 (24)에 대한 문화에서 성장되어 있는지 확인합니다. 형질 도입 단계에서 너무 많은 GP + E86 셀을 도금하는 바이러스 역가를 낮출 것이다. GP + E86 강력한 바이러스 생산자 보장하기 위해 홀스트 등. (11)에 기술 된 바와 같이 바이러스 역가를 결정합니다. 또한, 수확 된 골수에서 적혈구의 제거는 형질 도입 효율을 향상시킨다. 골수 전구 세포의 상태를 보장하는 프로토콜의 성공에 매우 중요하다. 이를 위해, 항상 신선한 미디어 (후 FCS로 보충 4 ° C에서 4 주 이하) 및 신선한 사이토 카인 (이하 사용이주보다) 4 ° C로 유지하는 경우. 이 솔루션되면 Hexadimethrine 브로마이드, 2 개월마다 또한 저하에 민감하고 신선한해야한다. 최적의 골수 건강과 전달을 보장 기타​​ 세부 사항은 스핀 전달하기 전에 원심 분리기를 미리 예열 등이 있습니다. 37 ° C에서 스핀 형질 도입과 가능한 한 많은 가스 교환을 줄이기 위해 플라스틱 포장으로 접시를 포장. 또한, 골수는 37 ° C 배양기의 외부 또는 세포 사멸을 증가시키고 골수 전달 및 재구성을 감소이 같은 장시간 얼음에 앉아 할 수 없습니다. 골수 세포는 4 일 (13 단계)에서 수확 한 후에 만​​ 즉시 마우스를 주입하기 전에 주사기를로드합니다. 마지막으로, 마우스는 조사 당일 또는 그 이전에 항생제에 하루를 배치되어 있는지 확인합니다.

이러한 레트로 바이러스 매개 된 전달 프로토콜의 이용은 발생 골수 전구 세포의 형질 도입을 허용T 세포 수용체 retrogenic 마우스의 생성. Retrogenic 마우스는 TCR 유전자 변형 마우스와 하나의 TCR의 형질 전환을 발생보다 훨씬 적은 비용으로보다 생성 할 빠릅니다. 그러나 retrogenic 마우스는 사육 할 수 없으며 반드시 각 실험 (10)과 새롭게 생성합니다. 말초 T 세포의 숫자는하지만 TCR의 조절은 TCR retrogenic 및 TCR 형질 10 내지 필적 TCR 형질 전환 마우스에서 보이는 것보다 retrogenic 마우스 낮다. TCR에 retrogenic 시스템은 같은 식민지 내에서, 심지어 같은 실험에서 여러 TCR도의 표현이 가능합니다. 여기에 설명 된 TCR retrogenic 프로토콜을 활용하여 테스트하고 수많은 새로 확인 된 MHC 클래스 I 또는 II 제한 TCR도의 개발과 기능을 선별하는 연구자 수 있습니다. 은 "인간화 마우스"모델 (18, 19)의 개발에 의해, TCR의 retrogenic 더 클로닝 인간 TCR도를 이용하여 확장 될 수있다. 또한,도 2a는 구조체의 C 연결된도 CD3 쇄, 인터루킨 및 키메라 항원 수용체 (20-24)를 포함하는 다른 다중 단백질을 연구하기 위해 이용 될 수있다.

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Disclosures

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Acknowledgments

이 작품은 MLB, BCM에서 당뇨병 연구 센터 (P30-DK079638)의 파일럿 / 타당성 프로그램, JDRF 1-FAC-2014-243-APF, ADA에 NIH (5K22A1119151-01 및 1R56DK104903-01)에서 보조금에 의해 지원되었다 1-15-JF-07, 면역학 MB에 친목, 그리고 로버트와 제니스 맥 네어 재단 AAI 채용.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM, high glucose + glutamine Corning Cellgro 10-013-CV Dulbecco's Modification of Eagle's Medium with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate
FBS Atlanta Biological S11550
Trypsin-Versene Lonza 17-161F
0.45 µm syringe filter Thermo Scientific 194-2545
polybrene Sigma H9268-10G Sterile Filtered in dH2O
Ciprofloxacin  VWR AAJ61970-06
5-fluorouracil (5-FU) VWR AAA13456-06
Sodium Pyruvate Corning Cellgro 25-000-CI
MEM nonessential Amino Acids Corning Cellgro 25-025-CI
HEPES 1 M solution Corning Cellgro 25-060-CI
2-Mercaptoethanol Gibco by Life Technologies 21985-023
Pen/Strept Corning Cellgro 30-002-CI
L-glutamine Corning Cellgro 25-005-CI
150 mm tissue culture dishes Greiner Bio-one 639160
Tisue culture-treated 6-well flat plate Greiner Bio-one 657160
70 µm nylon cell strainers Falcon 352350
Mouse IL-3 Invitrogen PMC0033
Human IL-6 Invitrogen  PHC0063
Mouse Stem Cell Factor Invitrogen PMC2113L
10x PBS Corning Cellgro 46-D13-CM
HANKS Buffer Corning Cellgro 21020147
BD 10 ml Syringe BD 300912
BD 1 ml Syringe BD 309659
27 G x 1/2 BD Precision Glide Needle BD 305109
30 G x 1/2 BD Precision Glide Needle BD 305106

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References

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면역학 판 (113) T 세포 수용체 (TCR) 주요 조직 적합성 복합체 (MHC) 레트로 바이러스 골수 형질 도입 Retrogenic
골수 전구 세포의 레트로 바이러스 형질 도입은 T 세포 수용체 Retrogenic 마우스를 생성하는
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Lee, T., Shevchenko, I., Sprouse, M. L., Bettini, M., Bettini, M. L. Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice. J. Vis. Exp. (113), e54196, doi:10.3791/54196 (2016).

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