Introduction
T-cellereceptor (TCR) repertoire af mennesker og mus er blevet anslået til 1 x 10 8 og 2 x 10 6 unikke TCR'er henholdsvis 1,2. Denne store mangfoldighed giver T-celler til at genkende en bred vifte af antigen epitoper afledt selv-peptider samt fra patogener fremlagt af større histokompatibilitetskompleks (MHC) på antigen-præsenterende celler (APC'er). De små forskelle i samspillet af TCR'er med unikke peptid-MHC-komplekser dikterer, om en T-celle vil undergå apoptose, anergi, aktivering, differentiering, cytokinproduktion eller cytotoksicitet. Men på grund af det store TCR repertoire, analyse af, hvordan en specifik TCR vil reagere på et bestemt antigen kræver brug af enkelte TCR systemer,.
Forskellige TCR transgene mus er blevet dannet for at undersøge funktionen af et enkelt TCR i en in vivo-model 3-9. Der er imidlertid forbehold at TCR-transgene mus, herunderomkostninger, hvor lang tid til at frembringe en enkelt transgen mus og den såkaldte grundlæggervirkning af tilfældig transgen insertion i germlinie DNA 10. Derfor har relativt få TCR transgene mus blevet genereret til et givet antigen og de funktionelle konsekvenser af høj og lav TCR affinitet for den samme epitop behandles sjældent. For at imødekomme behovet for en hurtig tilgang til skærmen og studere flere TCR'er enkeltvis eller i kombination, har retrogenic ( "retro" fra retrovirus og "fremkaldende" fra transgene) mus blevet udnyttet som et alternativ til TCR transgene mus 11-13.
2A peptid konsensus motiv fundet inden for flere vira består af en 2A-Asp-Val / Ile-Glut-X-Asn-Pro-Gly-2B-Pro, hvori spaltning forekommer mellem glycin i 2A og prolin i 2B fra cis-virkende hydrolase aktivitet, hvilket resulterer i ribosomale skipping under oversættelse 10,14-16. For et detaljeret diagram, der afbilder cleavage af de forskellige 2A peptider (F2A, E2A, T2A og P2A) Der henvises til referencerne 10 - 12. På denne måde, 2 cistroner (TCR alfa- og TCR beta) kan forbindes resulterer i støkiometrisk translation i en enkelt vektor. Ved hjælp denne tilgang, er vi i stand til at udtrykke og direkte sammenligne flere antigen-specifikke TCR in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik Statement: Der gøres alt for at holde dyr ubehag eller stress på et minimum under bestråling og hale vene injektioner. Mus anvendes som en kilde af celler i disse forsøg; som sådan er der ingen procedurer eller manipulationer bortset fra eutanasi. Mus vil blive aflivet ved CO2 inhalation efterfulgt af cervikal dislokation at bekræfte døden. Denne procedure er i overensstemmelse med anbefalingerne fra Panel om Eutanasi af American Veterinary Medical Association.
1. Forbered retroviral Construct
- Sub-klon T-celle receptor (TCR) alfa- og beta-kæder, adskilt af en 2A linker, til en MSCV-baseret retroviral 11 vektor (f.eks pMIAII eller pMIGII) 11.
BEMÆRK: 2A-linker muliggør støkiometrisk og overensstemmende ekspression af alfa og beta TCR-kæder fra en enkelt åben læseramme. Vektoren omfatter et IRES fluorescerende protein kassette (ametrine eller GFP), der bruges tilspore transducerede celler og transduktionseffektivitet. For en detaljeret protokol se Holst et al. 11 - Isoler plasmid DNA under anvendelse af kommercielt opnået plasma prep kit eller et lignende produkt. Brug en arbejdskoncentration på 1 - 2 ug pi -1.
2. Frembringelse af retrovirale Producer cellelinjer
- Anvende en to-trins proces til at producere de retrovirale producent-cellelinjer.
BEMÆRK: For en detaljeret protokol, se venligst Holst et al 11..- Generer retrovirus ved forbigående transfektion af 293T-celler med tre plasmider (pVSVG, PEQ-Pam3 (-E) og vektor af interesse 11) og tage den retroviral supernatant fra 293T-celler til at transducere GP + E86 ecotrope retroviral producer cellelinie.
- Isoler top 40% af fluorescerende udtrykker GP + E86 producentceller ved FACS og udbrede transdcuced-GP + E86 producentceller som en kilde til virus.
BEMÆRK: generationaf høj titer producenter er kritisk for effektiv transduktion af knoglemarvsceller. For en komplet protokol du se Holst et al. 11
3. Retrovirus-medieret Stem Cell Gene Transfer (dag -5)
- Optø ud og kultur 0,5 -1,0 x 10 6 af hver GP + E86 producent cellelinje i komplet DMEM 10% (vol / vol) FBS at give tilstrækkelig vækst til to sammenflydende 150 mm plader ved Dag 0 af denne protokol.
BEMÆRK: Optøning 0,5 - 1,0 x 10 6 af hver GP + E86 producer cellelinie i en 10 cm plade vil tillade i 30 - 50% konfluens på dag 5. Dette giver også mulighed for 5 dages dyrkning for at udvide GP + E86 producentpriserne cellelinjer til to sammenflydende 150-mm plader ved dag 0.- Kultur retroviral producer cellelinie i komplet vævskulturmedium indeholdende 5% feta kalveserum og ciprofloxacin (10 ug / ml) for at undgå forurening med mycoplasma.
BEMÆRK: Afbryd anvendelsen af ciprofloxacin, når generating den virale supernatant for knoglemarv transduktion. Undgå overdreven vækst af producentens cellelinie, da dette negativt påvirker knoglemarven transduktionseffektivitet.
- Kultur retroviral producer cellelinie i komplet vævskulturmedium indeholdende 5% feta kalveserum og ciprofloxacin (10 ug / ml) for at undgå forurening med mycoplasma.
4. indsprøjtes donormus med 5-fluorouracil (5-FU) (dag -3)
- Afvej donor mus (5 - 12 uger gamle) at bestemme mængden af 5-FU påkrævet. Anvendelse af mus yngre end 5 uger gamle resulterer i lav knoglemarv udbytte. For at sikre udtryk for en enkelt TCR, bruge en T-celle mangelfuld musestamme såsom SCID, RAG eller TCR alfa defekte mus som knoglemarvsdonorer.
- Arbejde i vævskultur hætte, fortyndes 5-FU lager med sterilt PBS for at gøre en tilstrækkelig mængde af 10 mg ml-1 arbejder opløsning af 5-FU til at levere 0,15 mg 5-FU per gram legemsvægt.
- Anvendelse af en 1 ml sprøjte med en 37 G nål, intraperitoneal injicere 0,15 mg 5-FU per gram kropsvægt pr donor mus.
BEMÆRK: Brug en donor mus per én modtager til at starte og justereantallet af donormus ifølge cellen udbytte. En alternativ fremgangsmåde til 5-FU behandling til berigelse og isolering af knoglemarv stamceller er negativ selektion af afstamningsceller positive celler som beskrevet i Viret et al.
5. Bone Marrow Extraction Procedure (dag 0)
- Opnå dissektion saks og pincet til knogle isolation. Forbered medier (HBSS suppleret med 5% FCS (vol / vol)) til at indsamle knogler i et 50 ml konisk rør. Hold 50 ml konisk holdige medier på is. Aflive mus ved CO 2 inhalation efterfulgt af cervikal dislokation at bekræfte døden. Knib pote at sikre der ikke registreres nogen reflekser.
- Sterilisere kirurgiske sted og kirurgiske værktøjer med ethanol eller methanol. Fjern lårben, skinneben, humerus, og bækkenringen grundigt ved først at skære op og under bækkenringen. Skær tilbage ned langs lårbenet til skinnebenet. Fjern alle omgivende væv med en saks og pincet til at opnå rene knogler. Holdeknogler hydratiseret i HBSS + 5% (vol / vol) FBS.
- Adskil knoglerne ved at skære i leddene, og sørg for at skære begge ender ud hver ben. Sæt en 25-gauge nål fastgjort til en 10 ml sprøjte indeholdende HBSS + 5% (vol / vol) FBS. Påfør tryk og skyl alle knoglemarv gennem en 70-um si hvile i en 50 ml konisk.
- Med jævne skubbe knoglemarven gennem 70-um filter ved hjælp af stemplet fra en 1 ml eller 3 ml sprøjte. Skyl filteret med HBSS + 5% (vol / vol) FBS. Dette vil sikre en enkelt cellesuspension, der er fri af knoglefragmenter og væv. Hold celler steril ved at udføre proceduren i en steril hætte.
- Centrifugér knoglemarvsceller ved 300 xg i 10 minutter ved 4 ° C.
6. Bone Marrow Kultur (dag 0)
- Omhældes eller aspiratprøver medier og resuspender cellepelleten i 1 ml ammoniumchlorid baseret røde blod lysepuffer (eller RBC lysebuffer ækvivalent) pr 50 ml konisk rør. Efter 1 min inkubation ved rumtemperatur, stands røde blodlegemer lysepuffer ved tilsætning af 10 ml komplet DMEM 20% (vol / vol) FBS.
- Centrifuger cellerne ved 300 xg i 10 minutter ved 4 ° C.
- Dekanteres eller aspireres supernatanten og resuspender knoglemarv i 5 ml komplet DMEM 20% (vol / vol) FBS. Tæl cellerne med et Neubauer tællekammer.
BEMÆRK: Generel udbytte bør være ca. 5 - 10 x 10 6 celler per mus; dog kan udbyttet variere blandt forskellige stammer af mus. - Plade knoglemarvsceller ved en densitet på 4 x 10 7 celler pr 150-mm plade i 30 ml komplet DMEM 20% (vol / vol) FBS suppleret med IL-3 (20 g ml-1), IL-6 (50 g ml-1) og SCF (50 g ml-1).
BEMÆRK: Brug frisk optøet-alikvoteret cytokiner. Brug ikke cytokiner der har været frosset og optøet mere end én gang eller holdes ved 4 ° C i mere end 2 uger. - Inkuber knoglemarv natten over (ca. 24 timer) ved 37 ° C med 5% CO2.
- Plade 3 x 10 6 retrovirale producentceller pr 150-mm plade i 18 ml komplet DMEM 20% (vol / vol) FBS.
- Inkuber retrovirale producentceller ved 37 ° C natten over. Forudse én plade 150-mm til 15 millioner knoglemarvsceller (ca. 2 - 3 donor mus).
8. Retroviral Supernatant (dag 1)
- Den næste dag (ca. 24 timer senere), høste retroviral supernatant fra de producerende plader (oprettet i trin 7) ved udarbejdelsen af retroviral supernatant direkte ud af 150-mm plade med 10 ml sprøjte og filter ved hjælp af en 0,45 -μm sprøjtefilter.
- Sæt forsigtigt den fjernede retroviral supernatant med 18 ml frisk komplet DMEM 20% (vol / vol) FBS.
- Supplere den filtrerede retroviral supernatant med IL-3 (20 g ml-1), IL-6 (50 g ml-1), MSCF (50 g ml-1) og hexadimethrinbromid (Polybrene) (6 &# 956; g ml-1).
BEMÆRK: hexadimethrinbromid bør gøres frisk hver 2. måned for at undgå et fald i effektiviteten af retroviral transduktion.
9. Bone Marrow Harvest (dag 1)
- Efter at have afsluttet trin 8.3, høste knoglemarvsceller fra trin 6.4 og overføre medier, der indeholder ikke-klæbende celler i sterile 50 ml rør.
- Pladerne skylles kraftigt med 10 ml PBS og opsamles i 50 ml konisk fra trin 9.1. Gentag om nødvendigt vasketrinnet.
- Centrifuger cellerne ved 300 xg i 10 min ved 4 ° C, dekanteres supernatanten, resuspender cellerne i et lille volumen (1 - 3 ml) komplet DMEM 20% (vol / vol) FBS, og tælle. Foregribe 50 - 75% genvinding fra dag 0. Resuspender knoglemarv ved 1 x 10 6 celler pr 1 ml af den retrovirale supernatant indeholdende cytokiner og hexadimethrinbromid.
10. Bone Marrow transduktion (dag 1)
- Plate den retroviral supernatant / knogle maRROW blanding ved et volumen på 3 ml per brønd i en seks-brønds vævskulturplade. Pak pladerne i plastikfolie at minimere udvekslingen gas under centrifugeringen i trin 10.2.
- Spin de indpakkede seks-brønds plader ved 1.000 xg i 60 minutter et 37 ° C.
- Efter spin er afsluttet, fjernes den plastfolie og læg pladerne i en 37 ° C CO 2 inkubator i 24 timer.
11. Retroviral Supernatant og transduktion (dag 2)
- Efter 24 timer, indsamle frisk viral supernatant fra den virale producer cellelinie. Filtrer den retrovirale supernatant anvendelse af en 10 ml sprøjte og en 0,45 um sprøjtefilter. Supplere den filtrerede retroviral supernatant med IL-3 (20 g ml-1), IL-6 (50 g ml-1) og SCF (50 g ml-1) og hexadimethrinbromid (6 g ml-1).
- Dernæst forsigtigt fjerne med pipette eller aspirere de øverste 2 ml medier fra hver brønd af de seks brønde indeholdende knoglemarvsceller.
BEMÆRK: Arbejde omhyggeligt ikke at aspirere knoglemarven, som normalt koncentreret i midten af brønden. Alternativt kan det fjernede supernatant spindes ned for at gendanne mistede knoglemarvsceller. - Til hver brønd i pladen knoglemarven 6 brønde tilsættes 3 ml friske virale supernatant indeholdende cytokiner og hexadimethrinbromid. Wrap pladerne i plast, og gentag spin transduktion ved 1.000 xg i 60 minutter et 37 ° C. Pak pladerne, og der inkuberes celler ved 37 ° C og 5% CO2 natten over (ca. 24 timer).
12. Tilsætning af Fresh Suppleret DMEM (Dag 3)
- Efter 24 timer fjernes de øverste 2 ml medier fra hver brønd i seks-brønds plade indeholdende knoglemarvsceller, som i trin 11.2. Erstatte den fjernede medie med frisk DMEM 20% (vol / vol) FBS suppleret med slutkoncentrationer af IL-3 (20 g ml-1), IL-6 (50 g ml-1) og SCF (50 g ml-1) .
- Inkuber knoglemarvplader ved 37 ° C CO2-inkubator i yderligere 24 timer.
13. Harvest transducerede Bone Marrow (Dag 4)
- Efter 24 timer opsamles det knoglemarvsceller fra de seks-brønds plader. Pladerne skylles grundigt med PBS for at fjerne alle ikke-adhærente celler.
- Centrifugeres cellerne ved 300 x g i 10 minutter ved 4 ° C og dekanter supernatanten.
- Resuspender knoglemarven i et lille volumen (1 ml) i PBS + 0,5% (vol / vol) varmeinaktiveret FBS. Hold celler på is.
- Tag 10 pi prøve af hver knoglemarven tilstand og tælle cellerne under anvendelse af et Neubauer-tællekammer. Antages 1 - 2 ud donor pr modtager, bliver udbyttet være tilstrækkelig til at overføre mindst 4 x 10 6 celler pr recipient mus. Resuspender knoglemarven i et tilstrækkeligt volumen af PBS + 0,5% (vol / vol) varmeinaktiveret FBS at injicere 200 - 300 pi per mus.
- Injicere mindst 2 x 10 6 celler med en transduktionseffektivitet25% (kan injicere op til 8 x10 6 celler) pr mus intravenøst.
BEMÆRK: Vi injicere rutinemæssigt fem recipientmus pr to plader med 6 brønde af knoglemarvsceller. Hvis udbyttet er væsentligt lavere, bør flere donor mus benyttes, indtil der kan opnås tilstrækkelig knoglemarv nummer. For at opnå optimal rekonstituering mindst 5 x 10 5 transduceret (fluorescerende positiv) skal injiceres ind hver modtager.
- Injicere mindst 2 x 10 6 celler med en transduktionseffektivitet25% (kan injicere op til 8 x10 6 celler) pr mus intravenøst.
- Med en mikro pipette, tage 10 pi prøve af hver knoglemarven tilstand og analysere transduktionseffektivitet ved flowcytometri baseret på ekspression af fluorescerende markør (figur 1A) 11.
BEMÆRK: I almindelighed er andelen af fluorescerende positive celler er mellem 25% og 70%, afhængig af konstruktionen og retroviral titer. Antallet af transducerede knoglemarvsceller nødvendigt at rekonstruere en sub-letalt bestråle mus kan variere efter transduktionseffektiviteten. Jo lavere transduction effektivitet, de mere knoglemarvsceller påkrævet, og omvendt, jo højere knoglemarven transduktionseffektiviteten, det lavere antal celler, der kræves til rekonstitution. Transduktionseffektivitet under 25% er suboptimal og kan resultere i utilstrækkelig rekonstitution og overlevelse. For at sikre optimal knoglemarv nyttiggørelse og transduktion effektivitet, benyttes frisk fremstillede vævskultur medier og cytokiner. Når ekspression af et nyt TCR udnytte retrogenic systemet, udvælgelse af denne TCR in vivo er ukendt. Afhængigt af hver enkelt TCR affinitet, vil TCR udvælgelse i thymus og perifert T-celle udtryk variere 17.
14. Mouse Bestråling, Bone Marrow Injection og pleje
- Bestråle mus dagen før knoglemarven injektion (Samme dag som trin 13). Brug følgende doser: C57BL / 6 mus (og andre vildtype stammer), 900 rad; RAG1 - / - mus, 500 rad; SCID-mus, 300 rad).
- Placer modtagende mus på Amoxicillin (50 mg / kg / dag), eller et andet antibiotikum vandbehandling før bestråling, og holder på antibiotika i de første to uger efter knoglemarvstransplantation injektion.
BEMÆRK: Optimal strålingsdosis muligvis bestemmes empirisk.
- Placer modtagende mus på Amoxicillin (50 mg / kg / dag), eller et andet antibiotikum vandbehandling før bestråling, og holder på antibiotika i de første to uger efter knoglemarvstransplantation injektion.
- For injektion, indlæse cellerne fra trin 13.1 i en 1-ml sprøjte ved hjælp af stumpe kanyler umiddelbart før injektion, derefter ændre nålen til 27-gauge til injektion, udvise nogen luft for at undgå luftemboli. Heat mus under en varmelampe og injicere 0,2 ml knoglemarv per mus intravenøst.
BEMÆRK: Lad ikke cellerne sidde i sprøjten i længere tid, eller cellerne vil slå sig ned. - Overvåg mus ugentligt for at sikre, at de forbliver sunde.
- Efter 5 - 6 uger, bløder musene at kontrollere for rekonstitution på grundlag af GFP + / ametrine + og TCR co-ekspression (figur 1B) 11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Knoglemarv transduktion effektivitet kontrolleres ved trin 13.3 i protokollen før knoglemarven sprøjtes ind hale vene iv I repræsentative knoglemarven transduktion figur (figur 1A), ca. 10 pi af den høstede knoglemarv blev sat til 100-ul PBS og analyseret for ametrine ekspression. Generelt procentdelen af fluorescerende positive celler er mellem 25% og 70%, afhængig af konstruktionen og retroviral titer. Efter 6 uger knoglemarv injektion musene tappet for at bestemme knoglemarv rekonstituering (figur 1B). Ca. 25 pi perifert blod blev røde blodlegemer lyseret og farvet med anti-TCRβ. I figur 2B alle TCR positive celler samstemmende udtrykke ametrine fluorescerende protein.
FiguAd 1. Eksempel på Bone Marrow Transduction og Peripheral TCR Retrogenic T-celler. A) transduktionseffektivitet af knoglemarvsceller er analyseret på basis af den fluorescerende markør (ametrine) på dagen for knoglemarv overførsel. Ca. 10 pi af den høstede knoglemarv blev tilsat til 100 pi PBS og analyseret for ametrine ekspression. En vellykket knoglemarvstransplantation transduktion vil give en procentdel af fluorescerende positive celler mellem 25% og 70%. B) Eksempel på TCR retrogenic T-celler i perifert blod 6 uger efter knoglemarvstransplantation rekonstituering. Perifert blod blev opnået, og røde blodlegemer blev lyseret med RBC lysebuffer. De resterende celler blev farvet for TCRβ. Repræsentant analyse for ametrine udtryk og anti-TCRβ farvning 6 uger efter knoglemarven rekonstituering. Klik her for at se en større udgave af thans figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I protokollen er vi detalje flere kritiske skridt til at sikre optimal knoglemarv sundhed, transduktion effektivitet og rekonstituering. Først afgørende skridt er generering og korrekt vedligeholdelse af GP + E86 viral producentpriser celler. Brug tidlige passage producent- cellelinier og holdes ved 80% konfluens eller lavere før anvendelse. Når du foretager friske GP + E86 viral producentpriser celler, sikre 293T-celler er tidlig passage og voksende i kultur i 24-48 timer. Plating for mange GP + E86 celler under transduktionen trin vil sænke virustiter. Bestem viral titer som beskrevet i Holst et al. 11 for at sikre GP + E86 er robuste virale producenter. Derudover fjernelse af røde blodlegemer fra den høstede knoglemarv forbedrer transduktionseffektivitet. Sikring af sundhed knoglemarvs forfædre er afgørende for succes af protokollen. Til dette formål, altid bruge friske medier (mindre end 4 uger ved 4 ° C efter suppleret med FCS) og friske cytokiner (mindreend 2 uger, når det opbevares ved 4 ° C). Hexadimethrinbromid er også følsomme over for nedbrydning og bør gøres frisk, når den er i opløsning, hver 2. måned. Andre detaljer, der vil sikre optimal knoglemarv sundhed og transduktion omfatter pre-varmer centrifugen før spin transduktion. Spin-transducere ved 37 ° C og wrap plader med plastfolie for at mindske gasudveksling så meget som muligt. Også, lad ikke knoglemarven sidde uden for 37 ° C inkubator eller på is i længere perioder, da dette vil øge celledød og mindske knoglemarv transduktion og rekonstituering. Efter knoglemarvsceller er høstet på dag 4 (trin 13), kun indlæse sprøjterne umiddelbart før injektion musene. Endelig sikre, at mus anbringes på antibiotika dagen før eller dagen af bestrålingen.
Udnyttelse af denne retroviral medieret transduktion protokol giver mulighed for transduktion af knoglemarvens stamceller resulterer igenereringen af T-cellereceptoren retrogenic mus. Retrogenic mus er hurtigere at generere end TCR transgene mus og omkostninger betydeligt mindre end laves en enkelt TCR transgen. Dog kan retrogenic mus ikke avles og skal genereres på ny med hvert forsøg 10. Antallet af perifere T-celler er lavere i retrogenic mus end set i TCR transgene mus men reguleringen af TCR er sammenlignelig mellem TCR retrogenic og TCR transgene 10. TCR retrogenic system giver mulighed for ekspression af multiple TCR'er inden for samme koloni og selv inden for samme forsøg. Udnytte den TCR retrogenic protokollen beskrevet her giver mulighed for en investigator at teste og screene udviklingen og funktionaliteten af talrige nyligt identificerede MHC klasse I eller II begrænsede TCR. Med udviklingen af "humaniserede mus" model 18,19, kunne TCR retrogenic yderligere udvides ved anvendelse af klonede humane TCR'er. Derudover 2A forbundne konstruktioner cen også anvendes til at studere andre multi-proteiner, herunder CD3-kæder, interleukiner og kimære antigen-receptorer 20-24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra NIH (5K22A1119151-01 og 1R56DK104903-01) til MLB, Pilot / Feasibility Program for Diabetes Research Center (P30-DK079638) på BCM, JDRF 1-FAC-2014-243-AN APF, ADA 1-15-JF-07, AAI Karriere i Immunologi Fellowship til MB, og The Robert og Janice McNair Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM, high glucose + glutamine | Corning Cellgro | 10-013-CV | Dulbecco's Modification of Eagle's Medium with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate |
| FBS | Atlanta Biological | S11550 | |
| Trypsin-Versene | Lonza | 17-161F | |
| 0.45 µm syringe filter | Thermo Scientific | 194-2545 | |
| polybrene | Sigma | H9268-10G | Sterile Filtered in dH2O |
| Ciprofloxacin | VWR | AAJ61970-06 | |
| 5-fluorouracil (5-FU) | VWR | AAA13456-06 | |
| Sodium Pyruvate | Corning Cellgro | 25-000-CI | |
| MEM nonessential Amino Acids | Corning Cellgro | 25-025-CI | |
| HEPES 1 M solution | Corning Cellgro | 25-060-CI | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco by Life Technologies | 21985-023 | |
| Pen/Strept | Corning Cellgro | 30-002-CI | |
| L-glutamine | Corning Cellgro | 25-005-CI | |
| 150 mm tissue culture dishes | Greiner Bio-one | 639160 | |
| Tisue culture-treated 6-well flat plate | Greiner Bio-one | 657160 | |
| 70 µm nylon cell strainers | Falcon | 352350 | |
| Mouse IL-3 | Invitrogen | PMC0033 | |
| Human IL-6 | Invitrogen | PHC0063 | |
| Mouse Stem Cell Factor | Invitrogen | PMC2113L | |
| 10x PBS | Corning Cellgro | 46-D13-CM | |
| HANKS Buffer | Corning Cellgro | 21020147 | |
| BD 10 ml Syringe | BD | 300912 | |
| BD 1 ml Syringe | BD | 309659 | |
| 27 G x 1/2 BD Precision Glide Needle | BD | 305109 | |
| 30 G x 1/2 BD Precision Glide Needle | BD | 305106 |
References
- Qi, Q., et al. Diversity and clonal selection in the human T-cell repertoire. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 13139-13144 (2014).
- Zarnitsyna, V. I., Evavold, B. D., Schoettle, L. N., Blattman, J. N., Antia, R. Estimating the diversity, completeness, and cross-reactivity of the T cell repertoire. Frontiers in immunology. 4, 485 (2013).
- Kisielow, P., Bluthmann, H., Staerz, U. D., Steinmetz, M., von Boehmer, H. Tolerance in T-cell-receptor transgenic mice involves deletion of nonmature CD4+8+ thymocytes. Nature. 333, 742-746 (1988).
- Hogquist, K. A., et al. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76, 17-27 (1994).
- Verdaguer, J., et al. Spontaneous autoimmune diabetes in monoclonal T cell nonobese diabetic mice. J Exp Med. 186, 1663-1676 (1997).
- Katz, J. D., Wang, B., Haskins, K., Benoist, C., Mathis, D. Following a diabetogenic T cell from genesis through pathogenesis. Cell. 74, 1089-1100 (1993).
- Pauza, M. E., et al. T-cell receptor transgenic response to an endogenous polymorphic autoantigen determines susceptibility to diabetes. Diabetes. 53, 978-988 (2004).
- Jasinski, J. M., et al. Transgenic insulin (B:9-23) T-cell receptor mice develop autoimmune diabetes dependent upon RAG genotype, H-2g7 homozygosity, and insulin 2 gene knockout. Diabetes. 55, 1978-1984 (2006).
- Kersh, G. J., et al. TCR transgenic mice in which usage of transgenic alpha- and beta-chains is highly dependent on the level of selecting ligand. Journal of immunology. 161, 585-593 (1998).
- Bettini, M. L., Bettini, M., Vignali, D. A. TCR retrogenic mice: A rapid, flexible alternative to TCR transgenic mice. Immunology. 136 (3), 265-272 (2012).
- Holst, J., et al. Generation of T-cell receptor retrogenic mice. Nat Protoc. 1, 406-417 (2006).
- Holst, J., Vignali, K. M., Burton, A. R., Vignali, D. A. Rapid analysis of T-cell selection in vivo using T cell-receptor retrogenic mice. Nat Methods. 3, 191-197 (2006).
- Bettini, M. L., Bettini, M., Nakayama, M., Guy, C. S., Vignali, D. A. Generation of T cell receptor-retrogenic mice: improved retroviral-mediated stem cell gene transfer. Nat Protoc. 8, 1837-1840 (2013).
- Donnelly, M. L., et al. Analysis of the aphthovirus 2A/2B polyprotein 'cleavage' mechanism indicates not a proteolytic reaction, but a novel translational effect: a putative ribosomal 'skip'. J Gen Virol. 82, 1013-1025 (2001).
- Atkins, J. F., et al. A case for "StopGo": reprogramming translation to augment codon meaning of GGN by promoting unconventional termination (Stop) after addition of glycine and then allowing continued translation (Go). RNA. 13, 803-810 (2007).
- Doronina, V. A., et al. Site-specific release of nascent chains from ribosomes at a sense codon. Mol Cell Biol. 28, 4227-4239 (2008).
- Bettini, M., et al. TCR affinity and tolerance mechanisms converge to shape T cell diabetogenic potential. Journal of immunology. 193, 571-579 (2014).
- Brehm, M. A., Wiles, M. V., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Generation of improved humanized mouse models for human infectious diseases. J Immunol Methods. 410, 3-17 (2014).
- Brehm, M. A., Shultz, L. D., Greiner, D. L. Humanized mouse models to study human diseases. Curr Opin Endocrinol Diabetes Obes. 17, 120-125 (2010).
- Chaplin, P. J., et al. Production of interleukin-12 as a self-processing 2A polypeptide. J Interferon Cytokine Res. 19, 235-241 (1999).
- Collison, L. W., et al. The inhibitory cytokine IL-35 contributes to regulatory T-cell function. Nature. 450, 566-569 (2007).
- Holst, J., et al. Scalable signaling mediated by T cell antigen receptor-CD3 ITAMs ensures effective negative selection and prevents autoimmunity. Nature immunology. 9, 658-666 (2008).
- Kalos, M., et al. T cells with chimeric antigen receptors have potent antitumor effects and can establish memory in patients with advanced leukemia. Sci Transl Med. 3, 95ra73 (2011).
- VanSeggelen, H., et al. T Cells Engineered With Chimeric Antigen Receptors Targeting NKG2D Ligands Display Lethal Toxicity in Mice. Mol Ther. 23, 1600-1610 (2015).
