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Immunology and Infection

Rétrovirale transduction des cellules progénitrices de la moelle osseuse pour générer des cellules T Receptor Retrogenic Souris

Published: July 11, 2016 doi: 10.3791/54196
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Pediatrics, Baylor College of Medicine

Introduction

Récepteur des cellules T (TCR) de répertoire humain et la souris a été estimée à 1 x 10 8 et 2 x 10 6 RLT uniques respectivement 1,2. Cette grande diversité permet aux cellules T de reconnaître une vaste gamme d'épitopes d'antigènes dérivés d'auto-peptides, ainsi que des agents pathogènes présentés par le complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) sur les cellules présentatrices d'antigènes (APC). Les différences subtiles dans les interactions des RLT uniques avec des complexes peptide-CMH déterminent si une cellule T subira l'apoptose, l'anergie, l'activation, la différenciation, la production de cytokine ou la cytotoxicité. Toutefois, en raison du grand répertoire de TCR, l'analyse de la façon dont un TCR spécifique de répondre à un antigène particulier nécessite l'utilisation de systèmes de TCR unique.

Diverses souris transgéniques TCR ont été générés dans le but d'étudier la fonction d'un seul TCR dans un modèle in vivo 3-9. Cependant, il existe des réserves de TCR des souris transgéniques, y compris lale coût, la durée de temps pour générer une seule souris transgénique et le soi - disant effet fondateur d'insertion du transgène aléatoire dans l' ADN de la lignée germinale 10. Par conséquent, relativement peu de souris transgéniques TCR ont été générées pour tout antigène donné et les implications fonctionnelles de haute affinité et une faible TCR pour le même épitope sont rarement pris en compte. Pour répondre à la nécessité d'une approche rapide à l' écran et d' étudier plusieurs TCR individuellement ou en combinaison, les souris retrogenic ( «rétro» de retrovirus et 'géniques' de transgéniques) ont été utilisés comme une alternative à TCR des souris transgéniques 11-13.

Le motif consensus 2A peptide trouvés dans plusieurs virus sont constitués par un 2A-Asp-Val / Ile-Glut-X-Asn-Pro-Gly-2B-Pro, dans laquelle le clivage se produit entre la glycine, de la figure 2A et la proline de la figure 2B de l'activité hydrolase de cis, ce qui entraîne le saut du ribosome pendant la traduction 10,14-16. Pour un diagramme détaillé représentant la cleavage des différents peptides 2A (F2A, E2A, T2A et P2A) s'il vous plaît se référer aux références 10 - 12. De cette manière, 2 cistrons (TCR alpha et TCR bêta) peuvent être liés résultant en traduction stoechiométrique dans un seul vecteur. En utilisant cette approche, nous sommes en mesure d'exprimer et de comparer directement plusieurs TCR spécifiques de l' antigène in vivo.

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Protocol

Déclaration d' éthique: Tous les efforts sont faits pour maintenir inconfort ou de stress animal à un minimum lors de l' irradiation et de la queue veine injections. Les souris sont utilisées comme source de cellules dans ces expériences; en tant que tel, il n'y a pas de procédures ou manipulations en dehors de l'euthanasie. Les souris seront euthanasiés par inhalation de CO 2 suivie par dislocation cervicale pour confirmer la mort. Cette procédure est conforme aux recommandations du Groupe d'étude sur l'euthanasie de l'American Veterinary Medical Association.

1. Préparer rétrovirale Construct

  1. Sous-clone du récepteur des cellules T (TCR) chaînes alpha et bêta, séparés par un lieur 2A, dans un retroviral 11 vecteur à base de MSCV (exemple, pMIAII ou pMIGII) 11.
    NOTE: Le lieur 2A permet l'expression stoechiométrique et concordant des alpha et bêta de TCR chaînes à partir d'un cadre de lecture ouvert unique. Le vecteur comprend une cassette IRES fluorescent de protéines (ou ametrine GFP) qui est utilisé poursuivre les cellules transduites et l'efficacité de transduction. Pour un protocole détaillé s'il vous plaît voir Holst et al 11.
  2. Isoler l'ADN plasmidique à l'aide obtenue dans le commerce kit de préparation de plasma ou un produit similaire. Utiliser une concentration de travail de 1 - 2 pg ul -1.

2. Génération de rétrovirales Producteur lignées cellulaires

  1. Utiliser un processus en deux étapes pour produire les lignées cellulaires productrices rétrovirales.
    NOTE: Pour un protocole détaillé, s'il vous plaît voir Holst et al 11..
    1. Générer retrovirus par transfection transitoire de cellules 293T avec trois plasmides (pVSVG, PEQ-pAM3 (-E) et vecteur d'intérêt 11) et prendre le surnageant retroviral à partir des cellules 293T à la transduction de la lignée cellulaire productrice GP + E86 écotrope rétroviral.
    2. Isoler le top 40% des cellules exprimant la production GP + E86 fluorescentes par FACS et propager les cellules productrices + E86-GP transdcuced comme source de virus.
      NOTE: La générationproducteurs à titre élevé de est essentielle pour la transduction efficace de cellules de moelle osseuse. Pour un protocole complet s'il vous plaît voir Holst et al. 11

3. retrovirus transfert de cellules souches Gene (Jour -5)

  1. Dégeler et culture 0.5 -1.0 x 10 6 de chaque lignée cellulaire productrice GP + E86 dans DMEM complet à 10% (vol / vol) FBS pour permettre une croissance suffisante pour deux confluentes plaques de 150 mm par jour 0 de ce protocole.
    NOTE: Dégel 0,5 à 1,0 x 10 6 de chaque lignée cellulaire productrice GP + E86 dans une plaque de 10 cm permettra 30 - 50% de confluence au jour 5. Cela permet également de 5 jours de culture en vue d'élargir le GP + E86 lignées cellulaires de production à deux confluentes plaques de 150 mm par jour 0.
    1. Culture de la lignée cellulaire productrice rétrovirale dans un milieu complet de culture de tissu contenant 5% de sérum de veau féta, et la ciprofloxacine (10 pg / ml) afin d'éviter une contamination par des mycoplasmes.
      NOTE: Cesser l'utilisation de la ciprofloxacine lorsque generating surnageant viral pour la transduction de la moelle osseuse. Évitez de trop-croissance de la lignée cellulaire productrice, car cela aura un impact négatif de la moelle osseuse efficacité de transduction.

4. Les souris donneuses Inject avec 5-fluorouracile (5-FU) (Jour -3)

  1. Peser les souris donneur (5 - 12 semaines) pour déterminer la quantité de 5-FU nécessaire. En utilisant des souris de moins de 5 semaines de résultats d'âge faible rendement de la moelle osseuse. Pour assurer l'expression d'un seul TCR, utiliser une souche de souris déficiente des lymphocytes T tels que SCID, RAG ou TCR alpha souris déficientes en tant que donneurs de moelle osseuse.
  2. Travailler dans le tissu de la culture hotte, diluer le stock 5-FU avec du PBS stérile afin d'obtenir une quantité suffisante de 10 mg ml -1 solution de travail de 5-FU pour fournir 0,15 mg 5-FU par gramme de poids corporel.
  3. En utilisant une seringue de 1 ml avec une aiguille 37 G, intraperitoneale injectent 0,15 mg de 5-FU par gramme de poids corporel par souris donneuse.
    REMARQUE: Utilisez la souris 1 donneur par un destinataire pour démarrer et réglerle nombre de souris donneuses en fonction du rendement de la cellule. Une autre méthode pour le traitement 5-FU pour l'enrichissement et l' isolement de progéniteurs de moelle osseuse est la sélection négative de cellules positives de la lignée , comme décrit dans Viret et al.

5. Bone Marrow Procédure d'extraction (jour 0)

  1. Obtenir des ciseaux de dissection et des pinces pour l'isolement de l'os. Préparer les supports (HBSS additionné de 5% de SVF (v / v)) pour recueillir des os dans un tube conique de 50 ml. Gardez 50 ml conique contenant des médias sur la glace. Euthanasier souris par inhalation de CO 2 suivie par dislocation cervicale pour confirmer la mort. Pincez patte pour assurer qu'aucun réflexes sont détectés.
  2. Stériliser le site chirurgical et des outils chirurgicaux avec l'éthanol ou le méthanol. Retirez le fémur, le tibia, l'humérus, et la ceinture pelvienne avec soin par la première découpe et sous la ceinture pelvienne. Coupez le long du fémur au tibia. Retirez tous les tissus environnants en utilisant des ciseaux et des pinces pour obtenir des os propres. Garderos hydratés dans HBSS + 5% (volume / volume) de FBS.
  3. Séparer les os en coupant au niveau des articulations, en veillant à couper les deux extrémités de chaque os. Insérer une aiguille de calibre 25 fixée à une seringue de 10 ml contenant du HBSS + 5% (volume / volume) de FBS. Appliquer une pression et rincer toute la moelle osseuse à travers une passoire de repos de 70 pm dans un 50 ml conique.
  4. Périodiquement, pousser la moelle osseuse à travers le filtre de 70 um en utilisant le piston d'une seringue de 1 ml ou 3 ml. Rincer le filtre avec du HBSS + 5% (volume / volume) de FBS. Ceci assurera une suspension cellulaire unique qui est exempte de fragments osseux et des tissus. Gardez les cellules stériles en effectuant la procédure dans une hotte stérile.
  5. cellules de moelle osseuse centrifuger à 300 g pendant 10 min à 4 ° C.

6. moelle osseuse Culture (jour 0)

  1. Décanter ou aspirer les médias et culot cellulaire de remettre en suspension dans 1 ml de tampon d'ammonium à base de chlorure de lyse des globules rouges (ou équivalent RBC tampon de lyse) par 50 ml tube conique. Après 1 min d'incubation à la chambrela température, la trempe le tampon de lyse des globules rouges en ajoutant 10 ml de DMEM complet à 20% (volume / volume) de FBS.
  2. Centrifuger les cellules à 300 g pendant 10 min à 4 ° C.
  3. Décanter ou aspirer le surnageant et remettre en suspension la moelle osseuse dans 5 ml de DMEM complet à 20% (volume / volume) de FBS. Compter les cellules avec une chambre de comptage de Neubauer.
    NOTE: le rendement général devrait être d' environ 5 à 10 x 10 6 cellules par souris; cependant, le rendement peut varier entre les différentes souches de souris.
  4. Les cellules plaque de la moelle osseuse à une densité de 4 x 10 7 cellules par plaque de 150 mm dans 30 ml de DMEM complet à 20% (volume / volume) de FBS supplémenté avec de l' IL-3 (20 g ml - 1), IL-6 (50 g ml -1) et SCF (50 g ml -1).
    REMARQUE: Utilisez des cytokines fraîchement décongelé-aliquotées. Ne pas utiliser de cytokines qui ont été congelés et décongelés plus d'une fois ou conservés à 4 ° C pendant plus de 2 semaines.
  5. Incuber la moelle osseuse pendant une nuit (environ 24 heures) à 37 ° C avec 5% de CO 2.

  1. La plaque 3 x 10 6 cellules productrices rétrovirales par plaque de 150 mm dans 18 ml de DMEM complet à 20% (volume / volume) de FBS.
  2. Incuber des cellules productrices de retrovirus à 37 ° C pendant une nuit. Anticiper une plaque de 150 mm pour 15 millions de cellules de moelle osseuse (environ 2 - 3 des souris donateurs).

8. rétrovirale Surnageant (Jour 1)

  1. Le lendemain (environ 24 heures plus tard), récolter le surnageant retroviral à partir des plaques de producteurs (mis en place à l'étape 7) en élaborant le surnageant retroviral directement sur la plaque de 150 mm avec une seringue de 10 ml et le filtre en utilisant un 0,45 filtre seringue -μm.
  2. Replacez soigneusement le surnageant retroviral enlevé avec 18 ml de DMEM complet frais de 20% (vol / vol) FBS.
  3. Compléter le surnageant retroviral filtré avec de l' IL-3 (20 g ml - 1), IL-6 (50 g ml -1), MSCF (50 g ml -1) et de bromure d' hexadiméthrine (polybrène) (6 &# 956; g ml -1).
    REMARQUE: le bromure d'hexadiméthrine devrait être fraîche tous les 2 mois pour éviter une baisse de l'efficacité de la transduction rétrovirale.

9. Bone Marrow Harvest (Jour 1)

  1. Après avoir terminé l'étape 8.3, récolter les cellules de la moelle osseuse de l'étape 6.4 et transférer les médias contenant des cellules non-adhérentes dans des tubes de 50 ml stériles.
  2. Laver les plaques vigoureusement avec 10 ml de PBS et de recueillir dans les 50 ml conique de l'étape 9.1. Si nécessaire, répéter l'étape de lavage.
  3. Centrifuger les cellules à 300 g pendant 10 min à 4 ° C, transvaser le surnageant, remettre les cellules dans un petit volume (1 - 3 ml) de DMEM complet 20% (vol / vol) de FBS, et compter. Anticiper 50-75% de récupération du jour 0. Resuspendre la moelle osseuse à 1 x 10 6 cellules par 1 ml du surnageant retroviral contenant des cytokines et le bromure de Hexadimethrine.

10. Bone Marrow transduction (Jour 1)

  1. Plaque rétroviral surnageant / os marrow mélange à un volume de 3 ml par puits dans une plaque de culture tissulaire à six puits. Envelopper les plaques dans une pellicule de plastique pour minimiser les échanges gazeux au cours de la centrifugation à l'étape 10.2.
  2. Faites tourner les plaques à six puits emballés à 1000 xg pendant 60 min à 37 ° C.
  3. Après le spin est terminée, retirez la pellicule de plastique et placer les plaques dans un incubateur à 37 ° C CO 2 pendant 24 heures.

11. rétrovirale Surnageant et transduction (Jour 2)

  1. Après 24 h, de recueillir surnageant viral frais à partir de la lignée cellulaire productrice virale. Filtrer le surnageant retroviral en utilisant une seringue de 10 ml et un filtre à seringue de 0,45 um. Compléter le surnageant filtré rétrovirale avec l' IL-3 (20 g ml - 1), IL-6 (50 g ml - 1) et du SCF (50 g ml - 1) et de bromure d' hexadiméthrine (6 g ml -1).
  2. Ensuite, retirez soigneusement avec une pipette ou aspirer les 2 premiers ml de milieu de chaque puits de la plaque de six puits contenant les cellules de la moelle osseuse.
    REMARQUE: Le travail avec soin de ne pas aspirer la moelle osseuse, ce qui est généralement concentrée dans le milieu du puits. En variante, le surnageant a été retiré peut être centrifugé pour récupérer toutes les cellules de la moelle osseuse perdus.
  3. Pour chaque puits dans la moelle osseuse plaque de 6 puits ajouter 3 ml de surnageant contenant des cytokines virales fraîches et le bromure de Hexadimethrine. Envelopper les plaques en plastique, et répéter la transduction de spin à 1000 xg pendant 60 min à 37 ° C. Déballer les plaques et incuber les cellules à 37 ° C et 5% de CO 2 pendant une nuit (environ 24 heures).

12. Ajout de frais supplémenté DMEM (Jour 3)

  1. Après 24 heures, retirer les 2 premiers ml de milieu de chaque puits de la plaque de six puits contenant les cellules de la moelle osseuse, comme dans l'étape 11.2. Remplacer le support enlevé avec du DMEM frais à 20% (volume / volume) de FBS supplémenté avec des concentrations finales de l' IL-3 (20 g ml - 1), IL-6 (50 g ml - 1) et du SCF (50 g ml -1) .
  2. Incuber la moelle osseuseles plaques à 37 ° C incubateur à CO2 pendant 24 h.

13. Récolte transduites moelle osseuse (Jour 4)

  1. Au bout de 24 h, recueillir les cellules de la moelle osseuse provenant des plaques à six puits. Laver les plaques vigoureusement avec du PBS pour éliminer toutes les cellules non-adhérentes.
    1. Centrifuger les cellules à 300 xg pendant 10 min à 4 ° C, puis décanter le surnageant.
    2. Remettre en suspension la moelle osseuse dans un petit volume (1 ml) de PBS + 0,5% (volume / volume) de FBS inactivé à la chaleur. Gardez les cellules sur la glace.
  2. Prenez un échantillon de 10 pi de chaque état de la moelle osseuse et de compter les cellules en utilisant une chambre de comptage de Neubauer. En supposant que 1 - 2 donateurs par bénéficiaire, le rendement sera suffisant pour transférer au moins 4 x 10 6 cellules par souris receveuse. Remettre en suspension la moelle osseuse dans un volume suffisant de PBS + 0,5% (volume / volume) de FBS inactivé à la chaleur à injecter 200 - 300 ul par souris.
    1. Injecter au moins 2 x 10 6 cellules avec une efficacité de transductionde 25% (peut injecter jusqu'à 8 x10 6 cellules) par souris par voie intraveineuse.
      REMARQUE: On injecte régulièrement cinq souris receveuses par deux plaques de cellules de moelle osseuse à 6 puits. Si le rendement est nettement plus faible, plus les souris donneuses doivent être utilisées jusqu'à ce que le nombre de moelle osseuse suffisante peut être obtenue. Afin de parvenir à une reconstitution optimale, au moins 5 x 10 5 transduction (fluorescente positive) doit être injecté dans chaque destinataire.
  3. Avec un micro - pipette, prélever un échantillon de 10 pi de chaque état ​​de la moelle osseuse et d' analyser l' efficacité de transduction par cytométrie de flux basé sur l' expression du marqueur fluorescent (figure 1A) 11.
    NOTE: En règle générale, le pourcentage de cellules positives fluorescentes est comprise entre 25% et 70%, en fonction de la construction et le titre retroviral. Le nombre de cellules de moelle osseuse transduites nécessaires pour reconstituer une souris sublétales irradier peut varier en fonction de l'efficacité de transduction. Plus le tranl'efficacité sduction, les cellules de la moelle osseuse plus nécessaire et, inversement, plus l'efficacité de transduction de la moelle osseuse, la diminution du nombre de cellules nécessaires pour la reconstitution. L'efficacité de transduction inférieure à 25% est sous-optimale et peut conduire à une reconstitution insuffisante et la survie. Afin d'assurer la récupération de la moelle osseuse optimale et l'efficacité de la transduction, utiliser les médias et les cytokines de culture de tissus fraîchement préparés. Lors de l' expression d' un nouveau TCR utilisant le système retrogenic, la sélection de ce TCR in vivo est inconnu. En fonction de chaque individu TCR à affinité, la sélection du TCR dans le thymus et l' expression périphérique de lymphocytes T variera 17.

14. Souris Irradiation, moelle osseuse Injection et des Soins

  1. Irradiation des souris le jour avant l'injection de moelle osseuse (même jour que l'étape 13). Utilisez les doses suivantes: C57BL / 6 souris (et d' autres souches de type sauvage), 900 rads; Rag1 - / - souris, 500 rads, des souris SCID, 300 rads).
    1. souris Lieu bénéficiaires sur amoxicilline (50 mg / kg / jour) ou un autre traitement antibiotique de l'eau avant l'irradiation, et de garder des antibiotiques pour les deux premières semaines après l'injection de moelle osseuse.
      NOTE: La dose d'irradiation optimale peut être déterminée de manière empirique.
  2. Pour l'injection, charger les cellules de l'étape 13.1 dans une seringue de 1 ml en utilisant des aiguilles émoussées immédiatement avant injection, puis changer l'aiguille de calibre 27 pour l'injection, expulser l'air pour éviter une embolie gazeuse. Des souris thermique sous une lampe chauffante et injecter 0,2 ml de moelle osseuse de souris par voie intraveineuse.
    REMARQUE: Ne laissez pas les cellules sont assis dans la seringue pour toute longueur de temps ou les cellules se déposent.
  3. Surveiller les souris chaque semaine pour veiller à ce qu'ils restent en bonne santé.
  4. Après 5 - 6 semaines saigner les souris pour vérifier la reconstitution sur la base de la GFP + / amétrine + et TCR co-expression (figure 1B) 11.

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Representative Results

Os efficacité de transduction de la moelle est vérifiée à l' étape 13.3 du protocole avant la moelle osseuse est injecté dans la veine caudale iv Dans le représentant de la moelle osseuse transduction figure (figure 1A), environ 10 pi de l'os récolté osseuse a été ajouté à 100 pi de PBS et analysés pour l'expression amétrine. En général, le pourcentage de cellules positives fluorescentes est comprise entre 25% et 70%, en fonction de la construction et le titre retroviral. Après l' injection de moelle osseuse de 6 semaines, les souris sont saignées pour déterminer la reconstitution de moelle osseuse (figure 1B). Environ 25 pi de sang périphérique a été globules rouges lysées et colorées avec anti-TCRβ. Dans la figure 2B toutes les cellules positives TCR expriment concordante la protéine amétrine fluorescente.

Figure 1
Figure 1. Exemple de cellules de moelle osseuse transduction et périphérique TCR Retrogenic T. A) transduction efficacité des cellules de moelle osseuse est analysée sur la base du marqueur fluorescent (amétrine) le jour du transfert de la moelle osseuse. Environ 10 pi de l'os récolté osseuse a été ajouté à 100 ul de PBS et analysées pour l'expression de amétrine. Une transduction de moelle osseuse réussie donne un pourcentage de cellules positives fluorescentes entre 25% et 70%. B) Exemple de cellules T TCR retrogenic dans le sang périphérique 6 semaines après la reconstitution de la moelle osseuse. On a obtenu du sang périphérique et les globules rouges ont été lysés avec un tampon de lyse des globules rouges. Les cellules restantes ont été colorées pour TCRβ. Analyse représentative pour l' expression de amétrine et anti-TCRβ coloration 6 semaines après la reconstitution de la moelle osseuse. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de tsa figure.

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Discussion

Dans le protocole, nous détaillons plusieurs étapes essentielles pour assurer la santé de la moelle osseuse optimale, l'efficacité de la transduction et la reconstitution. Première étape critique est la génération et le bon entretien des cellules productrices virale GP + E86. Utiliser des lignées de cellules productrices de passages précoces et maintenir à 80% de confluence ou plus bas avant l'utilisation. Lors de cellules productrices virale GP + E86 frais, assurer que les cellules 293T sont passage précoce et de plus en plus en culture pendant 24-48 h. Placage trop de cellules GP + E86 au cours de l'étape de transduction va diminuer le titre viral. Déterminer le titre viral comme décrit dans Holst et al. , 11 pour assurer GP + E86 sont des producteurs viraux robustes. En outre, l'élimination des globules rouges dans la moelle osseuse récoltée améliore l'efficacité de transduction. Assurer la santé des progéniteurs de la moelle osseuse est essentielle à la réussite du protocole. À cette fin, utilisez toujours un milieu frais (moins de 4 semaines à 4 ° C après complémenté avec FCS) et des cytokines fraîches (moinsde 2 semaines lorsqu'il est conservé à 4 ° C). hexadiméthrine bromure est également sensible à la dégradation et devrait être frais, une fois qu'il est en solution, tous les 2 mois. D'autres détails qui assureront la santé de la moelle osseuse optimale et la transduction comprennent pré-réchauffement de la centrifugeuse avant la transduction de spin. Spin-transduction à 37 ° C et envelopper les plaques avec une pellicule de plastique afin de réduire l'échange autant que possible de gaz. Aussi, ne laissez pas la moelle osseuse asseoir à l'extérieur de l'incubateur à 37 ° C ou sur de la glace pendant de longues périodes de temps que cela va augmenter la mort cellulaire et diminuer la transduction de la moelle osseuse et la reconstitution. Après que les cellules de la moelle osseuse ont été récoltées au jour 4 (étape 13), seulement charger les seringues immédiatement avant l'injection des souris. Enfin, faire en sorte que les souris sont placées sur les antibiotiques de la veille ou le jour de l'irradiation.

L'utilisation de ce protocole à médiation par retrovirus de transduction permet la transduction de cellules progénitrices de la moelle osseuse résultant enla génération de récepteurs cellulaires souris retrogenic T. souris Retrogenic sont plus rapides pour générer de TCR des souris transgéniques et coûtent beaucoup moins cher que de générer un seul transgénique TCR. Cependant, les souris retrogenic ne peuvent pas être élevés et doit générer de nouveau avec chaque expérience 10. Le nombre de cellules T périphériques sont plus faibles chez les souris retrogenic que celle observée chez les souris transgéniques TCR mais la régulation du TCR est comparable entre TCR transgénèse retrogenic et TCR 10. Le système retrogenic TCR permet l'expression de plusieurs TCR au sein de la même colonie et même au sein de la même expérience. Utilisant le protocole retrogenic TCR décrit ici permet à un chercheur de tester et de dépister le développement et la fonctionnalité de nombreux nouvellement identifié du CMH de classe I ou II TCR restreint. Avec le développement du modèle "de la souris humanisée" 18,19, le retrogenic TCR pourrait encore être étendue en utilisant des TCR humains clonés. En outre, la figure 2A liée constructs cun aussi être utilisé pour étudier d' autres multi-protéines , y compris les chaînes CD3, les interleukines et les récepteurs d'antigènes chimériques 20-24.

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Disclosures

Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par des subventions du NIH (5K22A1119151-01 et 1R56DK104903-01) à MLB, Programme du Centre de recherche du diabète (P30-de DK079638) au BCM Pilot / faisabilité, la FRDJ 1-FAC-2014-243-AN CSA, ADA 1-15-JF-07, AAI Carrières in Immunology Fellowship à MB, et Le Robert et la Fondation Janice McNair.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM, high glucose + glutamine Corning Cellgro 10-013-CV Dulbecco's Modification of Eagle's Medium with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate
FBS Atlanta Biological S11550
Trypsin-Versene Lonza 17-161F
0.45 µm syringe filter Thermo Scientific 194-2545
polybrene Sigma H9268-10G Sterile Filtered in dH2O
Ciprofloxacin  VWR AAJ61970-06
5-fluorouracil (5-FU) VWR AAA13456-06
Sodium Pyruvate Corning Cellgro 25-000-CI
MEM nonessential Amino Acids Corning Cellgro 25-025-CI
HEPES 1 M solution Corning Cellgro 25-060-CI
2-Mercaptoethanol Gibco by Life Technologies 21985-023
Pen/Strept Corning Cellgro 30-002-CI
L-glutamine Corning Cellgro 25-005-CI
150 mm tissue culture dishes Greiner Bio-one 639160
Tisue culture-treated 6-well flat plate Greiner Bio-one 657160
70 µm nylon cell strainers Falcon 352350
Mouse IL-3 Invitrogen PMC0033
Human IL-6 Invitrogen  PHC0063
Mouse Stem Cell Factor Invitrogen PMC2113L
10x PBS Corning Cellgro 46-D13-CM
HANKS Buffer Corning Cellgro 21020147
BD 10 ml Syringe BD 300912
BD 1 ml Syringe BD 309659
27 G x 1/2 BD Precision Glide Needle BD 305109
30 G x 1/2 BD Precision Glide Needle BD 305106

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Immunologie numéro 113 récepteur des cellules T (TCR) complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) Rétrovirus moelle osseuse transduction Retrogenic
Rétrovirale transduction des cellules progénitrices de la moelle osseuse pour générer des cellules T Receptor Retrogenic Souris
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Lee, T., Shevchenko, I., Sprouse, M. L., Bettini, M., Bettini, M. L. Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice. J. Vis. Exp. (113), e54196, doi:10.3791/54196 (2016).

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