Introduction
T - Zell - Rezeptor (TCR) Repertoire von Mensch und Maus wurde mit 1 x 10 8 und 2 x 10 6 einzigartige TCRs jeweils 1,2 geschätzt. Diese große Vielfalt ermöglicht T-Zellen eine Vielzahl von Antigen-Epitope aus selbst Peptiden sowie von Pathogenen dargestellt durch den Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) auf Antigen-präsentierenden Zellen (APCs) abgeleitet zu erkennen. Die feinen Unterschiede in den Wechselwirkungen der TCRs mit einzigartigen Peptid-MHC-Komplexe diktieren, ob eine T-Zell-Apoptose durchlaufen wird, Anergie, Aktivierung, Differenzierung, Zytokinproduktion oder Zytotoxizität. Jedoch aufgrund der großen TCR-Repertoire, Analyse, wie ein spezifischer TCR zu einem bestimmten Antigen zu reagieren erfordert die Verwendung von einzelnen TCR-Systeme.
Verschiedene TCR transgene Mäuse wurden erzeugt , um die Funktion eines einzelnen TCR in einem in vivo - Modell 3-9 zu studieren. Es gibt jedoch Einschränkungen transgenen Mäusen einschließlich der TCRKosten, die Länge der Zeit eine einzelne transgene Maus und die so genannte Gründereffekt von zufälligen Transgen - Insertion in die Keimbahn DNA 10 zu erzeugen. Daher relativ wenige TCR transgene Mäuse wurden für jede gegebene Antigen und die funktionellen Auswirkungen von hohen und niedrigen TCR-Affinität für das gleiche Epitop gerichtet werden selten erzeugt. Um die Notwendigkeit für eine schnelle Annäherung an Bildschirm - Adresse und mehrere TZR einzeln oder in Kombination, retrogenic ( 'retro' von Retrovirus und "gene" von transgenen) Mäuse wurden als Alternative genutzt studieren 11-13 transgene Mäuse zu TCR.
Die 2A Peptid Konsensusmotiv innerhalb von mehreren Viren gefunden bestehen aus einer 2A-Asp-Val / Ile-Glut-X-Asn-Pro-Gly-2B-Pro, bei der Spaltung zwischen dem Glycin der 2A und dem Prolin der 2B auftritt von cis - aktiven Hydrolase - Aktivität, was zu einer ribosomalen Skipping bei der Übersetzung 10,14-16. Für eine detaillierte Darstellung der c darstelltlaub der verschiedenen 2A Peptide (F2A, E2A, T2A und P2A) finden Sie auf Referenzen 10 - 12. Auf diese Weise zwei Cistrons (TCR alpha und TCR beta) können in einem einzigen Vektor was in stöchiometrischen Übersetzung verknüpft werden. Unter Verwendung dieses Ansatzes können wir zum Ausdruck bringen und direkt mehrere Antigen - spezifischen TZR in vivo vergleichen.
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Protocol
Ethik - Statement: Es wird alles unternommen Tier Beschwerden oder Stress auf ein Minimum während der Bestrahlung und Schwanzvene Injektionen zu halten. Mäuse werden als Quelle der Zellen in diesen Experimenten verwendet wird; als solche sind keine Verfahren oder Manipulationen abgesehen von Euthanasie. Die Mäuse werden durch CO 2 Inhalation durch Genickbruch folgte eingeschläfert Tod zu bestätigen. Dieses Verfahren ist mit den Empfehlungen des Gremiums für Euthanasie von der American Veterinary Medical Association konsistent.
1. Bereiten Sie Retrovirale Construct
- Sub-Klon der T-Zell - Rezeptor (TCR) alpha und beta - Ketten, durch ein 2A - Linker getrennt sind , in eine MSCV-basierenden retroviralen Vektor 11 (beispielsweise pMIAII oder pMIGII) 11.
HINWEIS: Die 2A Linkers ermöglicht stöchiometrische und konkordant Expression der alpha- und beta-TZR-Ketten von einem einzelnen offenen Leserahmen. Der Vektor enthält eine IRES fluoreszierendes Protein Kassette (ametrine oder GFP), das verwendet wird, umSpur transduzierten Zellen und Transduktionseffizienz. Für eine detaillierte Protokoll finden Sie unter Holst et al. 11 - Isolieren Plasmid-DNA im Handel erhalten Plasma-Prep-Kit oder ein ähnliches Produkt. Verwenden Sie eine Arbeitskonzentration von 1 bis 2 & mgr; g & mgr; l -1.
2. Erzeugung von Retrovirale Producer-Zelllinien
- Verwenden einen zweistufigen Prozess die retrovirale Produzentenzelllinien zu erzeugen.
HINWEIS: Für ein ausführliches Protokoll, sehen Sie bitte Holst et al . 11.- Generieren Retrovirus durch transiente Transfektion von 293T - Zellen mit drei Plasmiden (pVSVG, PEQ-Pam3 (-E) und Vektor von Interesse 11) und nehmen Sie die retrovirale Überstand von den 293T - Zellen die GP + E86 ekotropischen retroviralen Produzentenzelllinie zu transduzieren.
- Isolieren Sie die oberen 40% der fluoreszierenden exprimierenden GP + E86 produzierenden Zellen durch FACS und propagieren die transdcuced-GP + E86 Produzentenzellen als Quelle des Virus.
HINWEIS: Die Erzeugungvon hohem Titer Erzeuger ist kritisch für eine effiziente Transduktion von Knochenmarkszellen. Für eine vollständige Protokoll bitte Holst et al anzuzeigen. 11
3. Retrovirus-vermittelte Stem Cell Gene Transfer (Tag -5)
- Auftauen und Kultur 0,5 -1,0 x 10 6 jedes GP + E86 Produktionszelllinie in komplettem DMEM 10% (vol / vol) FBS ein ausreichendes Wachstum für zwei konfluenten 150-mm - Platten von Tag 0 dieses Protokolls zu ermöglichen.
HINWEIS: Thawing 0,5 - 5. 50% Konfluenz am Tag Dies gilt auch für 5 Tage der Kultur, um den GP + E86 zu erweitern ermöglicht - 1,0 x 10 6 jedes GP + E86 Produktionszelllinie in einem 10 - cm - Platte für 30 erlauben Hersteller-Zelllinien zu zwei konfluenten 150-mm-Platten von Tag 0.- Kultur retroviralen Producer-Zelllinie in vollständiger Gewebekulturmedien, enthaltend 5% Kälberserum Feta und Ciprofloxacin (10 ug / ml) Mycoplasma-Kontamination zu vermeiden.
Hinweis: Die Verwendung von Ciprofloxacin brechen, wenn generating der virale Überstand für Knochenmarkübertragung. Vermeiden Sie über Wachstum der Erzeugerzelllinie, da diese sich negativ auf Knochenmark Transduktionswirksamkeit auswirken wird.
- Kultur retroviralen Producer-Zelllinie in vollständiger Gewebekulturmedien, enthaltend 5% Kälberserum Feta und Ciprofloxacin (10 ug / ml) Mycoplasma-Kontamination zu vermeiden.
4. Inject Spendermäusen mit 5-Fluorouracil (5-FU) (Tag -3)
- Wiegen Sie die Spendermäuse (5-12 Wochen alt) erforderlich, um die Menge an 5-FU zu bestimmen. Mit Mäuse jünger als 5 Wochen alt Ergebnisse in Ausbeute gering Knochenmark. Um sicherzustellen, dass die Expression eines einzelnen TCR, verwenden Sie eine T-Zell-defizienten Mausstamm wie SCID, RAG oder TCR alpha defizienten Mäusen als Knochenmarkspender.
- Zu liefern , 0,15 mg 5-FU pro Gramm Körpergewicht Arbeiten in der Gewebekultur Haube verdünnen Sie die 5-FU Lager mit sterilem PBS , um eine ausreichende Menge von 10 mg ml -1 Arbeitslösung von 5-FU zu machen.
- Unter Verwendung einer 1 ml Spritze mit einer 37 G Nadel injiziert intraperitoneal 0,15 mg 5-FU pro Gramm Körpergewicht pro Spendermaus.
HINWEIS: Verwenden Sie 1 Spendermaus pro Empfänger zu starten und zu justierendie Anzahl von Spendermäusen nach der Zellausbeute. Ein alternatives Verfahren zu den 5-FU - Behandlung zur Anreicherung und Isolierung von Knochenmarksvorläuferzellen ist die negative Selektion von Lineage - positiven Zellen , wie in Viret et al.
5. Knochenmark-Extraktionsverfahren (Tag 0)
- Erhalten Dissektion Schere und Pinzette für die Knochen Isolation. Bereiten Medien (HBSS, ergänzt mit 5% FCS (vol / vol)) Knochen in einem 50 ml konischen Röhrchen zu sammeln. Halten Sie 50 ml konischen haltigen Medien auf Eis. Euthanize Mäuse durch CO 2 Inhalation durch Genickbruch folgte Tod zu bestätigen. Pinch Pfote um sicherzustellen, dass keine Reflexe erkannt.
- Sterilisieren der Operationsstelle und chirurgische Werkzeuge mit Ethanol oder Methanol. Entfernen Sie den Femur, Tibia, Humerus, und Beckengürtel sorgfältig indem zuerst nach oben und unter dem Beckengürtel. Schnitt zurück nach unten entlang des Oberschenkels an der Tibia. Entfernen Sie das gesamte umliegende Gewebe Schere und Pinzette sauberen Knochen zu erhalten. BehaltenKnochen in HBSS + 5% (vol / vol) FBS hydratisiert.
- Trennen Sie die Knochen von an den Gelenken schneiden, um sicherzustellen, beide abzuschneiden endet in jedem Knochen. Legen Sie eine 25-Gauge-Nadel in eine 10-ml-Spritze befestigt enthält HBSS + 5% (vol / vol) FBS. Wenden Sie Druck und spülen Sie alle Knochenmark durch einen 70 & mgr; m Sieb ruht in einem 50 ml konischen.
- Von Zeit zu Zeit, drücken Sie die Knochenmark durch die 70-um-Filter den Kolben aus einer 1 ml oder 3 ml Spritze. Spülen Sie das Sieb mit HBSS + 5% (vol / vol) FBS. Dies wird eine Zellsuspension gewährleisten, die frei von Knochenfragmenten und Gewebe. Halten Zellen steril durch das Verfahren in einer sterilen Haube durchgeführt wird.
- Zentrifuge Knochenmarkszellen bei 300 xg für 10 min bei 4 ° C.
6. Knochenmark-Kultur (Tag 0)
- Dekantieren oder absaugen Medien und resuspendieren Zellpellet in 1 ml Ammoniumchlorid-Basis roten Blut Lysepuffer (oder gleichwertig RBC-Lyse-Puffer) pro 50 ml konischen Röhrchen. Nach 1 min Inkubation bei RaumTemperatur, quenchen die rote Puffer Zelllyse durch 10 ml vollständigem DMEM 20% (Vol / Vol) FBS hinzugefügt wird.
- Zentrifugen Zellen bei 300 xg für 10 min bei 4 ° C.
- Dekantieren oder absaugen Überstand und resuspendieren Knochenmark in 5 ml komplettem DMEM 20% (vol / vol) FBS. Zählen Sie die Zellen mit einer Neubauer-Zählkammer.
HINWEIS: Allgemeine Ausbeute sollte ca. 5 - 10 x 10 6 Zellen pro Maus; jedoch kann die Ausbeute bei den verschiedenen Stämmen von Mäusen variieren. - Platte Knochenmarkzellen in einer Dichte von 4 x 10 7 Zellen pro 150 mm-Platte in 30 ml vollständigem DMEM 20% (Vol / Vol) FBS ergänzt mit IL-3 (20 g ml -1), IL-6 (50 g ml -1) und SCF (50 g ml -1).
HINWEIS: Verwenden Sie frisch aufgetauten-aliquotiert Zytokinen. Verwenden Sie keine Cytokine, die eingefroren wurden und aufgetaut als einmal oder bei 4 ° C für mehr als 2 Wochen gehalten. - Inkubieren über Nacht Knochenmark (ca. 24 h) bei 37 ° C mit 5% CO 2.
- Platte 3 x 10 6 retroviralen Erzeugerzellen pro 150 mm-Platte in 18 ml vollständigem DMEM - 20% (Vol / Vol) FBS.
- Inkubieren retroviralen Erzeugerzellen bei 37 ° C über Nacht. Antizipieren einer 150-mm-Platte für 15 Millionen Knochenmarkzellen (ca. 2 - 3 Donormäusen).
8. Retroviral Supernatant (Tag 1)
- Am nächsten Tag (etwa 24 Stunden später), ernten den retroviralen Überstand von den Produzenten Platten durch die Erstellung des retroviralen Überstand direkt aus der 150-mm-Platte mit einer 10-ml-Spritze und Filter mit einem 0,45 (in Schritt 7 eingestellt ist) -μm Spritzenfilter.
- ersetzen Sie vorsichtig den entfernten retroviralen Überstand mit 18 ml frischem komplettem DMEM 20% (vol / vol) FBS.
- Ergänzung des gefilterten retroviralen Überstand mit IL-3 (20 g ml -1), IL-6 (50 g ml -1), MSCF (50 g ml -1) und Hexadimethrinbromid (Polybrene) (6 &# 956; g ml -1).
HINWEIS: Hexadimethrinbromid sollten frisch alle 2 Monate gemacht werden, um einen Rückgang der Wirksamkeit der retroviralen Transduktion zu vermeiden.
9. Knochenmark-Ernte (Tag 1)
- Nach Abschluss von Schritt 8.3, ernten die Knochenmarkzellen aus Schritt 6.4 und übertragen Sie die Medien nicht adhärenten Zellen in sterile 50-ml-Röhrchen enthält.
- Waschen Sie die Platten kräftig mit 10 ml PBS und sammeln sich in der 50-ml-Erlen aus Schritt 9.1. Falls erforderlich, wiederholen Sie den Waschschritt.
- Zentrifuge die Zellen bei 300 · g für 10 min bei 4 ° C, dekantiert den Überstand, resuspendiere Zellen in einem kleinen Volumen (1 - 3 ml) komplett DMEM 20% (Vol / Vol) FBS und zählen. Antizipieren von 50 bis 75% Rückgewinnung von Tag 0 Resuspendieren Knochenmark bei 1 x 10 6 Zellen pro 1 ml des retroviralen Überstand Zytokinen und Hexadimethrinbromid enthält.
10. Bone Marrow Transduction (Tag 1)
- Platte des retroviralen Überstand / Knochen marrow Mischung mit einem Volumen von 3 ml pro Vertiefung in einer Sechs-Well-Gewebekulturplatte. Wickeln Sie die Platten in der Plastikverpackung um einen Gasaustausch während der Zentrifugation in Schritt 10.2 minimieren.
- Dreh die gewickelt Sechs-Well-Platten bei 1.000 xg für 60 min ein 37 ° C.
- Nach dem Spin abgeschlossen ist, entfernen Sie die Plastikfolie und legen Sie die Platten in einem 37 ° C CO 2 Inkubator für 24 Stunden.
11. Retroviral Supernatant und Transduction (Tag 2)
- Nach 24 Stunden sammeln frische Virusüberstand aus der viralen Hersteller-Zelllinie. Filtriere den retroviralen Überstand unter Verwendung einer 10-ml-Spritze und eine 0,45-um-Spritzenfilter. Ergänzung des gefilterten retroviralen Überstand mit IL-3 (20 g ml -1), IL-6 (50 g ml -1) und SCF (50 g ml -1) und Hexadimethrinbromid (6 g ml -1).
- Als nächstes vorsichtig mit Pipette entfernen oder die obersten 2 ml Medium aus jeder Vertiefung der Sechs-Well-Platte aspirieren die Knochenmarkszellen enthält,.
HINWEIS: Arbeit sorgfältig nicht das Knochenmark anzusaugen, die in der Regel in der Mitte der Vertiefung konzentriert wird. Alternativ kann der abgenommenen versponnen werden Sie sich alle verlorenen Knochenmarkszellen zu erholen. - Zu jeder Vertiefung im Knochenmark 6-Well-Platte 3 ml frischem viralen Überstand mit Zytokinen und Hexadimethrinbromid. Wickeln Sie die Platten aus Kunststoff, und wiederholen Sie die Spinübertragung bei 1.000 × g für 60 min ein 37 ° C. Auszupacken , die Platten und Inkubieren Zellen bei 37 ° C und 5% CO 2 über Nacht (etwa 24 h).
12. Zugabe von frischem Ergänzte DMEM (Tag 3)
- Nach 24 Stunden die Top 2 ml Medium aus jeder Vertiefung der Sechs-Well-Platte entfernen Sie die Knochenmarkzellen, wie in Schritt 11.2 enthält. Ersetzen Sie die entfernt Medien mit frischem DMEM 20% (vol / vol) FBS mit Endkonzentrationen von IL-3 (20 g ml -1), IL-6 (50 g ml -1) und SCF (50 g ml -1) .
- Inkubieren KnochenmarkPlatten bei 37 ° C CO 2 Inkubator für weitere 24 hr.
13. Ernte transduzierten Knochenmark (Tag 4)
- Nach 24 Stunden, sammeln die Knochenmarkszellen aus den Sechs-Well-Platten. Waschen Sie die Platten kräftig mit PBS alle nicht-adhärente Zellen zu entfernen.
- Zentrifugieren der Zellen bei 300 xg für 10 min bei 4 ° C und dekantiert den Überstand.
- Resuspendieren des Knochenmarks in einem kleinen Volumen (1 ml) PBS + 0,5% (vol / vol) hitzeinaktiviertem FBS. Halten Sie Zellen auf Eis.
- Nehmen Sie eine 10-ul-Probe jeder Knochenmark Zustand und zählen Sie die Zellen, die eine Neubauer-Zählkammer verwendet wird. Unter der Annahme , 1 - mindestens 4 x 10 6 Zellen zu übertragen pro Empfängermaus 2 - Donor pro Empfänger, wird die Ausbeute ausreichend sein. Resuspendieren des Knochenmarks in einem ausreichenden Volumen von PBS + 0,5% (vol / vol) hitzeinaktiviertem FBS 200 einzuspritzen - 300 & mgr; l pro Maus.
- Injizieren mindestens 2 x 10 6 Zellen mit einer Transduktionseffizienz(injizieren bis zu 8 x10 6 Zellen) pro Maus intravenös von 25%.
HINWEIS: Es wird routinemßig fünf Empfängermäuse injizieren pro zwei Platten mit 6 Vertiefungen von Knochenmarkszellen. Wenn die Ausbeute wesentlich geringer, mehr Donormäusen ist, sollte bis kann eine ausreichende Knochenmark verwendet werden Zahl erhalten werden. Um eine optimale Wiederherstellung zu erreichen, von mindestens 5 x 10 5 transduzierte (fluoreszierend positive) sollte in jedem Empfänger injiziert werden.
- Injizieren mindestens 2 x 10 6 Zellen mit einer Transduktionseffizienz(injizieren bis zu 8 x10 6 Zellen) pro Maus intravenös von 25%.
- Mit einem Mikro - Pipette, nehmen Sie eine 10-ul - Probe von jeder Bedingung Knochenmark und Transduktionseffizienz durch Fluss analysieren Zytometrie basierend auf der Expression des fluoreszierenden Marker (Abbildung 1A) 11.
HINWEIS: In der Regel ist der Anteil der Fluoreszenz-positiven Zellen liegt zwischen 25% und 70%, abhängig von dem Konstrukt und retrovirale Titer. Die Zahl der transduzierten Knochenmarkzellen erforderlich a subletal bestrahlen Maus zu rekonstituieren kann abhängig von der Transduktionseffizienz variieren. Je niedriger die transduction Effizienz, benötigt die mehr Knochenmarkzellen und umgekehrt, je höher die Knochenmark Transduktionseffizienz, die geringere Anzahl von Zellen für die Rekonstitution benötigt. Transduktionseffizienz unter 25% ist suboptimal und kann zu einer unzureichenden Rekonstitution und Überleben führen. Um eine optimale Knochenmark Erholung und Transduktionseffizienz zu gewährleisten, verwenden Sie frisch zubereitete Gewebekulturmedien und Zytokinen. Wenn ein neues TCR Expression des retrogenic System verwendet wird , ist die Auswahl des TCR in vivo unbekannt. In Abhängigkeit von jedem einzelnen TCR - Affinität, TCR Selektion im Thymus und peripheren T - Zell - Expression wird 17 variieren.
14. Maus-Bestrahlung, Knochenmark-Injection und Pflege
- Bestrahlen Mäuse am Tag vor der Knochenmark-Injektion (am selben Tag wie Schritt 13). Verwenden Sie die folgenden Dosen: C57BL / 6 - Mäuse (und andere Wildtyp - Stämme), 900 rads; Rag1 - / - Mäuse, 500 Rad; SCID - Mäuse, 300 rad).
- Platz Empfängermäuse auf Amoxicillin (50 mg / kg / Tag) oder ein anderes Antibiotikum Wasserbehandlung vor der Bestrahlung, und halten Sie auf Antibiotika für die ersten zwei Wochen nach der Knochenmark-Injektion.
HINWEIS: Die optimale Bestrahlungsdosis kann empirisch bestimmt werden müssen.
- Platz Empfängermäuse auf Amoxicillin (50 mg / kg / Tag) oder ein anderes Antibiotikum Wasserbehandlung vor der Bestrahlung, und halten Sie auf Antibiotika für die ersten zwei Wochen nach der Knochenmark-Injektion.
- Für die Injektion laden die Zellen aus Schritt 13.1 in eine 1-ml-Spritze mit stumpfen Nadeln unmittelbar vor der Injektion, dann Injektion die Nadel 27er ändern, zu vertreiben jegliche Luft Luftembolie zu vermeiden. Wärme Mäuse unter einer Wärmelampe und 0,2 ml Knochenmark pro Maus intravenös injiziert.
HINWEIS: Lassen Sie sich nicht Zellen in der Spritze für längere Zeit oder die Zellen absetzen sitzen. - Überwachen Sie die Mäuse wöchentlich, um sicherzustellen, dass sie gesund bleiben.
- Nach 5 - 6 Wochen, bluten die Mäuse zur Rekonstitution auf der Grundlage von GFP zu überprüfen + / ametrine + und TCR Co-Expression (Abbildung 1B) 11.
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Representative Results
Knochenmark Transduktionseffizienz bei Schritt 13.3 des Protokolls überprüft , bevor das Knochenmark in Schwanzvene iv In der repräsentativen bone marrow Transduktion Figur (1A) eingespritzt wird, ungefähr 10 & mgr; l der geernteten Knochenmark wurden zu 100-ul PBS und für ametrine Expression analysiert. Im allgemeinen der Prozentsatz der fluoreszierenden positiven Zellen liegt zwischen 25% und 70%, abhängig von dem Konstrukt und retrovirale Titer. Nach 6 Wochen Knochenmark - Injektion werden die Mäuse ausgeblutet bone marrow Rekonstitution (1B) zu bestimmen. Etwa 25 & mgr; l der peripheren Blut wurde von roten Blutkörperchen lysiert und mit anti-TCR & bgr;. In 2B alle TCR - positiven Zellen concordantly das Protein ametrine Fluoreszenz auszudrücken.
FiguRe 1. Beispiel für Knochenmark Transduction and Peripheral TCR Retrogenic T - Zellen. A) Transduktionseffizienz von Knochenmarkzellen auf der Fluoreszenzmarker (ametrine) am Tag der Knochenmarkübertragung analysiert basiert. Ungefähr 10 ul Knochenmark geerntet wurden zu 100 ul PBS zugegeben und ametrine Expression analysiert. Eine erfolgreiche Knochenmarkübertragung einen Prozentsatz von fluoreszierenden positiven Zellen zwischen 25% Ausbeute und 70%. B) Beispiel für TCR retrogenic T - Zellen im peripheren Blut 6 Wochen Knochenmark Rekonstitution stellen. Peripheres Blut wurde erhalten und die roten Blutkörperchen wurden mit RBC-Lyse-Puffer lysiert. Die verbleibenden Zellen wurden TCR & bgr; gefärbt. Repräsentative Analyse für ametrine Expression und anti-TCR & bgr; Anfärben 6 Wochen Knochenmark Rekonstitution schreiben. Bitte hier klicken , um eine größere Version von t anzuzeigenseine Figur.
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Discussion
In dem Protokoll wir ausführlich einige kritische Schritte optimale Knochenmark Gesundheit, Transduktionseffizienz und Rekonstitution zu gewährleisten. Erster wichtiger Schritt ist die Erzeugung und die ordnungsgemäße Wartung der GP + E86 Virusproduzentenzellen. Verwenden frühen Passage Produktionszelllinien und halten bei 80% Konfluenz oder niedriger vor der Verwendung. Wenn frisch machen viralen Produzentenzellen GP + E86, sicherzustellen, sind die 293T-Zellen frühen Passage und wachsen in der Kultur für 24 bis 48 Stunden. Plattieren zu viele GP + E86-Zellen während des Übertragungsschritt wird Virustiter senken. Bestimmen Virustiter wie in Holst et al. 11 beschrieben GP + E86 sind robust viral Hersteller sicherzustellen. Zusätzlich verbessert die Entfernung der roten Blutkörperchen aus der geernteten Knochenmarks Transduktionseffizienz. die Gesundheit der Knochenmark-Vorläufern zu gewährleisten ist für den Erfolg des Protokolls kritisch. Zu diesem Zweck verwenden Sie immer frische Medien (weniger als 4 Wochen bei 4 ° C, nachdem sie mit FCS ergänzt) und frische Zytokine (wenigerals 2 Wochen bei 4 ° C) gehalten. Hexadimethrinbromid ist auch empfindlich gegenüber Abbau und sollte frisch gemacht werden, wenn es in Lösung ist, alle 2 Monate. Weitere Details, die eine optimale Knochenmark Gesundheit sorgen und Übertragung umfassen Vorwärmen der Zentrifuge vor der Spinübertragung. Spin-Transduktion bei 37 ° C und wickeln Platten mit Plastikfolie Gasaustausch so weit wie möglich zu verringern. Auch lassen nicht das Knochenmark außerhalb des 37 ° C-Inkubator sitzen oder auf Eis für längere Zeit, da dies Zelltod erhöhen und Knochenmark-Transduktion und Rekonstitution zu verringern. Nachdem die Knochenmarkzellen an Tag 4 (Schritt 13) geerntet wurden, laden nur die Spritzen unmittelbar vor der Mäuse injiziert wird. Schließlich gewährleisten, dass Mäuse auf Antibiotika am Tag vor oder am Tag der Bestrahlung platziert sind.
Die Verwendung dieses Übertragungsprotokoll ermöglicht die Transduktion von Knochenmarksvorläuferzellen retroviralen vermittelt, was zudie Erzeugung von T-Zell-Rezeptor retrogenic Mäusen. Retrogenic Mäuse sind schneller zu generieren als TCR-transgenen Mäusen und Kosten deutlich weniger als ein einziges TCR transgenen erzeugen. Allerdings können retrogenic Mäuse nicht gezüchtet und müssen neu 10 mit jedem Experiment erzeugt werden. Die Anzahl der peripheren T - Zellen niedriger in retrogenic Mäusen als in TCR - transgenen Mäusen gesehen jedoch die Regulation des TCR ist vergleichbar zwischen TCR retrogenic und TCR Transgene 10. Der TCR retrogenic System ermöglicht die Expression mehrerer TCRs innerhalb derselben Kolonie und sogar innerhalb des gleichen Experiments. das TCR retrogenic Protokoll hier ermöglicht einen Ermittler beschrieben Unter Verwendung der Entwicklung und Funktionalität zahlreicher neu identifizierte MHC-Klasse-I oder II beschränkt TZR zu testen und zu screenen. Mit der Entwicklung der "humanisierten Maus" Modell 18,19 könnte der TCR retrogenic weiter ausgebaut werden geklonten menschlichen TCRs verwendet. Darüber hinaus verknüpft die 2A Konstrukte cein ebenfalls zu studieren andere Multi-Proteinen verwendet werden , einschließlich der CD3 - Ketten, Interleukine und chimären Antigenrezeptoren 20-24.
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Disclosures
Keine Interessenkonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus NIH (5K22A1119151-01 und 1R56DK104903-01) zu MLB, Pilot / Machbarkeits Programm des Diabetes Research Center (P30-DK079638) bei BCM, JDRF 1-FAC-2014-243-AN APF, ADA unterstützt 1-15-JF-07, AAI Karriere in Immunology Fellowship MB und The Robert und Janice McNair-Stiftung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM, high glucose + glutamine | Corning Cellgro | 10-013-CV | Dulbecco's Modification of Eagle's Medium with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate |
| FBS | Atlanta Biological | S11550 | |
| Trypsin-Versene | Lonza | 17-161F | |
| 0.45 µm syringe filter | Thermo Scientific | 194-2545 | |
| polybrene | Sigma | H9268-10G | Sterile Filtered in dH2O |
| Ciprofloxacin | VWR | AAJ61970-06 | |
| 5-fluorouracil (5-FU) | VWR | AAA13456-06 | |
| Sodium Pyruvate | Corning Cellgro | 25-000-CI | |
| MEM nonessential Amino Acids | Corning Cellgro | 25-025-CI | |
| HEPES 1 M solution | Corning Cellgro | 25-060-CI | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco by Life Technologies | 21985-023 | |
| Pen/Strept | Corning Cellgro | 30-002-CI | |
| L-glutamine | Corning Cellgro | 25-005-CI | |
| 150 mm tissue culture dishes | Greiner Bio-one | 639160 | |
| Tisue culture-treated 6-well flat plate | Greiner Bio-one | 657160 | |
| 70 µm nylon cell strainers | Falcon | 352350 | |
| Mouse IL-3 | Invitrogen | PMC0033 | |
| Human IL-6 | Invitrogen | PHC0063 | |
| Mouse Stem Cell Factor | Invitrogen | PMC2113L | |
| 10x PBS | Corning Cellgro | 46-D13-CM | |
| HANKS Buffer | Corning Cellgro | 21020147 | |
| BD 10 ml Syringe | BD | 300912 | |
| BD 1 ml Syringe | BD | 309659 | |
| 27 G x 1/2 BD Precision Glide Needle | BD | 305109 | |
| 30 G x 1/2 BD Precision Glide Needle | BD | 305106 |
References
- Qi, Q., et al. Diversity and clonal selection in the human T-cell repertoire. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 13139-13144 (2014).
- Zarnitsyna, V. I., Evavold, B. D., Schoettle, L. N., Blattman, J. N., Antia, R. Estimating the diversity, completeness, and cross-reactivity of the T cell repertoire. Frontiers in immunology. 4, 485 (2013).
- Kisielow, P., Bluthmann, H., Staerz, U. D., Steinmetz, M., von Boehmer, H. Tolerance in T-cell-receptor transgenic mice involves deletion of nonmature CD4+8+ thymocytes. Nature. 333, 742-746 (1988).
- Hogquist, K. A., et al. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76, 17-27 (1994).
- Verdaguer, J., et al. Spontaneous autoimmune diabetes in monoclonal T cell nonobese diabetic mice. J Exp Med. 186, 1663-1676 (1997).
- Katz, J. D., Wang, B., Haskins, K., Benoist, C., Mathis, D. Following a diabetogenic T cell from genesis through pathogenesis. Cell. 74, 1089-1100 (1993).
- Pauza, M. E., et al. T-cell receptor transgenic response to an endogenous polymorphic autoantigen determines susceptibility to diabetes. Diabetes. 53, 978-988 (2004).
- Jasinski, J. M., et al. Transgenic insulin (B:9-23) T-cell receptor mice develop autoimmune diabetes dependent upon RAG genotype, H-2g7 homozygosity, and insulin 2 gene knockout. Diabetes. 55, 1978-1984 (2006).
- Kersh, G. J., et al. TCR transgenic mice in which usage of transgenic alpha- and beta-chains is highly dependent on the level of selecting ligand. Journal of immunology. 161, 585-593 (1998).
- Bettini, M. L., Bettini, M., Vignali, D. A. TCR retrogenic mice: A rapid, flexible alternative to TCR transgenic mice. Immunology. 136 (3), 265-272 (2012).
- Holst, J., et al. Generation of T-cell receptor retrogenic mice. Nat Protoc. 1, 406-417 (2006).
- Holst, J., Vignali, K. M., Burton, A. R., Vignali, D. A. Rapid analysis of T-cell selection in vivo using T cell-receptor retrogenic mice. Nat Methods. 3, 191-197 (2006).
- Bettini, M. L., Bettini, M., Nakayama, M., Guy, C. S., Vignali, D. A. Generation of T cell receptor-retrogenic mice: improved retroviral-mediated stem cell gene transfer. Nat Protoc. 8, 1837-1840 (2013).
- Donnelly, M. L., et al. Analysis of the aphthovirus 2A/2B polyprotein 'cleavage' mechanism indicates not a proteolytic reaction, but a novel translational effect: a putative ribosomal 'skip'. J Gen Virol. 82, 1013-1025 (2001).
- Atkins, J. F., et al. A case for "StopGo": reprogramming translation to augment codon meaning of GGN by promoting unconventional termination (Stop) after addition of glycine and then allowing continued translation (Go). RNA. 13, 803-810 (2007).
- Doronina, V. A., et al. Site-specific release of nascent chains from ribosomes at a sense codon. Mol Cell Biol. 28, 4227-4239 (2008).
- Bettini, M., et al. TCR affinity and tolerance mechanisms converge to shape T cell diabetogenic potential. Journal of immunology. 193, 571-579 (2014).
- Brehm, M. A., Wiles, M. V., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Generation of improved humanized mouse models for human infectious diseases. J Immunol Methods. 410, 3-17 (2014).
- Brehm, M. A., Shultz, L. D., Greiner, D. L. Humanized mouse models to study human diseases. Curr Opin Endocrinol Diabetes Obes. 17, 120-125 (2010).
- Chaplin, P. J., et al. Production of interleukin-12 as a self-processing 2A polypeptide. J Interferon Cytokine Res. 19, 235-241 (1999).
- Collison, L. W., et al. The inhibitory cytokine IL-35 contributes to regulatory T-cell function. Nature. 450, 566-569 (2007).
- Holst, J., et al. Scalable signaling mediated by T cell antigen receptor-CD3 ITAMs ensures effective negative selection and prevents autoimmunity. Nature immunology. 9, 658-666 (2008).
- Kalos, M., et al. T cells with chimeric antigen receptors have potent antitumor effects and can establish memory in patients with advanced leukemia. Sci Transl Med. 3, 95ra73 (2011).
- VanSeggelen, H., et al. T Cells Engineered With Chimeric Antigen Receptors Targeting NKG2D Ligands Display Lethal Toxicity in Mice. Mol Ther. 23, 1600-1610 (2015).
