Introduction
Recettore delle cellule T (TCR) repertorio di esseri umani e topi è stato stimato a 1 x 10 8 e 2 x 10 6 TCR unici rispettivamente 1,2. Questa grande diversità permette cellule T di riconoscere una vasta gamma di epitopi antigenici derivati da auto-peptidi e da agenti patogeni presentati dal complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) sulle cellule presentanti l'antigene (APC). Le sottili differenze nelle interazioni dei TCR con unici complessi peptide-MHC determinano se una cellula T subirà apoptosi, anergia, l'attivazione, la differenziazione, la produzione di citochine e citotossicità. Tuttavia, a causa della grande repertorio TCR, analisi di come una determinata TCR risponderà a un particolare antigene richiede l'utilizzo di sistemi singoli TCR.
Vari topi transgenici TCR sono state generate per studiare la funzione di un singolo TCR in un modello in vivo 3-9. Tuttavia, ci sono avvertimenti di TCR topi transgenici compresa lacosto, la lunghezza di tempo per generare un singolo topo transgenico e il cosiddetto effetto fondatore di inserimento transgene casuale nel DNA germinale 10. Pertanto, relativamente pochi topi transgenici TCR sono stati generati per un dato antigene e le implicazioni funzionali di alta e bassa affinità TCR per lo stesso epitopo sono raramente affrontati. Per affrontare la necessità di un avvicinamento rapido alla schermata e studiare più TCR singolarmente o in combinazione, topi retrogenic ( 'retro' da retrovirus e 'geniche' dal transgenici) sono stati utilizzati come alternativa al TCR topi transgenici 11-13.
Il motivo di consenso 2A peptide trovato all'interno di diversi virus sono costituiti da un 2A-Asp-Val / Ile-Glut-X-Asn-Pro-Gly-2B-Pro, in cui scissione avviene tra la glicina del 2A e prolina del 2B da cis -acting attività idrolasi, con conseguente salto ribosomiale durante la traduzione 10,14-16. Per uno schema dettagliato raffigurante la cleavage dei vari peptidi 2A (F2A, E2A, T2A e P2A) consultare i riferimenti 10 - 12. In questo modo, 2 cistroni (TCR alfa e beta TCR) possono essere collegati con conseguente traduzione stechiometrica in un singolo vettore. Utilizzando questo approccio, siamo in grado di esprimere e confrontare direttamente più TCR specifici antigeni in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etica Dichiarazione: Ogni sforzo è fatto per mantenere il disagio degli animali o di stress al minimo durante l'irradiazione e la coda vena iniezioni. I topi sono utilizzati come fonte di cellule in questi esperimenti; in quanto tale, non ci sono procedure o manipolazioni a parte l'eutanasia. I topi saranno sacrificati da CO 2 inalazione seguita da dislocazione cervicale per confermare la morte. Questa procedura è coerente con le raccomandazioni del gruppo sull'eutanasia della American Veterinary Medical Association.
1. Preparare retrovirale Construct
- Sotto-clone catene del recettore delle cellule T (TCR) alfa e beta, separati da un linker 2A, in un MSCV basata retrovirale 11 vettore (ad esempio, pMIAII o pMIGII) 11.
NOTA: Il linker 2A permette di espressione stechiometrica e concorde delle catene alfa e beta TCR da un singolo fotogramma open reading. Il vettore comprende una cassetta IRES fluorescent proteina (ametrine o GFP) che viene utilizzato permonitorare le cellule trasdotte e efficienza di trasduzione. Per un protocollo dettagliato si rimanda Holst et al. 11 - Isolare plasmidi DNA utilizzando commercialmente ottenuto kit di preparazione al plasma o un prodotto simile. Utilizzare una concentrazione di lavoro di 1 - 2 mg ml -1.
2. Generazione di retrovirali produttrice di celle Lines
- Utilizzare un processo in due fasi per produrre linee cellulari produttore retrovirali.
NOTA: Per un protocollo dettagliato, si prega di consultare Holst et al 11..- Genera retrovirus per trasfezione transiente di cellule 293T con tre plasmidi (pVSVG, PEQ-Pam3 (-E) e vettore di interessi 11) e prendere il surnatante retrovirale dalle cellule 293T di trasdurre la ecotropic linea cellulare produttore retrovirale GP + E86.
- Isolare i primi 40% delle cellule che esprimono produttori fluorescenti GP + E86 da FACS e propagare le cellule produttrici + E86-GP transdcuced come fonte di virus.
NOTA: La generazionedi produttori di alto titolo è fondamentale per un efficiente trasduzione di cellule del midollo osseo. Per un protocollo completo si prega di consultare Holst et al. 11
3. Retrovirus-mediata Stem Cell Gene Transfer (Giorno -5)
- Scongelare e cultura 0.5 -1.0 x 10 6 di ciascuna linea cellulare produttore GP + E86 in completo DMEM 10% (vol / vol) FBS per consentire una crescita sufficiente per due confluenti piastre da 150 mm per giorno 0 di questo protocollo.
NOTA: Scongelamento 0,5-1,0 x 10 6 di ciascuna linea cellulare produttore GP + E86 in un piatto 10 centimetri consentirà di 30 - 50% di confluenza in occasione della Giornata 5. Ciò consente anche di 5 giorni di coltura al fine di espandere il GP + E86 linee cellulari di produttori alle due piastre confluenti 150 mm per giorno 0.- Cultura linea cellulare produttore retrovirale nei media completa coltura tissutale contenente il 5% di siero di vitello feta, e la ciprofloxacina (10 mg / ml) per evitare la contaminazione da micoplasma.
NOTA: Interrompere l'uso della ciprofloxacina quando generating il surnatante virale per la trasduzione del midollo osseo. Evitare un eccesso di crescita della linea cellulare produttore, in quanto questo avrà un impatto negativo del midollo osseo efficienza di trasduzione.
- Cultura linea cellulare produttore retrovirale nei media completa coltura tissutale contenente il 5% di siero di vitello feta, e la ciprofloxacina (10 mg / ml) per evitare la contaminazione da micoplasma.
4. I topi donatori Iniettare con 5-fluorouracile (5-FU) (Giorno -3)
- Pesare il topo donatore (5 - 12 settimane) per determinare la quantità di 5-FU richiesto. Utilizzando topi di età inferiore a 5 settimane di risultati d'età in bassa resa del midollo osseo. Per garantire l'espressione di un singolo TCR, utilizzare un ceppo di topi carenti di cellule T, come SCID, straccio o TCR alfa topi deficienti come donatori di midollo osseo.
- Lavorando in cappa coltura tissutale, diluire il magazzino 5-FU con PBS sterile per fare una sufficiente quantità di 10 mg ml -1 soluzione di lavoro di 5-FU per fornire 0,15 mg 5-FU per grammo di peso corporeo.
- Usando una siringa da 1 ml con un ago 37 G, intraperitoneale iniettare 0,15 mg 5-FU per grammo di peso corporeo per topo donatore.
NOTA: Usa il mouse 1 donatore per un destinatario per avviare e regolareil numero di topi donatori secondo il rendimento cella. Un metodo alternativo per il trattamento 5-FU per l'arricchimento e l'isolamento di progenitori midollari è selezione negativa di cellule positive lineage come descritto in Viret et al.
5. Bone Marrow Procedura di estrazione (giorno 0)
- Ottenere forbici dissezione e pinze per l'isolamento delle ossa. Preparare supporti (HBSS integrata con 5% FCS (vol / vol)) per raccogliere le ossa in un tubo conico da 50 ml. Mantenere 50 ml conica contenente media su ghiaccio. Euthanize topi da CO 2 inalazione seguita da dislocazione cervicale per confermare la morte. Pinch zampa al fine di garantire non vengono rilevati riflessi.
- Sterilizzare il sito chirurgico e strumenti chirurgici con etanolo o metanolo. Rimuovere il femore, tibia, omero, e cingolo pelvico con cura dal primo taglio e sotto la cintura pelvica. Tagliare lungo il femore alla tibia. Rimuovere tutti i tessuti circostanti con le forbici e pinze per ottenere ossa pulite. Tenereossa idratata in HBSS + 5% (vol / vol) FBS.
- Separare le ossa tagliando a livello delle articolazioni, avendo cura di tagliare entrambe le estremità fuori di ogni osso. Inserire un ago 25-gauge collegato a una siringa da 10 ml contenente HBSS + 5% (vol / vol) FBS. Applicare una pressione e lavare tutto il midollo osseo attraverso un 70-micron filtro di riposo in una conica da 50 ml.
- Periodicamente, spingere il midollo osseo attraverso il filtro 70 micron utilizzando lo stantuffo di una siringa da 1 ml e 3 ml. Risciacquare il filtro con HBSS + 5% (vol / vol) FBS. Ciò garantirà una sospensione singola cella che è libero di frammenti ossei e dei tessuti. Mantenere le cellule sterili eseguendo la procedura in una cappa sterile.
- cellule del midollo osseo centrifugare a 300 xg per 10 min a 4 ° C.
6. midollo osseo Cultura (Giorno 0)
- supporti Decantare o aspirare e pellet cellulare risospendere in 1 ml di ammonio tampone a base di cloruro di lisi dei globuli rossi (RBC o tampone di lisi equivalente) per tubo da 50 ml. Dopo 1 min di incubazione a cameratemperatura, spegnere il tampone di lisi dei globuli rossi aggiungendo 10 ml di DMEM completo 20% (vol / vol) FBS.
- cellule centrifugare a 300 xg per 10 minuti a 4 ° C.
- Decantare o aspirare il surnatante e risospendere midollo osseo in 5 ml completo DMEM 20% (vol / vol) FBS. Contare le cellule con una camera di conta Neubauer.
NOTA: la resa generale dovrebbe essere di circa 5 - 10 x 10 6 cellule per il mouse; Tuttavia, la resa può variare tra i diversi ceppi di topi. - Piatto cellule del midollo osseo con una densità di 4 x 10 7 cellule per piastra da 150 mm in 30 ml di DMEM completo 20% (vol / vol) supplementato con FBS IL-3 (20 g ml -1), IL-6 (50 g ml -1) e SCF (50 g ml -1).
NOTA: utilizzare citochine appena scongelati-aliquotati. Non utilizzare citochine che sono stati congelati e scongelati più di una o conservati a 4 ° C per più di 2 settimane. - Incubare midollo osseo durante la notte (circa 24 ore) a 37 ° C con 5% di CO 2.
- Piastra 3 x 10 cellule produttrici 6 retrovirali per piastra da 150 mm in 18 ml completo DMEM 20% (vol / vol) FBS.
- Incubare cellule produttrici retrovirali a 37 ° C durante la notte. Anticipare una piastra da 150 mm per 15 milioni di cellule del midollo osseo (circa 2 - 3 topi donatore).
8. Retroviral Surnatante (1 ° giorno)
- Il giorno successivo (circa 24 ore più tardi), raccogliere il surnatante retrovirale dalle piastre di produttori (istituito nel passo 7) elaborando il surnatante retrovirale direttamente fuori della piastra di 150 mm con una siringa da 10 ml e filtro con un 0,45 Filtro siringa -μm.
- Ricollocare accuratamente il surnatante retrovirale rimosso con 18 ml di DMEM fresco completa al 20% (vol / vol) FBS.
- Supplemento il surnatante retrovirale filtrata con IL-3 (20 g ml -1), IL-6 (50 g ml -1), MSCF (50 g ml -1) e Hexadimethrine bromuro (Polybrene) (6 &# 956; g ml -1).
NOTA: Hexadimethrine bromuro deve essere fatta fresca ogni 2 mesi per evitare un calo di efficacia di trasduzione retrovirale.
9. midollo osseo Harvest (1 ° giorno)
- Dopo aver completato la fase 8.3, raccogliere le cellule del midollo osseo a partire dal punto 6.4 e trasferire i supporti contenenti le cellule non aderenti in sterili tubi da 50 ml.
- Lavare le piastre vigorosamente con 10 ml di PBS e raccogliere nel conica da 50 ml a partire dal punto 9.1. Se necessario, ripetere la fase di lavaggio.
- Centrifugare le cellule a 300 xg per 10 minuti a 4 ° C, decantare il surnatante, risospendere le cellule in un piccolo volume (1 - 3 ml) completo DMEM 20% (vol / vol) FBS, e contano. Prevedere 50 - recupero 75% dal giorno 0. Risospendere midollo osseo a 1 x 10 6 cellule per 1 ml di surnatante retrovirale contenente citochine e Hexadimethrine bromuro.
10. midollo osseo trasduzione (1 ° giorno)
- Piatto il retrovirale surnatante ma / ossomiscela rrow ad un volume di 3 ml per pozzetto in una piastra di coltura tissutale sei pozzetti. Avvolgere le piastre in involucro di plastica per ridurre al minimo lo scambio di gas durante la centrifugazione al punto 10.2.
- Spin le piastre a sei pozzetti avvolti a 1000 xg per 60 min a 37 ° C.
- Dopo lo spin, rimuovere la pellicola trasparente e mettere le piastre in un incubatore a 37 ° C di CO 2 per 24 ore.
11. retrovirale surnatante e trasduzione (2 ° giorno)
- Dopo 24 ore, raccogliere il surnatante virale fresco dalla linea cellulare produttore virale. Filtrare il surnatante retrovirale utilizzando una siringa da 10 ml e un filtro a siringa da 0,45 micron. Supplemento surnatante filtrato retrovirale con IL-3 (20 g ml -1), IL-6 (50 g ml -1) e SCF (50 g ml -1) e Hexadimethrine bromuro (6 g ml -1).
- Quindi, rimuovere delicatamente con pipetta o aspirare i primi 2 ml di media da ciascun pozzetto della piastra di sei pozzetti contenenti le cellule del midollo osseo.
NOTA: Work attenzione a non aspirare il midollo osseo, che di solito è concentrata nel centro del pozzo. In alternativa, il surnatante eliminato può essere centrifugata per recuperare eventuali cellule del midollo osseo persi. - Per ogni bene nel midollo osseo 6 pozzetti aggiungere 3 ml di surnatante contenente citochine virali freschi e Hexadimethrine bromuro. Avvolgere le piastre in plastica, e ripetere la trasduzione centrifugare a 1000 xg per 60 min a 37 ° C. Scartare le piastre e incubare le cellule a 37 ° C e 5% CO 2 durante la notte (circa 24 ore).
12. L'aggiunta di fresco Integrata DMEM (3 ° giorno)
- Dopo 24 ore, rimuovere la parte superiore 2 ml di media da ciascun pozzetto della piastra di sei pozzetti contenenti le cellule del midollo osseo, come al punto 11.2. Sostituire il supporto rimosso con DMEM fresco 20% (vol / vol) FBS supplementato con concentrazioni finali di IL-3 (20 g ml -1), IL-6 (50 g ml -1) e SCF (50 g ml -1) .
- Incubare midollo osseopiastre a 37 ° C CO 2 incubatore per un altro 24 ore.
13. Harvest trasduzione del midollo osseo (4 ° giorno)
- Dopo 24 ore, raccogliere le cellule del midollo osseo dalle piastre a sei pozzetti. Lavare le piastre energicamente con PBS per rimuovere tutte le cellule non aderenti.
- Centrifugare le cellule a 300 xg per 10 min a 4 ° C e decantare il surnatante.
- Risospendere il midollo osseo in un piccolo volume (1 ml) di PBS + 0,5% (vol / vol) inattivato al calore FBS. Mantenere le cellule in ghiaccio.
- Prelevare un campione di 10 ml di ogni condizione di midollo osseo e contare le cellule utilizzando una camera di conta Neubauer. Supponendo 1 - 2 donatore al ricevente, il rendimento sarà sufficiente a trasferire almeno 4 x 10 6 cellule per topo ricevente. Risospendere il midollo osseo in un sufficiente volume di PBS + 0,5% (vol / vol) inattivato al calore FBS per iniettare 200 - 300 ml per topo.
- Iniettare almeno 2 x 10 6 cellule con una efficienza di trasduzionedel 25% (può iniettare fino a 8 x10 6 celle) per topo per via endovenosa.
NOTA: Noi abitualmente iniettare cinque topi riceventi per due 6 pozzetti di cellule del midollo osseo. Se la resa è notevolmente inferiore, più topi donatori devono essere utilizzati fino a quando è possibile ottenere il numero di midollo osseo sufficiente. Al fine di raggiungere ricostituzione ottimale, almeno 5 x 10 5 trasdotte (fluorescente positiva) deve essere iniettato in ciascun destinatario.
- Iniettare almeno 2 x 10 6 cellule con una efficienza di trasduzionedel 25% (può iniettare fino a 8 x10 6 celle) per topo per via endovenosa.
- Con una micro pipetta, prelevare un campione di 10 ml di ogni condizione di midollo osseo e di analizzare l'efficienza di trasduzione mediante citometria a flusso basato sulla espressione del marcatore fluorescente (Figura 1A) 11.
NOTA: in generale, la percentuale di cellule positive fluorescenti è tra il 25% e il 70%, a seconda del costrutto e titolo retrovirale. Il numero di cellule del midollo osseo trasdotte necessario ricostituire un mouse sub-letale irradiate può variare a seconda della efficienza di trasduzione. Più basso è il tranefficienza sduction, le cellule del midollo più ossee richiesto e viceversa, maggiore è l'efficienza di trasduzione midollo osseo, il minor numero di cellule nella ricostituzione. efficienza di trasduzione di sotto del 25% è ottimale e può provocare la ricostituzione e la sopravvivenza insufficiente. Al fine di garantire il recupero del midollo osseo ottimale e l'efficienza di trasduzione, utilizzare i media e citochine coltura di tessuti preparati al momento. Quando esprimere una nuova TCR utilizzando il sistema retrogenic, la selezione di tale TCR in vivo è sconosciuta. A seconda ogni singolo affinità TCR, selezione TCR nel timo e di espressione di cellule T periferico varierà 17.
14. mouse irradiazione, midollo osseo iniezione e cura
- Irradiare topi il giorno prima dell'iniezione di midollo osseo (stesso giorno Fase 13). Utilizzare i seguenti dosaggi: C57BL / 6 topi (e altri ceppi wild type), 900 rad; RAG1 - / - mice, 500 RADS; topi SCID, 300 RADS).
- topi Luogo destinatario sul amoxicillina (50 mg / kg / giorno) o un altro trattamento dell'acqua antibiotico prima dell'irraggiamento, e mantenere antibiotici per le prime due settimane dopo l'iniezione di midollo osseo.
NOTA: la dose di irradiazione ottimale può essere determinato empiricamente.
- topi Luogo destinatario sul amoxicillina (50 mg / kg / giorno) o un altro trattamento dell'acqua antibiotico prima dell'irraggiamento, e mantenere antibiotici per le prime due settimane dopo l'iniezione di midollo osseo.
- Per l'iniezione, caricare le cellule a partire dal punto 13.1 in una siringa da 1 ml con aghi smussati immediatamente prima dell'iniezione, quindi cambiare l'ago 27-gauge per l'iniezione, espellere l'aria per evitare embolia gassosa. topi calore sotto una lampada riscaldante e iniettano 0,2 ml di midollo osseo per topo per via endovenosa.
NOTA: Non lasciate che le cellule si siedono nella siringa per un certo periodo di tempo o le cellule si accontentano. - Monitorare i topi settimanale per assicurarsi che rimangano in buona salute.
- Dopo 5 - 6 settimane sfiatare i topi per verificare ricostituzione sulla base di GFP + / + ametrine e co-espressione TCR (Figura 1B) 11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bone efficienza osseo trasduzione viene controllato nel passo 13.3 del protocollo prima del midollo osseo viene iniettato in vena della coda iv In rappresentante midollo osseo trasduzione figura (Figura 1A), circa 10 ml di midollo osseo raccolto è stato aggiunto a 100 ml di PBS e analizzate per l'espressione ametrino. Generalmente la percentuale di cellule positive fluorescenti è tra il 25% e il 70%, a seconda del costrutto e titolo retrovirale. Dopo 6 settimane iniezione midollo osseo, i topi vengono spurgati per determinare la ricostituzione del midollo osseo (Figura 1B). Circa 25 ml di sangue periferico è stato globuli rossi lisati e colorati con anti-TCRβ. Nella figura 2B tutte le cellule positive TCR concordemente esprimono la proteina fluorescente ametrino.
Figure 1. Esempio di cellule del midollo osseo di trasduzione e periferico TCR Retrogenic T. A) trasduzione efficienza delle cellule del midollo osseo viene analizzato sulla base del marcatore fluorescente (ametrino) il giorno del trasferimento del midollo osseo. Circa 10 ml di midollo osseo raccolto è stato aggiunto a 100 ml di PBS e analizzate per l'espressione ametrino. Un successo trasduzione midollo osseo produrrà una percentuale di cellule positive fluorescenti tra il 25% e il 70%. B) Esempio di cellule T retrogenic TCR nel sangue periferico 6 settimane dopo la ricostituzione del midollo osseo. Il sangue periferico è stata ottenuta e globuli rossi sono state lisate con tampone di lisi RBC. Le cellule rimanenti sono state colorate per TCRβ. Analisi Rappresentante per l'espressione Ametrino e anti-TCRβ colorazione 6 settimane dopo la ricostituzione del midollo osseo. Cliccate qui per vedere una versione più grande di tla sua figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nel protocollo, abbiamo dettaglio diversi passaggi critici per garantire la salute del midollo osseo ottimale, l'efficienza di trasduzione e la ricostituzione. Il primo passo fondamentale è la generazione e la corretta manutenzione delle cellule produttrici virale GP + E86. Utilizzare linee cellulari produttori di passaggio precoce e mantenere a 80% di confluenza o inferiore prima dell'uso. Quando si effettuano fresche cellule produttrici virale GP + E86, garantire le cellule 293T sono di passaggio precoce e in crescita in coltura per 24 - 48 ore. Placcatura troppe cellule GP + E86 durante la fase di trasduzione abbasserà titolo virale. Determinare titolo virale, come descritto nella Holst et al. 11 al fine di garantire GP + E86 sono robusti produttori virali. Inoltre, la rimozione dei globuli rossi dal midollo osseo raccolte migliora l'efficienza di trasduzione. Garantire la salute dei progenitori del midollo osseo è un fattore critico per il successo del protocollo. A tal fine, utilizzare sempre mezzi freschi (meno di 4 settimane a 4 ° C dopo integrato con FCS) e citochine freschi (menodi 2 settimane, conservato a 4 ° C). bromuro Hexadimethrine è anche sensibile alla degradazione e dovrebbe essere fatta fresca, una volta che è in soluzione, ogni 2 mesi. Altri dettagli che garantiranno la salute del midollo osseo ottimale e la trasduzione comprendono pre-riscaldamento della centrifuga prima della trasduzione di spin. Spin-trasdurre a 37 ° C e avvolgere piastre con pellicola trasparente per diminuire lo scambio di gas il più possibile. Inoltre, non lasciare che il midollo osseo sedersi fuori dell'incubatore 37 ° C o in ghiaccio per lunghi periodi di tempo come questo aumenterà la morte delle cellule e diminuire osso trasduzione osseo e la ricostituzione. Dopo che le cellule del midollo osseo sono state raccolte al 4 ° giorno (passo 13), caricare solo le siringhe immediatamente prima di iniettare i topi. Infine, assicurano che i topi sono immessi sul antibiotici il giorno prima o il giorno della irradiazione.
Utilizzo di questo retrovirale mediata protocollo trasduzione consente la trasduzione di cellule progenitrici del midollo osseo con conseguentela generazione di T del recettore delle cellule topi retrogenic. topi Retrogenic sono più veloci per generare di TCR topi transgenici e costo notevolmente inferiore a generare un singolo transgenico TCR. Tuttavia, i topi retrogenic non possono essere allevati e mosto generati nuovo con ogni esperimento 10. Il numero di cellule T periferiche sono più bassi nei topi retrogenic di quanto visto in TCR topi transgenici comunque la regolazione del TCR è paragonabile tra il TCR retrogenic e TCR transgenici 10. Il sistema retrogenic TCR permette l'espressione di molteplici TCR all'interno della stessa colonia e anche all'interno dello stesso esperimento. Utilizzando il protocollo retrogenic TCR qui descritto consente un investigatore per testare e schermare lo sviluppo e la funzionalità di numerosi MHC di classe di recente identificazione I o II TCR ristretti. Con lo sviluppo del modello "mouse umanizzato" 18,19, il retrogenic TCR potrebbe essere ulteriormente espansa utilizzando TCR umani clonati. Inoltre, la 2A collegato costrutti cun essere utilizzato anche per studiare altri multi-proteine, tra cui le catene CD3, interleuchine e recettori chimerici antigene 20-24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal NIH (5K22A1119151-01 e 1R56DK104903-01) per MLB, Pilot / fattibilità del programma del Diabetes Research Center (P30-DK079638) al BCM, JDRF 1-FAC-2014-243-AN APF, ADA 1-15-JF-07, Carriere AAI in Immunologia Fellowship a MB, e The Robert e Janice McNair Fondazione.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM, high glucose + glutamine | Corning Cellgro | 10-013-CV | Dulbecco's Modification of Eagle's Medium with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate |
| FBS | Atlanta Biological | S11550 | |
| Trypsin-Versene | Lonza | 17-161F | |
| 0.45 µm syringe filter | Thermo Scientific | 194-2545 | |
| polybrene | Sigma | H9268-10G | Sterile Filtered in dH2O |
| Ciprofloxacin | VWR | AAJ61970-06 | |
| 5-fluorouracil (5-FU) | VWR | AAA13456-06 | |
| Sodium Pyruvate | Corning Cellgro | 25-000-CI | |
| MEM nonessential Amino Acids | Corning Cellgro | 25-025-CI | |
| HEPES 1 M solution | Corning Cellgro | 25-060-CI | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco by Life Technologies | 21985-023 | |
| Pen/Strept | Corning Cellgro | 30-002-CI | |
| L-glutamine | Corning Cellgro | 25-005-CI | |
| 150 mm tissue culture dishes | Greiner Bio-one | 639160 | |
| Tisue culture-treated 6-well flat plate | Greiner Bio-one | 657160 | |
| 70 µm nylon cell strainers | Falcon | 352350 | |
| Mouse IL-3 | Invitrogen | PMC0033 | |
| Human IL-6 | Invitrogen | PHC0063 | |
| Mouse Stem Cell Factor | Invitrogen | PMC2113L | |
| 10x PBS | Corning Cellgro | 46-D13-CM | |
| HANKS Buffer | Corning Cellgro | 21020147 | |
| BD 10 ml Syringe | BD | 300912 | |
| BD 1 ml Syringe | BD | 309659 | |
| 27 G x 1/2 BD Precision Glide Needle | BD | 305109 | |
| 30 G x 1/2 BD Precision Glide Needle | BD | 305106 |
References
- Qi, Q., et al. Diversity and clonal selection in the human T-cell repertoire. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 13139-13144 (2014).
- Zarnitsyna, V. I., Evavold, B. D., Schoettle, L. N., Blattman, J. N., Antia, R. Estimating the diversity, completeness, and cross-reactivity of the T cell repertoire. Frontiers in immunology. 4, 485 (2013).
- Kisielow, P., Bluthmann, H., Staerz, U. D., Steinmetz, M., von Boehmer, H. Tolerance in T-cell-receptor transgenic mice involves deletion of nonmature CD4+8+ thymocytes. Nature. 333, 742-746 (1988).
- Hogquist, K. A., et al. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76, 17-27 (1994).
- Verdaguer, J., et al. Spontaneous autoimmune diabetes in monoclonal T cell nonobese diabetic mice. J Exp Med. 186, 1663-1676 (1997).
- Katz, J. D., Wang, B., Haskins, K., Benoist, C., Mathis, D. Following a diabetogenic T cell from genesis through pathogenesis. Cell. 74, 1089-1100 (1993).
- Pauza, M. E., et al. T-cell receptor transgenic response to an endogenous polymorphic autoantigen determines susceptibility to diabetes. Diabetes. 53, 978-988 (2004).
- Jasinski, J. M., et al. Transgenic insulin (B:9-23) T-cell receptor mice develop autoimmune diabetes dependent upon RAG genotype, H-2g7 homozygosity, and insulin 2 gene knockout. Diabetes. 55, 1978-1984 (2006).
- Kersh, G. J., et al. TCR transgenic mice in which usage of transgenic alpha- and beta-chains is highly dependent on the level of selecting ligand. Journal of immunology. 161, 585-593 (1998).
- Bettini, M. L., Bettini, M., Vignali, D. A. TCR retrogenic mice: A rapid, flexible alternative to TCR transgenic mice. Immunology. 136 (3), 265-272 (2012).
- Holst, J., et al. Generation of T-cell receptor retrogenic mice. Nat Protoc. 1, 406-417 (2006).
- Holst, J., Vignali, K. M., Burton, A. R., Vignali, D. A. Rapid analysis of T-cell selection in vivo using T cell-receptor retrogenic mice. Nat Methods. 3, 191-197 (2006).
- Bettini, M. L., Bettini, M., Nakayama, M., Guy, C. S., Vignali, D. A. Generation of T cell receptor-retrogenic mice: improved retroviral-mediated stem cell gene transfer. Nat Protoc. 8, 1837-1840 (2013).
- Donnelly, M. L., et al. Analysis of the aphthovirus 2A/2B polyprotein 'cleavage' mechanism indicates not a proteolytic reaction, but a novel translational effect: a putative ribosomal 'skip'. J Gen Virol. 82, 1013-1025 (2001).
- Atkins, J. F., et al. A case for "StopGo": reprogramming translation to augment codon meaning of GGN by promoting unconventional termination (Stop) after addition of glycine and then allowing continued translation (Go). RNA. 13, 803-810 (2007).
- Doronina, V. A., et al. Site-specific release of nascent chains from ribosomes at a sense codon. Mol Cell Biol. 28, 4227-4239 (2008).
- Bettini, M., et al. TCR affinity and tolerance mechanisms converge to shape T cell diabetogenic potential. Journal of immunology. 193, 571-579 (2014).
- Brehm, M. A., Wiles, M. V., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Generation of improved humanized mouse models for human infectious diseases. J Immunol Methods. 410, 3-17 (2014).
- Brehm, M. A., Shultz, L. D., Greiner, D. L. Humanized mouse models to study human diseases. Curr Opin Endocrinol Diabetes Obes. 17, 120-125 (2010).
- Chaplin, P. J., et al. Production of interleukin-12 as a self-processing 2A polypeptide. J Interferon Cytokine Res. 19, 235-241 (1999).
- Collison, L. W., et al. The inhibitory cytokine IL-35 contributes to regulatory T-cell function. Nature. 450, 566-569 (2007).
- Holst, J., et al. Scalable signaling mediated by T cell antigen receptor-CD3 ITAMs ensures effective negative selection and prevents autoimmunity. Nature immunology. 9, 658-666 (2008).
- Kalos, M., et al. T cells with chimeric antigen receptors have potent antitumor effects and can establish memory in patients with advanced leukemia. Sci Transl Med. 3, 95ra73 (2011).
- VanSeggelen, H., et al. T Cells Engineered With Chimeric Antigen Receptors Targeting NKG2D Ligands Display Lethal Toxicity in Mice. Mol Ther. 23, 1600-1610 (2015).
