Introduction
T-cellsreceptor (TCR) repertoar av människor och möss har beräknats till 1 x 10 8 och 2 x 10 6 unika TCR respektive 1,2. Denna stora mångfald gör T-celler att känna igen ett brett spektrum av antigenepitoper som härrör från självpeptider samt från patogener presenteras av MHC (MHC) på antigenpresenterande celler (APC). De subtila skillnaderna i växelverkan av de TCR med unika peptid-MHC-komplex diktera huruvida en T-cell kommer att genomgå apoptos, anergi, aktivering, differentiering, cytokinproduktion eller cytotoxicitet. Men på grund av den stora TCR repertoar, analys av hur en specifik TCR kommer att svara på ett speciellt antigen kräver användning av enkla TCR-system.
Olika TCR-transgena möss har genererats för att studera funktionen av en enda TCR i en in vivo-modell 9/3. Men det finns invändningar att TCR transgena möss, inklusivekostnad, längden av tid för att generera en enda transgen mus och den så kallade grundareffekt av slumpmässig transgen insättning i arvslinjen DNA 10. Därför har relativt få TCR-transgena möss genererats för en given antigen och de funktionella konsekvenserna av hög och låg TCR affinitet för samma epitop behandlas sällan. Att ta itu med behovet av en snabb metod för att screena och studera flera TCR enskilt eller i kombination, har retrogenic ( "retro" från retrovirus och "gena" från transgena) möss använts som ett alternativ till TCR transgena möss 11-13.
2A peptidkonsensusmotiv finns inom flera virus består av en 2A-Asp-Val / Ile-Glut-X-Asn-Pro-Gly-2B-Pro, där klyvning sker mellan glycin av 2A och prolinet av 2B från cis-verkande hydrolas aktivitet, vilket resulterar i ribosomala hoppa under översättning 10,14-16. För ett detaljerat diagram som visar cleavage av de olika 2A peptider (F2A, E2A, T2A och P2A) hänvisas till referenserna 10 - 12. På detta sätt, 2 cistroner (TCR alfa- och TCR beta) kan kopplas vilket resulterar i stökiometrisk översättning i en enda vektor. Med hjälp av denna metod, har vi möjlighet att uttrycka och direkt jämföra flera antigenspecifika TCR in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik uttalande: Alla ansträngningar görs för att hålla djur obehag eller stress till ett minimum under bestrålning och svansvenen injektioner. Möss används som en källa av celler i dessa experiment; som sådan finns det inga rutiner eller manipulationer förutom dödshjälp. Möss kommer att avlivas av CO 2 inandning följt av halsdislokation att bekräfta död. Detta förfarande är förenligt med rekommendationerna från panelen för avlivning av American Veterinary Medical Association.
1. Bered retroviralt konstrukt
- Sub-klon T-cellreceptor (TCR) a- och P-kedjor, åtskilda av en 2A-linker, till en MSCV-baserad retroviral 11 vektor (exempel pMIAII eller pMIGII) 11.
OBS: 2A linkern medger stökiometrisk och samstämmiga uttryck av alfa- och beta TCR-kedjor från en enda öppen läsram. Vektorn innehåller ett IRES fluorescerande protein kassett (ametrine eller GFP) som används för attspåra transducerade celler och transduktionseffektiviteten. För ett detaljerat protokoll se Holst et al. 11 - Isolera plasmid DNA med användning av kommersiellt erhållen plasma prep kit eller en liknande produkt. Använd en arbetskoncentration av 1 - 2 mikrogram il -1.
2. Framställning av retrovirala producerande cellinjer
- Utnyttja ett två-stegsförfarande för att framställa de retrovirala producent-cellinjer.
OBS: För en detaljerad protokoll, vänligen se Holst et al 11..- Generera retrovirus genom transient transfektion av 293T-celler med tre plasmider (pVSVG, PEQ-Pam3 (-E) och vektor intresse 11) och ta retroviral supernatant från 293T-celler att omvandla GP + E86 ekotropa retroviral producent-cellinje.
- Isolera den övre 40% av fluorescerande uttrycker GP + E86 producentceller med FACS och propagera transdcuced-GP + E86 producentceller som en källa till virus.
OBS: Den generationav hög titer producenter är kritisk för effektiv transduktion av benmärgsceller. För en komplett protokoll vänligen se Holst et al. 11
3. Retrovirus-medierad Stem Cell Gene Transfer (Dag -5)
- Tina upp och kultur 0,5 -1,0 x 10 6 av varje GP + E86 producent-cellinje i fullständigt DMEM 10% (vol / vol) FBS att ge tillräcklig tillväxt för två sammanflytande 150 mm plattor vid dag 0 av detta protokoll.
OBS: Upptining 0,5-1,0 x 10 6 hos varje GP + E86 producerande cellinjen i en 10 cm platta kommer att möjliggöra 30-50% konfluens vid dag 5. Detta gör det också möjligt för 5 dagars odling i syfte att expandera GP + E86 producerande cellinjer till två sammanflytande 150 mm plattor vid dag 0.- Kultur retrovirala producent-cellinje i fullständigt vävnadsodlingsmedium innehållande 5% feta kalvserum, och ciprofloxacin (10 | ig / ml) för att undvika kontaminering mykoplasma.
OBS: Avbryt användningen av ciprofloxacin vid generating virusvätskan för benmärgsöverföring. Undvika övertillväxt av producent cellinjen, eftersom detta negativt påverkar benmärgsöverföring effektivitet.
- Kultur retrovirala producent-cellinje i fullständigt vävnadsodlingsmedium innehållande 5% feta kalvserum, och ciprofloxacin (10 | ig / ml) för att undvika kontaminering mykoplasma.
4. Injicera donatormöss med 5-fluorouracil (5-FU) (Dag -3)
- Väg donatormöss (5 - 12 veckor gamla) för att bestämma mängden av 5-FU krävs. Användning av möss yngre än 5 veckors ålder ger låg benmärgs utbyte. För att säkerställa uttryck av en enda TCR, använda en T-cell bristfällig musstam såsom SCID, RAG eller TCR alfa brist möss som benmärgsdonatorer.
- Arbetar i vävnadsodling huva, späd 5-FU lager med steril PBS för att göra en tillräcklig mängd av 10 mg ml -1 arbetslösning av 5-FU för att leverera 0,15 mg 5-FU per gram kroppsvikt.
- Med användning av en 1 ml spruta med en 37 G nål, intraperitoneal injicera 0,15 mg 5-FU per gram kroppsvikt per donator mus.
OBS: Använd en donator mus per en mottagare för att starta och justeraantalet donatormöss i enlighet med cellutbytet. En alternativ metod till den 5-FU behandling för anrikning och isolering av benmärgsursprungsceller är negativt urval av härstamnings positiva celler såsom beskrivits i Viret et al.
5. Benmärgs Extraction Procedure (Dag 0)
- Skaffa dissektion sax och pincett för ben isolering. Förbered media (HBSS kompletterat med 5% FCS (vol / vol)) för att samla ben i en 50 ml koniska rör. Håll 50 ml konisk innehållande media på is. Avliva möss genom CO 2 inandning följt av halsdislokation att bekräfta död. Nyp tass att säkerställa att inga reflexer detekteras.
- Sterilisera kirurgiska platsen och kirurgiska verktyg med etanol eller metanol. Avlägsna lårben, skenben, överarmsben och bäckengördeln försiktigt genom att först skära upp och under bäckengördeln. Skär ner längs lårbenet till skenbenet. Ta bort alla omgivande vävnad med sax och pincett för att få rena ben. Ha kvarben hydratiserade i HBSS + 5% (volym / volym) FBS.
- Separera ben genom att skära i lederna, och se till att skära båda ändarna av varje ben. Sätt en 25-gauge nål fäst vid en 10-ml spruta innehållande HBSS + 5% (vol / vol) FBS. Applicera tryck och spola alla benmärg genom en 70-fim sil vilar i en 50 ml konisk.
- Periodiskt, tryck benmärgen genom 70-im filter med användning av kolven från en 1 ml eller 3 ml spruta. Skölj silen med HBSS + 5% (volym / volym) FBS. Detta kommer att säkerställa en enkelcellsuspension som är fri från benfragment och vävnad. Håll celler sterilt genom att utföra proceduren i en steril huva.
- Centrifugera benmärgsceller vid 300 xg under 10 min vid 4 ° C.
6. Bone Marrow Culture (Dag 0)
- Dekantera eller aspirera media och resuspendera cellpelleten i 1 ml ammoniumklorid baserad röda blod lysbuffert (eller RBC lyseringsbuffert motsvarande) per 50 ml koniska rör. Efter 1 min inkubation vid rums-temperatur, släcka den röda cellys buffert genom tillsats av 10 ml av komplett DMEM 20% (vol / vol) FBS.
- Centrifugera cellerna vid 300 xg under 10 min vid 4 ° C.
- Dekantera eller aspirera supernatanten och återsuspendera benmärg i 5 ml fullständigt DMEM 20% (volym / volym) FBS. Räkna cellerna med en Neubauer-räknekammare.
OBS: General avkastning bör vara ca 5-10 x 10 6 celler per mus; emellertid kan utbytet varierar bland olika stammar av möss. - Plattan benmärgsceller vid en densitet av 4 x 10 7 celler per 150-mm platta i 30 ml fullständigt DMEM 20% (vol / vol) FBS kompletterat med IL-3 (20 g ml -1), IL-6 (50 g ml -1) och SCF (50 g ml -1).
OBS: Använd färskt tinade-alikvoterades cytokiner. Använd inte cytokiner som har frysts och tinats mer än en gång eller hålls vid 4 ° C under mer än 2 veckor. - Inkubera benmärg över natten (ca 24 h) vid 37 ° C med 5% CO2.
- Plattan 3 x 10 6 retrovirala producentceller per 150-mm platta i 18 ml fullständigt DMEM 20% (volym / volym) FBS.
- Inkubera retrovirala producentceller vid 37 ° C över natten. Förutse en 150-mm platta för 15 miljoner benmärgsceller (ca 2 - 3 givar möss).
8. Retroviral Supernatant (Dag 1)
- Nästa dag (ungefär 24 timmar senare), skörda retroviral supernatant från producentplattor (som i steg 7) genom att dra upp den retrovirala vätskan direkt off av 150-mm platta med en 10-ml spruta och filter med hjälp av en 0,45 -μm sprutfilter.
- Noggrant ersätta den avlägsnade retrovirala supernatanten med 18 ml färskt fullständigt DMEM 20% (vol / vol) FBS.
- Komplettera den filtrerade retrovirala supernatanten med IL-3 (20 g ml -1), IL-6 (50 g ml -1), MSCF (50 g ml -1) och hexadimetrinbromid (Polybrene) (6 &# 956; g ml -1).
OBS: hexadimetrinbromid bör göras färskt varje 2 månader för att undvika en nedgång i effektiviteten hos retroviral transduktion.
9. Benmärgs Harvest (Dag 1)
- Efter att ha avslutat steg 8,3, skörda benmärgsceller från steg 6,4 och överföra media innehållande icke vidhäftande celler i sterila 50 ml rör.
- Tvätta plattorna kraftigt med 10 ml PBS och samlas i 50 ml koniska från steg 9,1. Om nödvändigt, upprepa tvättsteget.
- Centrifugera cellerna vid 300 xg under 10 min vid 4 ° C, dekantera supernatanten, återsuspendera cellerna i en liten volym (1 - 3 ml) komplett DMEM 20% (vol / vol) FBS, och räkna. Förutse 50-75% återhämtning från dag 0. Återsuspendera benmärg med 1 x 10 6 celler per 1 ml av den retrovirala supernatanten innehållande cytokiner och hexadimetrinbromid.
10. Bone Marrow Transduktion (Dag 1)
- Plate den retroviral supernatant / ben marrow blandningen vid en volym av 3 ml per brunn i en sex-brunnars vävnadsodlingsplatta. Linda plattorna i plastfolie för att minimera gasutbyte under centrifugering i steg 10.2.
- Snurra de omslagna sex-brunnars plattor vid 1000 xg under 60 minuter tillsattes en 37 ° C.
- Efter spin är klar, ta bort plasthöljet och placera plattorna i en 37 ° C CO 2 inkubator under 24 timmar.
11. Retroviral supernatant och Transduction (Dag 2)
- Efter 24 timmar, samla färska viral supernatant från virusproducerarcell linje. Filtrera retroviral supernatant med hjälp av en 10-ml spruta och en 0,45-um sprutfilter. Komplettera den filtrerade retrovirala supernatanten med IL-3 (20 g ml -1), IL-6 (50 g ml -1) och SCF (50 g ml -1) och hexadimetrinbromid (6 g ml -1).
- Därefter försiktigt bort med pipett eller aspirera de bästa 2 ml av media från varje brunn i sex brunnar innehållande benmärgsceller.
OBS: Arbeta noga att inte aspirera benmärgen, som vanligtvis är koncentrerad till mitten av brunnen. Alternativt kan den avlägsnade supernatanten centrifugerades för att återvinna förlorad benmärgsceller. - Till varje brunn i benmärgen 6-brunnar tillsätt 3 ml av färska virala supernatanten innehållande cytokiner och hexadimetrinbromid. Linda plattorna i plast, och upprepa centrifugeringsöverföring vid 1000 xg under 60 min 37 ° C. Packa upp plattorna, och inkubera cellerna vid 37 ° C och 5% CO2 över natten (ca 24 h).
12. Tillsats av färsk kompletterat DMEM (Dag 3)
- Efter 24 h, avlägsna de översta 2 ml av media från varje brunn i sex-brunnsplatta innehållande de benmärgsceller, såsom i steg 11.2. Ersätta den borttagna media med färskt DMEM 20% (vol / vol) FBS kompletterat med slutliga koncentrationer av IL-3 (20 g ml -1), IL-6 (50 g ml -1) och SCF (50 g ml -1) .
- Inkubera benmärgplattorna vid 37 ° C CO2 inkubator under ytterligare 24 timmar.
13. Harvest transducerad benmärg (Dag 4)
- Efter 24 timmar, samla benmärgsceller från sex brunnar. Tvätta plattorna kraftigt med PBS för att avlägsna alla icke-vidhäftande celler.
- Centrifugera cellerna vid 300 xg under 10 min vid 4 ° C och dekantera supernatanten.
- Resuspendera benmärgen i en liten volym (1 ml) av PBS + 0,5% (vol / vol) värmeinaktiverat FBS. Håll celler på is.
- Ta en 10-pl prov av varje benmärgs skick och räkna cellerna med användning av en Neubauer-räknekammare. Förutsatt 1-2 donator per mottagare, kommer avkastningen vara tillräcklig för att överföra åtminstone 4 x 10 6 celler per mottagare mus. Resuspendera benmärgen i en tillräcklig volym av PBS + 0,5% (vol / vol) värmeinaktiverat FBS att injicera 200 - 300 l per mus.
- Injicera åtminstone 2 x 10 6 celler med en transduktionseffektiviteten25% (kan injicera upp till 8 x10 6 celler) per mus intravenöst.
OBS: Vi injicerar rutinmässigt fem mottagande möss per två 6-brunnsplattor av benmärgsceller. Om avkastningen är betydligt lägre, bör fler donatormöss användas tills tillräckligt benmärgen nummer kan erhållas. För att uppnå optimal beredning, åtminstone 5 x 10 5 omvandlade (fluorescerande positiv) ska injiceras i varje mottagare.
- Injicera åtminstone 2 x 10 6 celler med en transduktionseffektiviteten25% (kan injicera upp till 8 x10 6 celler) per mus intravenöst.
- Med en mikro pipett, ta en 10-pl prov av varje benmärgs skick och analysera transduktionseffektiviteten genom flödescytometri baserad på uttryck av den fluorescerande markören (Figur 1A) 11.
OBS: I allmänhet är den procentuella andelen fluorescerande positiva celler mellan 25% och 70%, beroende på konstruktionen och retroviralt titer. Antalet transducerade benmärgsceller vara nödvändigt att rekonstruera en sub-letalt irradiate mus kan variera beroende på transduktionseffektiviteten. Ju lägre transduction effektivitet, de mer benmärgsceller erfordras och omvänt gäller att ju högre benmärgs transduktionseffektiviteten, det lägre antalet celler som erfordras för rekonstitution. Transduktion effektivitet under 25% är suboptimal och kan resultera i otillräcklig beredning och överlevnad. För att säkerställa optimal benmärgs återhämtning och transduktionseffektiviteten, använd nyberedda vävnadsodlingsmedia och cytokiner. När uttrycker en ny TCR utnyttja retrogenic systemet, är valet av den TCR in vivo okänd. Beroende på varje enskild TCR affinitet kommer TCR val i tymus och perifera T-cell uttryck varierar 17.
14. Mouse Strålningsbenmärgs Injection och vård
- Bestråla möss dagen före benmärgsinjektion (samma dag som steg 13). Använd följande doser: C57BL / 6 möss (och andra stammar vild typ), 900 rad, Rag1 - / - möss, 500 rad, SCID-möss, 300 rad).
- Placera mottagande möss på Amoxicillin (50 mg / kg / dag) eller annan antibiotika vattenrening före bestrålning, och håller på att antibiotika under de första två veckorna efter benmärgs injektion.
OBS! Optimal strålningsdos kan behöva bestämmas empiriskt.
- Placera mottagande möss på Amoxicillin (50 mg / kg / dag) eller annan antibiotika vattenrening före bestrålning, och håller på att antibiotika under de första två veckorna efter benmärgs injektion.
- För injektion, ladda cellerna från steg 13,1 i en 1-ml spruta med trubbiga nålar omedelbart före injektion, sedan byta nål till 27-mätare för injektion, utvisa någon luft för att undvika luftemboli. Värme möss under en värmelampa och injicera 0,2 ml av benmärg per mus intravenöst.
OBS: Låt inte cellerna sitta i sprutan under en längre tid eller cellerna kommer lösa. - Övervaka mössen varje vecka för att säkerställa att de förblir friska.
- Efter 5 - 6 veckor, blöder mössen att kontrollera för rekonstituering på grundval av GFP + / ametrine + och TCR samexpression (Figur 1B) 11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Benmärgs transduktionseffektiviteten kontrolleras vid steg 13.3 i protokollet innan benmärgen injiceras i svansvenen IV I representativa benmärgsöverföring figur (Figur 1A), ca 10 pl av den skördade benmärgen sattes till 100 pl PBS och analyserades med avseende ametrine uttryck. I allmänhet den procentuella andelen fluorescerande positiva celler är mellan 25% och 70%, beroende på konstruktionen och retroviralt titer. Efter 6 veckor benmärgsinjektion mössen blödde att bestämma benmärgs rekonstitution (Figur 1B). Cirka 25 pl perifert blod röda blodkroppar lyserades och färgades med anti-TCRβ. I figur 2B alla TCR positiva celler concordantly uttrycka ametrine fluorescerande proteinet.
Figure 1. Exempel på benmärg Transduction och Perifer TCR Retrogenic T-celler. A) Transduktion effektiviteten av benmärgsceller analyseras baserat på den fluorescerande markören (ametrine) på dagen för benmärgsöverföring. Approximativt 10-l av den skördade benmärgen sattes till 100 pl av PBS och analyserades med avseende ametrine expression. En framgångsrik benmärgs transduktion kommer att ge en procentandel av fluorescerande positiva celler mellan 25% och 70%. B) Exempel på TCR retrogenic T-celler i perifert blod 6 veckor efter benmärgs rekonstitution. Perifert blod erhölls och röda blodkroppar lyserades med lyseringsbuffert. De kvarvarande cellerna färgades för TCRβ. Representativ analys för ametrine uttryck och anti-TCRβ färgning 6 veckor efter benmärgs beredning. Klicka här för att se en större version av thans gestalt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I protokollet vi detalj flera viktiga åtgärder för att säkerställa optimal benmärgs hälsa, transduktion effektivitet och beredning. Första kritiska steget är genereringen och korrekt underhåll av GP + E86 viral produktionsceller. Använda tidig passage producerande cellinjer och hålls kvar vid 80% konfluens eller lägre före användning. Vid färska GP + E86 viral produktionsceller, se till att 293T-celler är tidig passage och växande i kultur för 24-48 timmar. Plätering alltför många GP + E86 celler under transduktion steg kommer att sänka virustiter. Bestämma virustiter som beskrivs i Holst et al. 11 för att säkerställa GP + E86 är robusta virala producenterna. Dessutom, avlägsnande av röda blodkroppar från den skördade benmärgen förbättrar transduktionseffektiviteten. Säkerställa hälsa benmärgsstamfäder är avgörande för framgång i protokollet. För detta ändamål alltid använda färska media (mindre än 4 veckor vid 4 ° C efter kompletterat med FCS) och färska cytokiner (mindreän 2 veckor när de lagras vid 4 ° C). Hexadimetrinbromid är också känsliga för nedbrytning och bör göras färska, när den är i lösning, varje 2 månader. Andra detaljer som säkerställer optimal benmärgs hälsa och transduktion inkluderar förvärma centrifugen innan spinnöverföring. Spin-transducera vid 37 ° C och linda plattor med plastfolie för att minska gasutbyte så mycket som möjligt. Dessutom, låt inte benmärgen sitta utanför 37 ° C inkubator eller på is under längre perioder eftersom detta kommer att öka celldöd och minskar benmärgsöverföring och beredning. Efter benmärgscellerna har skördats vid dag 4 (steg 13), endast ladda sprutorna omedelbart före insprutning av mössen. Slutligen se till att möss placeras på antibiotika dagen före eller samma dag som bestrålningen.
Utnyttjandet av denna retroviral förmedlad transduktion-protokollet tillåter transduktion av benmärgsstamfaderceller som resulterar ialstringen av T-cellreceptor retrogenic möss. Retrogenic möss är snabbare att generera än TCR transgena möss och kostnader betydligt mindre än att generera en enda TCR transgen. Däremot kan retrogenic möss inte paras och måste genereras på nytt med varje experiment 10. Antalet perifera T-celler är lägre i retrogenic möss än den hos TCR transgena möss men regleringen av TCR är jämförbar mellan TCR retrogenic och TCR transgena 10. TCR retrogenic systemet tillåter för uttrycket av multipla TCR inom samma koloni och även inom samma experiment. Med användning av TCR retrogenic protokoll som beskrivs här gör det möjligt för en utredare för att testa och undersöka utvecklingen och funktionen hos många nyligen identifierade MHC klass I eller II begränsade TCR. Med utvecklingen av den "humaniserade mus" modell 18,19, kunde TCR retrogenic ytterligare utökas med användning av klonade humana TCRs. Dessutom, 2A kopplade konstruktioner cen också användas för att studera andra multi-proteiner inkluderande de CD3-kedjor, interleukiner och chimära antigenreceptorer 20-24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats med bidrag från NIH (5K22A1119151-01 och 1R56DK104903-01) till MLB, Pilot / genomförbarhets Program för Diabetes Research Center (P30-DK079638) på BCM, JDRF en-FAC-2014-243-AN APF, ADA 1-15-JF-07, AAI Karriär i Immunology stipendium till MB, och Robert och Janice McNair Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM, high glucose + glutamine | Corning Cellgro | 10-013-CV | Dulbecco's Modification of Eagle's Medium with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate |
| FBS | Atlanta Biological | S11550 | |
| Trypsin-Versene | Lonza | 17-161F | |
| 0.45 µm syringe filter | Thermo Scientific | 194-2545 | |
| polybrene | Sigma | H9268-10G | Sterile Filtered in dH2O |
| Ciprofloxacin | VWR | AAJ61970-06 | |
| 5-fluorouracil (5-FU) | VWR | AAA13456-06 | |
| Sodium Pyruvate | Corning Cellgro | 25-000-CI | |
| MEM nonessential Amino Acids | Corning Cellgro | 25-025-CI | |
| HEPES 1 M solution | Corning Cellgro | 25-060-CI | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco by Life Technologies | 21985-023 | |
| Pen/Strept | Corning Cellgro | 30-002-CI | |
| L-glutamine | Corning Cellgro | 25-005-CI | |
| 150 mm tissue culture dishes | Greiner Bio-one | 639160 | |
| Tisue culture-treated 6-well flat plate | Greiner Bio-one | 657160 | |
| 70 µm nylon cell strainers | Falcon | 352350 | |
| Mouse IL-3 | Invitrogen | PMC0033 | |
| Human IL-6 | Invitrogen | PHC0063 | |
| Mouse Stem Cell Factor | Invitrogen | PMC2113L | |
| 10x PBS | Corning Cellgro | 46-D13-CM | |
| HANKS Buffer | Corning Cellgro | 21020147 | |
| BD 10 ml Syringe | BD | 300912 | |
| BD 1 ml Syringe | BD | 309659 | |
| 27 G x 1/2 BD Precision Glide Needle | BD | 305109 | |
| 30 G x 1/2 BD Precision Glide Needle | BD | 305106 |
References
- Qi, Q., et al. Diversity and clonal selection in the human T-cell repertoire. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 13139-13144 (2014).
- Zarnitsyna, V. I., Evavold, B. D., Schoettle, L. N., Blattman, J. N., Antia, R. Estimating the diversity, completeness, and cross-reactivity of the T cell repertoire. Frontiers in immunology. 4, 485 (2013).
- Kisielow, P., Bluthmann, H., Staerz, U. D., Steinmetz, M., von Boehmer, H. Tolerance in T-cell-receptor transgenic mice involves deletion of nonmature CD4+8+ thymocytes. Nature. 333, 742-746 (1988).
- Hogquist, K. A., et al. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76, 17-27 (1994).
- Verdaguer, J., et al. Spontaneous autoimmune diabetes in monoclonal T cell nonobese diabetic mice. J Exp Med. 186, 1663-1676 (1997).
- Katz, J. D., Wang, B., Haskins, K., Benoist, C., Mathis, D. Following a diabetogenic T cell from genesis through pathogenesis. Cell. 74, 1089-1100 (1993).
- Pauza, M. E., et al. T-cell receptor transgenic response to an endogenous polymorphic autoantigen determines susceptibility to diabetes. Diabetes. 53, 978-988 (2004).
- Jasinski, J. M., et al. Transgenic insulin (B:9-23) T-cell receptor mice develop autoimmune diabetes dependent upon RAG genotype, H-2g7 homozygosity, and insulin 2 gene knockout. Diabetes. 55, 1978-1984 (2006).
- Kersh, G. J., et al. TCR transgenic mice in which usage of transgenic alpha- and beta-chains is highly dependent on the level of selecting ligand. Journal of immunology. 161, 585-593 (1998).
- Bettini, M. L., Bettini, M., Vignali, D. A. TCR retrogenic mice: A rapid, flexible alternative to TCR transgenic mice. Immunology. 136 (3), 265-272 (2012).
- Holst, J., et al. Generation of T-cell receptor retrogenic mice. Nat Protoc. 1, 406-417 (2006).
- Holst, J., Vignali, K. M., Burton, A. R., Vignali, D. A. Rapid analysis of T-cell selection in vivo using T cell-receptor retrogenic mice. Nat Methods. 3, 191-197 (2006).
- Bettini, M. L., Bettini, M., Nakayama, M., Guy, C. S., Vignali, D. A. Generation of T cell receptor-retrogenic mice: improved retroviral-mediated stem cell gene transfer. Nat Protoc. 8, 1837-1840 (2013).
- Donnelly, M. L., et al. Analysis of the aphthovirus 2A/2B polyprotein 'cleavage' mechanism indicates not a proteolytic reaction, but a novel translational effect: a putative ribosomal 'skip'. J Gen Virol. 82, 1013-1025 (2001).
- Atkins, J. F., et al. A case for "StopGo": reprogramming translation to augment codon meaning of GGN by promoting unconventional termination (Stop) after addition of glycine and then allowing continued translation (Go). RNA. 13, 803-810 (2007).
- Doronina, V. A., et al. Site-specific release of nascent chains from ribosomes at a sense codon. Mol Cell Biol. 28, 4227-4239 (2008).
- Bettini, M., et al. TCR affinity and tolerance mechanisms converge to shape T cell diabetogenic potential. Journal of immunology. 193, 571-579 (2014).
- Brehm, M. A., Wiles, M. V., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Generation of improved humanized mouse models for human infectious diseases. J Immunol Methods. 410, 3-17 (2014).
- Brehm, M. A., Shultz, L. D., Greiner, D. L. Humanized mouse models to study human diseases. Curr Opin Endocrinol Diabetes Obes. 17, 120-125 (2010).
- Chaplin, P. J., et al. Production of interleukin-12 as a self-processing 2A polypeptide. J Interferon Cytokine Res. 19, 235-241 (1999).
- Collison, L. W., et al. The inhibitory cytokine IL-35 contributes to regulatory T-cell function. Nature. 450, 566-569 (2007).
- Holst, J., et al. Scalable signaling mediated by T cell antigen receptor-CD3 ITAMs ensures effective negative selection and prevents autoimmunity. Nature immunology. 9, 658-666 (2008).
- Kalos, M., et al. T cells with chimeric antigen receptors have potent antitumor effects and can establish memory in patients with advanced leukemia. Sci Transl Med. 3, 95ra73 (2011).
- VanSeggelen, H., et al. T Cells Engineered With Chimeric Antigen Receptors Targeting NKG2D Ligands Display Lethal Toxicity in Mice. Mol Ther. 23, 1600-1610 (2015).
