Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Retroviral התמרה של ובתאים מח עצם כדי ליצור תאי T קולטן Retrogenic עכברים

Published: July 11, 2016 doi: 10.3791/54196
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Pediatrics, Baylor College of Medicine

Introduction

קולטן תא T (TCR) הרפרטואר של בני אדם ועכברים כבר נאמד ב 1 x 10 8 ו -2 x 10 6 TCRs ייחודי בהתאמה 1,2. מגוון גדול זה מאפשר לתאי T להכיר מגוון רחב של אפיטופים אנטיגן נגזרו-פפטידים עצמיים וכן פתוגנים שהציג מורכבי histocompatibility הגדולים (MHC) על תאי מציגי אנטיגן (נגמ"שים). ההבדלים הדקים האינטראקציות של TCRs עם מתחמים ייחודיים פפטיד-MHC להכתיב אם תא T יעבור אפופטוזיס, anergy, הפעלה, בידול, ייצור ציטוקינים או רעיל. עם זאת, בשל רפרטואר TCR הגדול, ולנתח את ההשפעה של ספציפיות TCR יגיב אנטיגן מסוים מחייב שימוש יחיד מערכות TCR.

עכברים מהונדסים TCR שונים נוצרו על מנת ללמוד את הפונקציה של יחיד TCR במודל vivo ב 3-9. עם זאת, יש מספר אזהרות בנוגע TCR עכברים מהונדסים כוללעלות, את משך הזמן כדי ליצור עכבר מהונדס יחיד והשפעת המייסד שנקראת החדרת transgene האקראית לתוך ה- DNA germline 10. לכן, רק מעטים יחסית עכברים מהונדסים TCR נוצרו עבור כל אנטיגן נתון ואת ההשלכות הפונקציונליות של זיקת TCR גבוהה ונמוכה עבור אותו אפיטופ לעתים רחוקות מופנות. כדי לענות על הצורך בגישה מהירה למסך וללמוד מרובי TCRs בנפרד או במשולב, retrogenic ( 'רטרו' מ רטרו-וירוס ו 'genic' מ מהונדס) עכברים כבר נוצל כחלופת TCR עכברים מהונדסים 11-13.

מוטיב קונסנסוס פפטיד 2A נמצא בתוך כמה וירוסים מורכב 2A-Asp-Val / Ile-השפע-X-ASN-פרו-גלאי-2B-פרו, שבה מחשוף מתרחש בין גליצין של 2A ואת פרולין של 2B מפעילות hydrolase -acting ציס, וכתוצאה מכך מדלגים ריבוזומלי במהלך התרגום 10,14-16. לקבלת דיאגרמה מפורטת המתארת ​​את גleavage של פפטידים 2A שונים (F2A, E2A, T2a ו P2A) עיין אזכור 10 - 12. באופן זה, 2 cistrons (אלפא ובטא TCR TCR) ניתן לקשר וכתוצאה מכך תרגום stoichiometric ב וקטור יחיד. ניצול גישה זו, אנו מסוגלים לבטא ישירות להשוות TCRs אנטיגן ספציפי מרובים in vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

משפט ואתיקה: מאמץ כל נעשה כדי לשמור על חוסר נוחות לבעל חיים או מתח עד למינימום במהלך הקרנת וריד זנב זריקות. עכברים משמשים כמקור לתאי בניסויים אלה; ככזה אין נהלים או מניפולציות מלבד המתת חסד. עכברים יהיה מורדמים משאיפת CO 2 ואחריו נקע בצוואר הרחם כדי לאשר מוות. הליך זה עולה בקנה אחד עם המלצות של הפנל על המתת חסד של האגודה האמריקאית לרפואה וטרינרית.

1. הכינו retroviral Construct

  1. תת-שיבוט קולטן תאי T (TCR) אלפא ורשתות בטא, מופרדים על ידי מקשר 2A, לתוך וקטור 11 retroviral מבוססי MSCV (למשל, pMIAII או pMIGII) 11.
    הערה: מקשר 2A מאפשר לביטוי stoichiometric ו התואם של אלפא TCR בטא שרשרות ממסגרות קריאה אחת פתוחה. וקטור כולל קלטת חלבון פלואורסצנטי IRES (Ametrine או GFP) המשמשלעקוב אחר יעילות תמרה ותאי transduced. עבור פרוטוקול מפורט ראה הולסט et al. 11
  2. לבודד פלסמיד דנ"א באמצעות ערכת הכנת פלזמה שהושגה באופן מסחרי או מוצר דומה. השתמש ריכוז העבודה של 1 - 2 מיקרוגרם μl -1.

2. דור של שורות תאי מפיק retroviral

  1. לנצל תהליך בן שני שלבים כדי לייצר את שורות תאי מפיק retroviral.
    הערה: לקבלת פרוטוקול מפורט, בבקשה להציג הולסט ואח 11..
    1. צור רטרו-וירוס על ידי transfection חולף של תאים 293T עם שלושה פלסמידים (pVSVG, pEQ-Pam3 (-E) ואת וקטור עניין 11) ולקחת את supernatant retroviral מתאי 293T כדי transduce הקו הסלולרי מפיק retroviral ecotropic GP + E86.
    2. לבודד את 40% העליונים של להביע ניאון תאי מפיק GP + E86 ידי FACS ולהרבות תאים מפיקים transdcuced-GP + E86 כמקור וירוס.
      הערה: הדורשל יצרנים גבוהה כייל הוא קריטי עבור התמרה יעיל של תאי מח העצם. עבור פרוטוקול מלא בבקשה להציג הולסט et al. 11

3. רטרו-וירוס בתיווך תא גזע Gene Transfer (יום -5)

  1. להפשיר והתרבות 0.5 -1.0 x 10 6 של כל שורת תא מפיק GP + E86 ב DMEM המלא 10% (כרך / כרך) FBS כדי לאפשר צמיחה מספקת עבור שתי מנות ומחוברות 150 מ"מ על ידי יום 0 של פרוטוקול זה.
    הערה: הפשרת 0.5 - 1.0 x 10 6 של כל שורה תא מפיק GP + E86 בצלחת 10 ס"מ יאפשר במשך 30 - 50% confluency ב יום 5. זה מאפשר גם עבור 5 ימים של תרבות על מנת להרחיב את GP + E86 תא מפיק קווי לשתי צלחות ומחוברות 150 מ"מ על ידי יום 0.
    1. שורת תאים תרבות המפיק retroviral בתקשורת תרבות שלמה רקמה המכילה סרום עגלים פטה 5%, ו ciprofloxacin (10 מיקרוגרם / מ"ל) כדי למנוע זיהום mycoplasma.
      הערה: להפסיק מיד את השימוש ciprofloxacin כאשר generating את supernatant ויראלי עבור תמרת מח עצם. הימנע על הצמיחה של הקו הסלולרי המפיק, כמו זה ישפיע באופן שלילי על יעילות התמר מח עצם.

4. עכברים תורמים להזריק עם 5-fluorouracil (5-FU) (יום -3)

  1. לשקול העכברים התורמים (5 - 12 שבועות) כדי לקבוע את כמות 5-FU הנדרש. באמצעות עכברים מתחת לגיל 5 שבועות של תוצאות גיל בתשואת מח עצם נמוכה. כדי להבטיח ביטוי יחיד TCR, להשתמש זן עכבר לקוי של תאי T כגון SCID, RAG או אלפא TCR עכברים לקויים כמו תורמי מח עצם.
  2. עבודה למכסה המנוע בתרבית רקמה, לדלל את המניות 5-FU עם PBS סטרילי כדי לייצר כמות מספקת של מ"ל 10 מ"ג -1 הפתרון עובד של 5-FU לספק 0.15 מ"ג 5-FU לגרם של משקל הגוף.
  3. באמצעות מזרק 1 מ"ל עם מחט 37 G, intraperitoneal להזריק 0.15 מ"ג 5-FU לגרם ממשקל הגוף לכל עכבר התורם.
    הערה: עכבר התורם 1 השתמש למקבל אחד להתחיל ולהתאיםאת מספר העכברים התורמים בהתאם לשיעור תשואת התא. שיטה חלופית לטיפול 5-FU להעשרה והבידוד של אבות מח עצם היא סלקציה שלילית של תאים חיוביים שושלת כמתוארת אל Viret et.

5. נוהל הפקת מח עצם (יום 0)

  1. השג מספריים לנתיחה ו מלקחיים לבידוד עצם. הכן התקשורת (HBSS בתוספת 5% FCS (כרך / כרך)) לאסוף עצמות צינור חרוטי 50 מ"ל. שמור 50 מיליליטר חרוטים המכילים תקשורת על קרח. להרדים עכברים משאיפת CO 2 ואחריו נקע בצוואר הרחם כדי לאשר מוות. לצבוט כפה על מנת להבטיח שום רפלקסים מזוהים.
  2. לעקר את האתר כירורגית כלים כירורגיים עם אתנול או מתנול. הסר את עצם הירך, עצם השוק, עצם הזרוע, ואת חגורת האגן בקפידה על ידי חיתוך הראשון ותחת המחוך האגן. חותך בחזרה לאורך הירך אל עצם השוק. הסר את כל הרקמה הסובבת באמצעות מספריים מלקחיים כדי להשיג עצמות נקיות. לִשְׁמוֹרעצמות hydrated ב HBSS + 5% (כרך / כרך) FBS.
  3. הפרד את העצמות על ידי חיתוך על המפרקים, והקפד לחתוך בשני הקצוות מעל כל עצם. הכנס מחט 25-מד מצורף מזרק 10 מ"ל המכיל HBSS + 5% (כרך / כרך) FBS. החל הלחץ ולשטוף את כל מח העצם באמצעות המנוחה מסננת 70 מיקרומטר בתוך חרוטי 50 מ"ל.
  4. מעת לעת, לדחוף את מח העצם דרך המסנן 70 מיקרומטר באמצעות הבוכנה של מזרק 1 מ"ל או 3 מ"ל. יש לשטוף את המסננת עם HBSS + 5% (כרך / כרך) FBS. פעולה זו תבטיח השעית תא בודדת כי הוא חופשי של שברי עצמות ורקמות. שמור את התאים סטרילי על ידי ביצוע ההליך במנדף סטרילית.
  5. תאי מח עצם צנטריפוגה XG ב 300 במשך 10 דקות ב 4 °.

6. תרבות מח עצם (יום 0)

  1. התקשורת למזוג או לשאוב גלולה תא גלולה ב אמוניום כלוריד 1 מ"ל חיץ אדום מבוסס דם תמוגה (או שווה ערך חיץ תמוגה RBC) לכל 50 מ"ל חרוטי צינור. לאחר 1 דגירת דקות ב חדר הטמפרטורה, להרוות את חיץ אדום תא תמוגה על ידי הוספת 10 מ"ל של שלמה DMEM 20% (כרך / כרך) FBS.
  2. תאי צנטריפוגה XG ב 300 במשך 10 דקות ב 4 °.
  3. למזוג או לשאוב supernatant ו resuspend מח עצם ב 5 מ"ל DMEM להשלים 20% (כרך / כרך) FBS. ספירת התאים עם תא ספירת נויבאואר.
    הערה: תשואה כללית צריכה להיות כ 5 - 10 x 10 6 תאים לכל עכבר; עם זאת, התשואה יכולה להשתנות בין זנים שונים של עכברים.
  4. מח עצם פלייט תאים בצפיפות של 4 x 10 7 תאים לכל צלחת 150 מ"מ ב 30 מיליליטר של DMEM המלא 20% (כרך / כרך) FBS בתוספת IL-3 (20 גרם מיליליטר -1), IL-6 (50 גרם מ"ל -1) ו SCF (50 גרם מ"ל -1).
    הערה: השתמש טרי מופשר-aliquoted ציטוקינים. אין להשתמש ציטוקינים כי כבר קפוא מופשר יותר מפעם אחת או שמרו על 4 מעלות צלזיוס במשך יותר מ 2 שבועות.
  5. דגירה מח עצם לילה (כ 24 שעות) בשעה 37 ° C עם 5% CO 2.

s = "jove_title"> 7. תרבית תאי מפיק retroviral (יום 0)

  1. פלייט 3 x 10 6 תאים המפיק retroviral לכל צלחת 150 מ"מ ב 18 מ"ל להשלים DMEM 20% (כרך / כרך) FBS.
  2. דגירת תאי מפיק retroviral ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. להקדים צלחת אחת 150 מ"מ עבור 15 מיליון תאי מח עצם (כ 2 - 3 עכברים תורמים).

8. retroviral Supernatant (יום 1)

  1. למחרת (כ 24 שעות לאחר מכן), למסוק את supernatant retroviral מהצלחות המפיק (להגדיר בשלב 7) על ידי ציור את supernatant retroviral ישירות הנחה של צלחת 150 מ"מ עם מזרק מסנן 10 מ"ל באמצעות 0.45 מסנן מזרק -μm.
  2. בזהירות להחליף את supernatant retroviral שהוסרו עם 18 מ"ל של DMEM שלם טרי 20% (כרך / כרך) FBS.
  3. להשלים את supernatant retroviral מסוננים עם IL-3 (20 גרם מ"ל -1), IL-6 (50 גרם מ"ל -1), Mscf (50 גרם מ"ל -1) ו ברומיד Hexadimethrine (polybrene) (6 &# 956; ז מ"ל -1).
    הערה: ברומיד Hexadimethrine צריך להיעשות טרי כל 2 חודשים כדי להימנע מירידה ברמת יעילות של תמרת retroviral.

9. קציר מח עצם (יום 1)

  1. לאחר השלמת שלב 8.3, לקצור את התאים במח העצם משלב 6.4 ולהעביר את התקשורת המכיל תאים שאינם חסיד לתוך צינורות 50 מ"ל סטרילי.
  2. שטפו את צלחות נמרצות עם 10 מ"ל PBS ולאסוף את חרוטי 50 מ"ל משלב 9.1. במידת הצורך, חזור על השלב לשטוף.
  3. צנטריפוגה התאים XG ב 300 במשך 10 דקות ב 4 ° C, למזוג supernatant, תאים resuspend בנפח קטן (1 - 3 מ"ל) שלם DMEM 20% (כרך / כרך) FBS, ולספור. להקדים 50 - 75% התאוששות מהיום 0. מח עצם Resuspend ב 1 x 10 6 תאים לכל 1 מ"ל של supernatant retroviral המכיל ציטוקינים ברומיד Hexadimethrine.

10. מח עצם תמרה (יום 1)

  1. פלייט ma supernatant / עצם retroviralתערובת rrow בהיקף של 3 מ"ל לכל היטב צלחת בתרבית רקמה שש היטב. לעטוף את הצלחות בניילון נצמד כדי למזער חילוף הגזים במהלך צנטריפוגה בשלב 10.2.
  2. ספין צלחות שש העטופות היטב XG ב 1000 למשך 60 דקות 37 מעלות צלזיוס.
  3. אחרי ספין תושלם, להסיר את בניילון נצמד ומניחים הצלחות באינקובטור 37 ° C-CO 2 למשך 24 שעות.

11. retroviral Supernatant ו התמרה (יום 2)

  1. לאחר 24 שעות, לאסוף supernatant ויראלי טרי מקו תא מפיק ויראלי. סנן את supernatant retroviral באמצעות מזרק 10 מ"ל מזרק מסנן 0.45-מיקרומטר. להשלים את supernatant retroviral מסוננים עם IL-3 (20 גרם מ"ל -1), IL-6 (50 גרם מ"ל -1) ו SCF (50 גרם מ"ל -1) ו ברומיד Hexadimethrine (6 גרם מ"ל -1).
  2. בשלב הבא, להסיר בזהירות עם פיפטה או לשאוב תקשורת 2 מיליליטר של העליון מבאר כל הצלחת שש היטב המכיל את תאי מח העצם.
    הערה: העבודה בזהירות שלא לשאוב את מוח העצם, אשר בדרך כלל מרוכז באמצע הבאר. לחלופין, supernatant יוסר ניתן סובב למטה כדי לשחזר את כל תאים במח עצם לאיבוד.
  3. כדי היטב כל צלחת 6-גם מח עצם להוסיף 3 מ"ל של ציטוקינים המכיל supernatant ויראלי טריים ברומיד Hexadimethrine. לעטוף את הצלחות בפלסטיק, וחזור על תמרת ספין XG ב 1000 עבור 60 דק '37 מעלות צלזיוס. לגולל את הצלחות, דגירת תאים ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה 5% CO 2 (כ -24 שעות).

תוספת 12. הטריה בתוספת DMEM (יום 3)

  1. לאחר 24 שעות, להסיר את 2 מ"ל גבי מדיה מבאר כל צלחת שש היטב המכיל את התאים במח העצם, כמו בשלב 11.2. החלף את המדיה הסיר עם DMEM טרי 20% (כרך / כרך) FBS בתוספת ריכוזי הסופי של IL-3 (20 גרם מ"ל -1), IL-6 (50 גרם מ"ל -1) ו SCF (50 גרם מ"ל -1) .
  2. דגירת מח עצםצלחות ב 37 ° C חממה CO 2 למשך 24 שעות.

13. קציר transduced מח עצם (יום 4)

  1. לאחר 24 שעות, לאסוף את תאי מח העצם מהצלחות שש היטב. שטוף את הצלחות נמרצות עם PBS להסיר את כל התאים שאינם חסידים.
    1. צנטריפוגה התאים XG ב 300 במשך 10 דקות ב 4 ° C ו למזוג supernatant.
    2. Resuspend במח העצם בנפח קטן (1 מ"ל) של PBS + 0.5% (כרך / כרך) FBS חום מומת. שמור את התאים על הקרח.
  2. קח מדגם 10-μl של כל תנאי מח עצם לספור את התאים באמצעות תא ספירת נויבאואר. בהנחת 1 - 2 תורם למקבל, התשואה תספיק כדי להעביר לפחות 4 x 10 6 תאים לכל עכבר נמען. Resuspend מח העצם ב נפח מספיק של PBS + 0.5% (כרך / כרך) FBS חום מומת כדי להזריק 200 - 300 μl לכל עכבר.
    1. להזריק לפחות 2 x 10 6 תאים עם יעילות התמרשל 25% (ניתן להזריק עד 8 ​​x10 6 תאים) לכל עכבר לווריד.
      הערה: אנו שגרתי להזריק חמישה עכברים הנמען לכל שני 6-גם צלחות של תאי מח העצם. אם התשואה נמוכה באופן משמעותי, יותר עכברים תורמים אמורים לשמש עד מספר מח עצם מספיק ניתן להשיג. על מנת להשיג כינון מחדש אופטימלי, לפחות 5 x 10 5 transduced (פלורסנט החיובי) צריכים להיות מוזרק לתוך כל נמען.
  3. עם פיפטור מיקרו, לקחת דגימה של 10 μl של כל תנאי מח עצם ולנתח יעילות התמרה על ידי זרימת cytometry מבוסס על הביטוי של סמן פלואורסצנטי (איור 1 א) 11.
    הערה: באופן כללי, אחוז התאים החיוביים ניאון הוא בין 25% ל -70%, תלוי לבנות כייל retroviral. מספר תאי transduced מח עצם הצורך להקים מחדש עכבר להקרין תת-קטלני יכול להשתנות תלוי יעיל התמרה. להנמיך את טראןיעילות sduction, התאים במח העצם יותר נדרש ומנגד, גבוה יותר יעילות התמרה מח עצם, מספר נמוך של תאי הנדרשים הכינון מחדש. יעילות תמרה מתחת ל -25% היא הכי מוצלחת ועלולה לגרום כינון מחדש והישרדות מספיק. על מנת להבטיח התאוששות מח עצם אופטימלית יעילות התמרה, להשתמש במדיה וציטוקינים בתרבית רקמה טריים המוכנים במקום. כאשר בעת TCR חדש ניצול מערכת retrogenic, הבחירה של זה TCR in vivo אינה ידועה. בהתאם לכל זיקת TCR פרט, בחירת TCR התימוס וביטוי תא T ההיקפי תשתנה 17.

14. עכבר הקרנה, הזרקת מח עצם וטיפול

  1. מקרין עכברים יום לפני הזרקת מח העצם (יום זהה שלב 13). השתמש במינונים הבאים: C57BL / 6 עכברים (זני סוג בר אחרים), 900 rads; Rag1 - / - עכברים, 500 rads; עכברי SCID, 300 rads).
    1. נמען מקום עכברים על אמוקסיצילין (50 מ"ג / קילו / יום) או אחר לטיפול במי אנטיביוטיקה לפני ההקרנה, ולשמור על אנטיביוטיקה במשך השבועות הראשונים לאחר הזרקת מח העצם.
      הערה: מנה הקרנה אופטימלית ייתכן שיהיה צורך לקבוע באופן אמפירי.
  2. עבור זריקה, לטעון את התאים משלב 13.1 לתוך מזרק 1 מ"ל באמצעות מחטים בוטה מיד לפני ההזרקה, ולאחר מכן שנה את המחט 27-מד להזרקה, לגרש את כל האוויר כדי למנוע תסחיף אוויר. עכברים מחממים תחת מנורת חימום ולהזריק 0.2 מ"ל של מח העצם לכל עכבר לווריד.
    הערה: אל תתנו תאים לשבת בתוך המזרק עבור פרק זמן כלשהו או התאים יישב.
  3. צג העכברים שבועי על מנת להבטיח כי הם נשארים בריאים.
  4. לאחר 5 - 6 שבועות, לדמם העכברים כדי לבדוק הכינון מחדש על בסיס של GFP + / Ametrine + ו TCR שיתוף ביטוי (1B איור) 11.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

יעילות התמרה מח עצם נבדקת בשלב 13.3 של הפרוטוקול לפני במח העצם מוזרק לתוך iv וריד הזנב באיור התמרה מח עצם נציג (איור 1 א), כ -10 μl של מח העצם שנקטפו התווסף 100 μl של PBS ונותחו לביטוי Ametrine. בדרך כלל אחוז התאים החיוביים ניאון הוא בין 25% ל -70%, תלוי לבנות כייל retroviral. לאחר 6 שבועות הזרקת מח עצם, העכברים הם דממו לקבוע כינון מחדש מח עצם (איור 1B). כ 25 μl של דם ההיקפי היה lysed תאים אדומים מוכתמים אנטי TCRβ. באיור 2B כל התא החיובי TCR concordantly לבטא את חלבון פלואורסצנטי Ametrine.

איור 1
figuמחדש 1. דוגמא של תאי התמר מח עצם ו ההיקפי TCR Retrogenic T. א) תמרת יעילות של תאים במח עצם מנותח על בסיס בסמן פלורסנטי (Ametrine) ביום העברת מח עצם. כ -10 μl של מח העצם שנקטף התווסף 100 μl של PBS ונותח לביטוי Ametrine. התמר מח עצם מוצלח יניב אחוז התאים החיוביים ניאון בין 25% ל -70%. ב) דוגמא של תאי T retrogenic TCR בדם היקפי 6 שבועות לפרסם כינון מחדש מח עצם. דם היקפי הושג ותאי דם אדומים היו lysed עם חיץ תמוגה RBC. התאים הנותרים היו מוכתמים עבור TCRβ. ניתוח נציג לביטוי Ametrine ואנטי TCRβ מכתים 6 שבועות לפרסם כינון מחדש מח עצם. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של tדמותו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בפרוטוקול, אנו שלבים קריטיים מספר בפירוט כדי להבטיח בריאות מח עצם אופטימלית, יעילות תמרה והרכבתה מחדש. השלב הקריטי הראשון הוא הדור ותחזוקה ראויה של תאים המפיק ויראלי GP + E86. השתמש שורות תאי מפיק פרקים מוקדמות ולשמור על 80% confluency או נמוך לפני שימוש. בעת ביצוע תאים טריים מפיקים ויראלי GP + E86, להבטיח את תאי 293T נמצאים בשלבים מוקדמים מעבר וצומח בתרבות עבור 24 - 48 שעות. ציפוי יותר מדי תאי GP + E86 במהלך השלב התמר יפחית כייל נגיף. לקבוע כייל נגיף כמתואר הולסט et al. 11 על מנת להבטיח GP + E86 מפיק ויראלי חזק. בנוסף, הסרת תאי דם אדומים ממח העצם שנקטף משפרת את היעילות התמר. הבטחת בריאותם של אבות מח העצם היא קריטית להצלחה של הפרוטוקול. לשם כך, השתמש תמיד תקשורת טריה (פחות מ -4 שבועות 4 ° C לאחר השלים עם FCS) וציטוקינים טריים (פחותמ -2 שבועות כאשר כל הזמן ב 4 ° C). ברומיד Hexadimethrine הוא גם רגיש שפל צריך להיעשות טרי, ברגע שהוא נמצא פתרון, כל 2 חודשים. פרטים נוספים שיבטיחו בריאות התמרת מח עצם אופטימלית כוללים טרום ההתחממות בצנטריפוגה לפני התמר הספין. ספין-transduce על 37 מעלות צלזיוס ועוטפים צלחות בניילון נצמד כדי להפחית חילוף הגזים ככל האפשר. כמו כן, לא נותנים את מח העצם לשבת מחוץ לחממה 37 ° C או על קרח למשך פרקי זמן ארוכים כמו זה יגדיל מוות של תאים ולהקטין מח עצם התמרה והרכבתה מחדש. אחרי התאים במח העצם נקצרו ב יום 4 (שלב 13), רק לטעון את המזרקים מייד לפני הזרקת העכברים. לבסוף, להבטיח כי עכברים ממוקמות על אנטיביוטיקה יום לפני או יום ההקרנה.

ניצול של פרוטוקול התמר בתיווך retroviral זה מאפשר התמרה של ובתאים מח עצם וכתוצאה מכךהדור של עכברי retrogenic קולטן תא T. עכברי Retrogenic הם מהירים כדי ליצור מאשר עכברים מהונדסים TCR ועלות הרבה פחות מאשר יצירת מהונדס TCR יחיד. עם זאת, עכברי retrogenic לא ניתן התרבו חובה נוצרה מחדש עם כל ניסוי 10. מספר תאי T פריפריה נמוך בעכברי retrogenic מאשר לראות בעכברי TCR מהונדסים אולם הסדרת TCR ניתן להשוות בין TCR retrogenic ו TCR transgenics 10. מערכת retrogenic TCR מאפשרת לביטוי המרובה TCRs בתוך אותה המושבה ואפילו בתוך אותו הניסוי. ניצול פרוטוקול TCR retrogenic המתואר כאן מאפשר לחוקר לבחון ומסך בפיתוח פונקציונלי של כיתת MHC זיהתה לאחרונה רבי I או II TCRs מוגבל. עם התפתחותה של המודל "העכבר אנושי" 18,19, את retrogenic TCR יכול עוד להיות מורחב ניצול TCRs אדם משובט. בנוסף, 2A מקושר ג בונהלשמש גם כדי ללמוד-חלבונים אחרים רב לרבות רשתות CD3, אינטרלויקינים ואת הקולטנים אנטיגן chimeric 20-24.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מ- NIH (5K22A1119151-01 ו 1R56DK104903-01) כדי MLB, תוכנית פיילוט / היתכנות של המכון לחקר סכרת (P30-DK079638) ב BCM, JDRF 1-FAC-2014-243-AN APF, ADA 1-15-JF-07, קריירה AAI באימונולוגיה אחוות כדי מגה, רוברט וג'ניס מקניר קרן.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM, high glucose + glutamine Corning Cellgro 10-013-CV Dulbecco's Modification of Eagle's Medium with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate
FBS Atlanta Biological S11550
Trypsin-Versene Lonza 17-161F
0.45 µm syringe filter Thermo Scientific 194-2545
polybrene Sigma H9268-10G Sterile Filtered in dH2O
Ciprofloxacin  VWR AAJ61970-06
5-fluorouracil (5-FU) VWR AAA13456-06
Sodium Pyruvate Corning Cellgro 25-000-CI
MEM nonessential Amino Acids Corning Cellgro 25-025-CI
HEPES 1 M solution Corning Cellgro 25-060-CI
2-Mercaptoethanol Gibco by Life Technologies 21985-023
Pen/Strept Corning Cellgro 30-002-CI
L-glutamine Corning Cellgro 25-005-CI
150 mm tissue culture dishes Greiner Bio-one 639160
Tisue culture-treated 6-well flat plate Greiner Bio-one 657160
70 µm nylon cell strainers Falcon 352350
Mouse IL-3 Invitrogen PMC0033
Human IL-6 Invitrogen  PHC0063
Mouse Stem Cell Factor Invitrogen PMC2113L
10x PBS Corning Cellgro 46-D13-CM
HANKS Buffer Corning Cellgro 21020147
BD 10 ml Syringe BD 300912
BD 1 ml Syringe BD 309659
27 G x 1/2 BD Precision Glide Needle BD 305109
30 G x 1/2 BD Precision Glide Needle BD 305106

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Qi, Q., et al. Diversity and clonal selection in the human T-cell repertoire. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 13139-13144 (2014).
  2. Zarnitsyna, V. I., Evavold, B. D., Schoettle, L. N., Blattman, J. N., Antia, R. Estimating the diversity, completeness, and cross-reactivity of the T cell repertoire. Frontiers in immunology. 4, 485 (2013).
  3. Kisielow, P., Bluthmann, H., Staerz, U. D., Steinmetz, M., von Boehmer, H. Tolerance in T-cell-receptor transgenic mice involves deletion of nonmature CD4+8+ thymocytes. Nature. 333, 742-746 (1988).
  4. Hogquist, K. A., et al. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76, 17-27 (1994).
  5. Verdaguer, J., et al. Spontaneous autoimmune diabetes in monoclonal T cell nonobese diabetic mice. J Exp Med. 186, 1663-1676 (1997).
  6. Katz, J. D., Wang, B., Haskins, K., Benoist, C., Mathis, D. Following a diabetogenic T cell from genesis through pathogenesis. Cell. 74, 1089-1100 (1993).
  7. Pauza, M. E., et al. T-cell receptor transgenic response to an endogenous polymorphic autoantigen determines susceptibility to diabetes. Diabetes. 53, 978-988 (2004).
  8. Jasinski, J. M., et al. Transgenic insulin (B:9-23) T-cell receptor mice develop autoimmune diabetes dependent upon RAG genotype, H-2g7 homozygosity, and insulin 2 gene knockout. Diabetes. 55, 1978-1984 (2006).
  9. Kersh, G. J., et al. TCR transgenic mice in which usage of transgenic alpha- and beta-chains is highly dependent on the level of selecting ligand. Journal of immunology. 161, 585-593 (1998).
  10. Bettini, M. L., Bettini, M., Vignali, D. A. TCR retrogenic mice: A rapid, flexible alternative to TCR transgenic mice. Immunology. 136 (3), 265-272 (2012).
  11. Holst, J., et al. Generation of T-cell receptor retrogenic mice. Nat Protoc. 1, 406-417 (2006).
  12. Holst, J., Vignali, K. M., Burton, A. R., Vignali, D. A. Rapid analysis of T-cell selection in vivo using T cell-receptor retrogenic mice. Nat Methods. 3, 191-197 (2006).
  13. Bettini, M. L., Bettini, M., Nakayama, M., Guy, C. S., Vignali, D. A. Generation of T cell receptor-retrogenic mice: improved retroviral-mediated stem cell gene transfer. Nat Protoc. 8, 1837-1840 (2013).
  14. Donnelly, M. L., et al. Analysis of the aphthovirus 2A/2B polyprotein 'cleavage' mechanism indicates not a proteolytic reaction, but a novel translational effect: a putative ribosomal 'skip'. J Gen Virol. 82, 1013-1025 (2001).
  15. Atkins, J. F., et al. A case for "StopGo": reprogramming translation to augment codon meaning of GGN by promoting unconventional termination (Stop) after addition of glycine and then allowing continued translation (Go). RNA. 13, 803-810 (2007).
  16. Doronina, V. A., et al. Site-specific release of nascent chains from ribosomes at a sense codon. Mol Cell Biol. 28, 4227-4239 (2008).
  17. Bettini, M., et al. TCR affinity and tolerance mechanisms converge to shape T cell diabetogenic potential. Journal of immunology. 193, 571-579 (2014).
  18. Brehm, M. A., Wiles, M. V., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Generation of improved humanized mouse models for human infectious diseases. J Immunol Methods. 410, 3-17 (2014).
  19. Brehm, M. A., Shultz, L. D., Greiner, D. L. Humanized mouse models to study human diseases. Curr Opin Endocrinol Diabetes Obes. 17, 120-125 (2010).
  20. Chaplin, P. J., et al. Production of interleukin-12 as a self-processing 2A polypeptide. J Interferon Cytokine Res. 19, 235-241 (1999).
  21. Collison, L. W., et al. The inhibitory cytokine IL-35 contributes to regulatory T-cell function. Nature. 450, 566-569 (2007).
  22. Holst, J., et al. Scalable signaling mediated by T cell antigen receptor-CD3 ITAMs ensures effective negative selection and prevents autoimmunity. Nature immunology. 9, 658-666 (2008).
  23. Kalos, M., et al. T cells with chimeric antigen receptors have potent antitumor effects and can establish memory in patients with advanced leukemia. Sci Transl Med. 3, 95ra73 (2011).
  24. VanSeggelen, H., et al. T Cells Engineered With Chimeric Antigen Receptors Targeting NKG2D Ligands Display Lethal Toxicity in Mice. Mol Ther. 23, 1600-1610 (2015).

Tags

אימונולוגיה גיליון 113 קולטן תא T (TCR) סרן histocompatibility מורכבים (MHC) רטרו-וירוס מח עצם התמרה Retrogenic
Retroviral התמרה של ובתאים מח עצם כדי ליצור תאי T קולטן Retrogenic עכברים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lee, T., Shevchenko, I., Sprouse, M. … More

Lee, T., Shevchenko, I., Sprouse, M. L., Bettini, M., Bettini, M. L. Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice. J. Vis. Exp. (113), e54196, doi:10.3791/54196 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter