Introduction
Т - клеточного рецептора (TCR) репертуар людей и мышей оценивается в 1 х 10 8 и 2 х 10 6 уникальных ТКР соответственно 1,2. Это большое разнообразие позволяет Т-клетки распознавать широкий спектр антигенов эпитопов, полученных из самостоятельных пептидов, а также от патогенов, представленных главным комплексом гистосовместимости (MHC) на антиген-представляющих клеток (АРС). Незначительные различия в взаимодействиях ТКО с уникальными комплексами пептид-MHC диктуют, будет ли Т-клетки подвергаются апоптозу, анергии, активацию, дифференцировку, продукцию цитокинов или цитотоксичности. Тем не менее, из-за большого TCR репертуара, анализ того, как специфический ТКР будет реагировать на конкретный антиген требует использования одиночных систем TCR.
Различные TCR трансгенных мышей были получены с целью изучения функции единого TCR в естественных условиях в модели 3-9. Тем не менее, существует ряд предостережений к TCR трансгенных мышей, в том числестоимость, продолжительность времени для генерации одного трансгенной мыши , и так называемый эффект основателя случайного введения трансгена в зародышевой ДНК 10. Таким образом, относительно небольшое количество TCR трансгенных мышей были получены для любого данного антигена и функциональные последствия высокого и низкого сродства ТКР за тот же эпитоп, редко адресованный. Для того, чтобы удовлетворить потребность в быстром подходе к экрану и изучить несколько ТКО по отдельности или в комбинации, retrogenic ( 'ретро' от ретровируса и "генные" от трансгенных) мышей были использованы в качестве альтернативы TCR трансгенных мышей 11-13.
2A пептид консенсуса мотив, обнаруженный в течение нескольких вирусов состоят из 2A-Asp-Val / Ile-Перенасыщение-X-Asn-Pro-Gly-2B-Pro, в котором происходит расщепление между глицином 2А и пролин 2В из цис -Актерское гидролазы активности, что приводит к рибосомной пропуском при переводе 10,14-16. Для детального схему, изображающую Cleavage различных 2А пептидов (F2A, Е2А, T2A и P2A) см ссылок 10 - 12. Таким образом, 2 цистроны (TCR альфа и бета ТКР), могут быть связаны в результате стехиометрического трансляции в одном векторе. Используя этот подход, мы можем выразить и непосредственно сравнить несколько антиген - специфических ТКО в естественных условиях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Заявление по этике: Мы прилагаем все усилия , чтобы держать животных дискомфорт или стресс к минимуму во время облучения и хвостовой вены инъекций. Мыши используются в качестве источника клеток в этих экспериментах; как таковой, не существует никаких процедур или манипуляций, кроме эвтаназии. Мыши будут подвергнуты эвтаназии путем ингаляции СО 2 с последующим смещением шейных позвонков , чтобы подтвердить смерть. Эта процедура в соответствии с рекомендациями Группы по эвтаназии Американской ветеринарной медицинской ассоциации.
1. Подготовить Ретровирусное Построить
- Суб-клона Т-клеточного рецептора (TCR) альфа и бета цепи, разделенные 2А линкера, в MSCV на основе ретровируса 11 вектора (например, pMIAII или pMIGII) 11.
ПРИМЕЧАНИЕ: 2A линкер позволяет стехиометрического и согласующихся экспрессии альфа и бета-TCR цепочек из одной открытой рамки считывания. Вектор содержит флуоресцентный белок кассету IRES (аметрин или GFP), который используется дляотслеживать трансдуцированных клеток и эффективность трансдукции. Для детального протокола смотрите Холста и др. 11 - Изолировать плазмидной ДНК с использованием коммерчески полученного набора плазмы подготовительную или аналогичный продукт. Используйте рабочую концентрацию 1 - 2 мкг мкл -1.
2. Поколение ретровирусных Producer клеточных линий
- Используйте процесс двухступенчатого для получения ретровирусных линии производителя клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения подробного протокола, пожалуйста , смотрите Холста и др. 11.- Сформировать ретровируса путем временной трансфекции клеток 293Т с тремя плазмид (pVSVG, реч-Pam3 (-E) и вектор интереса 11) и возьмите ретровирусный супернатант из клеток 293Т для трансдукции экотропного ретровирусов линии производитель клеток GP + E86.
- Изолировать топ 40% флуоресцентных клеток, экспрессирующих производителей GP + E86 с помощью FACS и пропагандировать transdcuced-GP клеток-продуцентов + E86 в качестве источника вируса.
Примечание: Поколениепроизводителей с высоким титром имеет решающее значение для эффективной трансдукции клеток костного мозга. Для получения полного протокола пожалуйста , смотрите Холста и др. 11
3. ретровируса-опосредованной стволовых клеток Перенос генов (День -5)
- Оттаять и культура 0,5 -1,0 х 10 6 каждого производителя линии клеток GP + E86 в полной среде DMEM 10% (об / об) FBS , чтобы обеспечить достаточный рост для двух сливающихся 150-мм пластин день 0 этого протокола.
Примечание: Размораживание 0,5 - 1,0 х 10 6 каждого производителя линии клеток GP + E86 в 10 см планшете позволит 30 - 50% сплошности в День 5. Это также позволяет в течение 5 дней культуры , с тем чтобы расширить GP + E86 производитель клеточных линий до двух сливающихся 150-мм пластин на день 0.- Культура линии клеток ретровирусом производитель в полной тканевой культуральной среде, содержащей 5% сыворотки теленка Фета и ципрофлоксацин (10 мкг / мл), чтобы избежать загрязнения микоплазмы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Прекратите использование ципрофлоксацина при generatinг вирусный супернатант для трансдукции костного мозга. Избежать чрезмерного роста производителя клеточной линии, так как это негативно скажется эффективность трансдукции костного мозга.
- Культура линии клеток ретровирусом производитель в полной тканевой культуральной среде, содержащей 5% сыворотки теленка Фета и ципрофлоксацин (10 мкг / мл), чтобы избежать загрязнения микоплазмы.
4. Донорские Мыши INJECT с 5-фторурацилом (5-FU) (день -3)
- Взвесить донорной мыши (5 - 12 недель), чтобы определить количество 5-ФУ требуется. Используя мышей в возрасте до 5 недель результатов возраста с низким выходом костного мозга. Для того, чтобы обеспечить экспрессию одного TCR, использовать Т-клеточный дефицитный штамм мыши, такие как SCID, КГР или TCR альфа-дефицитных мышей в качестве доноров костного мозга.
- Работа в капот культуре ткани, разбавить запас 5-ФУ стерильной PBS для того , чтобы достаточное количество 10 мг мл -1 рабочий раствор 5-ФУ для доставки 0,15 мг 5-ФУ на грамм веса тела.
- С помощью 1 мл шприц с иглой 37 G, внутрибрюшинно вводят 0,15 мг 5-ФУ на грамм веса тела в мыши-донора.
Примечание: Используйте 1 мыши-донора на одного получателя, чтобы начать и корректироватьколичество мышей-доноров в соответствии с выходом клеток. Альтернативный метод лечения 5-FU для обогащения и выделения клеток - предшественников костного мозга негативной селекции линиджа положительных клеток , как это описано в Вирету и соавт.
5. костного мозга Процедура экстрагирования (день 0)
- Получить рассечение ножницами и щипцами для изоляции костей. Подготовка средств массовой информации (HBSS с добавкой 5% FCS (об / об)), чтобы собрать кости в 50 мл коническую пробирку. Держите 50 мл коническую, содержащий носитель на льду. Эвтаназии мышей CO 2 ингаляции с последующим смещением шейных позвонков , чтобы подтвердить смерть. Pinch лапу, чтобы гарантировать, что никакие рефлексы не обнаружены.
- Стерилизовать хирургический сайт и хирургические инструменты с этанолом или метанолом. Снимите бедра, голени, плечевой кости и тазового пояса тщательно сначала разрезанием и под тазового пояса. Вырезать вниз вдоль бедренной кости к большеберцовой кости. Удалить все окружающие ткани с помощью ножниц и щипцов, чтобы получить чистые кости. Держатькости гидратированные в HBSS + 5% (объем / объем) FBS.
- Отдельные кости путем разрезания на стыках, убедившись в том, чтобы сократить оба конца от каждой кости. Вставьте 25 калибра иглу, присоединенную к 10-мл шприц, содержащий HBSS + 5% (об / об) FBS. Надавите и промойте все костный мозг через 70-мкм сетчатый фильтр отдыхает в 50 мл коническую.
- Периодически толкать костный мозг через фильтр 70 мкм, используя поршень из 1 мл или 3 мл шприца. Промыть сетчатый фильтр с HBSS + 5% (об / об) FBS. Это обеспечит одноклеточной суспензии, которая не содержит фрагментов и костной ткани. Держите клетки стерильным, выполнив процедуру в стерильных капот.
- Центрифуга клетки костного мозга при 300 мкг в течение 10 мин при 4 ° С.
6. Культура костного мозга (день 0)
- Сцеживать или аспирата СМИ и ресуспендируют осадок клеток в 1 мл аммония на основе хлорида лизиса эритроцитов буфера (или буфера для лизиса эритроцитов эквивалент) в 50 мл коническую трубку. Через 1 мин инкубации при комнатнойтемпература, тушат буфером для лизиса эритроцитов путем добавления 10 мл полной среды DMEM 20% (об / об) FBS.
- Центрифуга клетки при 300 мкг в течение 10 мин при 4 ° С.
- Декантируют или аспирата супернатант и ресуспендируют костного мозга в 5 мл полной DMEM, 20% (об / об) FBS. Граф клеток с счетнокамерное Нойбауэра.
Примечание: Общий выход должен составлять приблизительно 5 - 10 × 10 6 клеток на мышь; Тем не менее, выход может меняться в зависимости от различных штаммов мышей. - Клетки Тарелка костного мозга при плотности 4 · 10 7 клеток на 150-мм пластины в 30 мл полной среды DMEM 20% (об / об) FBS , дополненной IL-3 (20 г мл - 1), IL-6 (50 г мл -1) и SCF (50 г мл -1).
Примечание: Используйте свеже оттаивают-аликвоты цитокины. Не следует использовать цитокины, которые были заморожены и разморожены более одного раза или выдерживали при 4 ° С в течение более 2-х недель. - Выдержите в костный мозг в течение ночи (приблизительно 24 ч) при температуре 37 ° С с 5% CO 2.
- Пластина 3 × 10 6 клетки - продуценты ретровирусов на 150-мм пластины в 18 мл полной DMEM , 20% (об / об) FBS.
- Выдержите ретровирусных клеток-продуцентов при 37 ° С в течение ночи. Предвидеть один 150-мм пластины для 15 миллионов клеток костного мозга (около 2 - 3 мышей-доноров).
8. Ретровирусное Супернатант (день 1)
- На следующий день (примерно 24 часа позже), урожай ретровирусный супернатант от производителя пластин (созданных на шаге 7) путем составления ретровирусный супернатант прямо с 150-мм пластины с 10-мл шприц и фильтр с использованием 0,45 -μm шприц фильтр.
- Тщательно заменить снятую ретровирусный супернатант с 18 мл свежей полной среды DMEM 20% (об / об) FBS.
- Дополнение отфильтрованный ретровирусный супернатант с IL-3 (20 г мл -1), IL-6 (50 г мл -1), Mscf (50 г мл -1) и полибрен (Полибрен) (6 &# 956; г мл -1).
Примечание: бромид Hexadimethrine следует свежий каждые 2 месяца, чтобы избежать снижения эффективности ретровирусной трансдукции.
9. костного мозга Харвест (день 1)
- После завершения этапа 8.3, сбора клеток костного мозга от стадии 6.4 и передавать носители, содержащие не-адгезивные клетки в стерильные 50-мл пробирки.
- Промыть пластины энергично с 10 мл PBS и собирают в 50 мл коническую с шага 9.1. При необходимости повторите операцию стирки.
- Центрифуга клетки при 300 мкг в течение 10 мин при температуре 4 ° С, сливают супернатант, ресуспендируют клетки в малом объеме (1 - 3 мл) полная DMEM 20% (об / об) FBS, и рассчитывать. Предвидеть 50 - восстановление 75% по сравнению с днем 0. Ресуспендируют костного мозга на 1 × 10 6 клеток на 1 мл ретровирусного супернатанта , содержащего цитокины и бромид Hexadimethrine.
10. Костный мозг Трансдукция (день 1)
- Пластина ретровирусный надосадочную / костную маrrow смесь в объеме 3 мл на лунку в шести-луночный планшет для тканевых культур с. Оберните пластин в полиэтиленовую пленку, чтобы свести к минимуму газообмен во время центрифугирования на этапе 10.2.
- Спин обернутые шесть-луночные планшеты при 1000 х г в течение 60 мин 37 ° C.
- После того , как спина завершена, удалите пластиковую пленку и поместите планшеты в инкубаторе 37 ° C CO 2 в течение 24 ч.
11. Ретровирусное Супернатант и трансдукция (2-й день)
- Через 24 часа собирают свежий вирусный супернатант из вирусного линии производитель клеток. Фильтр ретровирусный супернатант с использованием 10-мл шприц и шприц-фильтр с размером пор 0,45 мкм. Дополнение отфильтрованный ретровирусный супернатант с IL-3 (20 г мл -1), IL-6 (50 г мл -1) и SCF (50 г мл -1) и полибрен (6 г мл -1).
- Затем, осторожно снимите с пипеткой или аспирата верхние 2 мл среды из каждой лунки шесть-луночного планшета, содержащую клетки костного мозга,
Примечание: Работа осторожно, чтобы не аспирата костный мозг, который, как правило, концентрируется в середине скважины. В качестве альтернативы, удаляют супернатант можно прясть вниз, чтобы восстановить все потерянные клетки костного мозга. - В каждую лунку в костном мозге 6-луночного планшета добавляют 3 мл свежей вирусных супернатанта, содержащего цитокины и бромид Hexadimethrine. Оберните пластин в пластмассе, и повторить спиновый трансдукции при 1000 мкг в течение 60 мин 37 ° C. Берем пластины и инкубировать клетки при 37 ° С и 5% CO 2 в течение ночи (около 24 ч).
12. Добавление свежего дополненной DMEM (3-й день)
- Через 24 часа, удалить верхние 2 мл среды из каждой лунки шесть-луночного планшета, содержащего клетки костного мозга, а на шаге 11.2. Заменить вынутый носитель со свежей DMEM 20% (объем / объем) FBS , дополненной конечной концентрации IL-3 (20 г мл -1), IL-6 (50 г мл -1) и СКФ (50 г мл -1) ,
- Выдержите костный мозгпластин при 37 ° С СО 2 инкубаторе в течение еще 24 ч.
13. Урожай трансдуцированных костного мозга (4-й день)
- Через 24 часа собирают клетки костного мозга из шести-луночных планшетах. Промыть пластины энергично с PBS, чтобы удалить все, не прилипшие клетки.
- Центрифуга клетки при 300 мкг в течение 10 мин при 4 ° С и декантируют супернатант.
- Ресуспендируют костный мозг в небольшом объеме (1 мл) PBS + 0,5% (об / об) инактивированной нагреванием FBS. Сохранить клетки на льду.
- В 10 мкл пробы каждого состояния костного мозга и подсчет клеток с использованием счетной камере Neubauer. Если предположить , 1 - 2 донора на получателя, то выход будет достаточно для передачи по меньшей мере 4 х 10 6 клеток на мышь - реципиента. Ресуспендируют костный мозг в достаточном объеме PBS + 0,5% (об / об) инактивированной нагреванием FBS, чтобы впрыснуть 200 - 300 мкл на мышь.
- Вводят по меньшей мере , 2 х 10 6 клеток с эффективностью трансдукции25% (может вводить до 8 x10 6 клеток) на мышь внутривенно.
Примечание: Мы обычно вводят пять мышей-реципиентов за две 6-луночные планшеты клеток костного мозга. Если выход существенно ниже, больше мышей-доноров следует использовать до тех пор, достаточное количество костного мозга не может быть получен. Для достижения оптимального реконструирование, по крайней мере , 5 х 10 5 трансдуцированных (флуоресцентный положительный) должен быть введен в каждого получателя.
- Вводят по меньшей мере , 2 х 10 6 клеток с эффективностью трансдукции25% (может вводить до 8 x10 6 клеток) на мышь внутривенно.
- С помощью микро - дозаторов, возьмите 10-мкл образец каждого состояния костного мозга и анализировать эффективность трансдукции с помощью проточной цитометрии , основанный на экспрессии флуоресцентным маркером (рис 1А) 11.
Примечание: Как правило, процент флуоресцентных положительных клеток составляет от 25% до 70%, в зависимости от конструкции и ретровирусов титра. Число трансдуцированных клеток костного мозга необходимо восстановить суб-летально облучать мыши могут варьироваться в зависимости от эффективности трансдукции. Чем ниже TranЭффективность sduction, клетки костного мозга более требуется, и наоборот, чем выше эффективность трансдукции костного мозга, тем меньше количество клеток, необходимое для восстановления. эффективность трансдукции ниже 25% является неоптимальным и может привести к недостаточному восстановления и выживания. Для обеспечения оптимальной кости восстановления мозга и эффективность трансдукции, используют свежеприготовленные культуры тканей и цитокины. При экспрессии нового TCR использованием retrogenic системы, выбор этого TCR в естественных условиях неизвестна. В зависимости от каждого конкретного сродством ТКР, выбор ТКС в тимусе и экспрессии периферических Т - клеток будет варьироваться в 17.
14. Мышь Облучение, костного мозга для инъекций и уход
- Облучают мышей день до инъекции костного мозга (в тот же день, как шаг 13). Используйте следующие дозы: мышей C57BL / 6 (и другие штаммы дикого типа), 900 РАУ; RAG1 - / - мышей, 500 РАУ; SCID мышей, 300 РАУ).
- Мыши-реципиенты место на амоксициллин (50 мг / кг / день) или другой антибиотик для обработки воды перед облучением, и держать на антибиотики в течение первых двух недель после инъекции костного мозга.
Примечание: Оптимальная доза облучения может должны быть определены эмпирически.
- Мыши-реципиенты место на амоксициллин (50 мг / кг / день) или другой антибиотик для обработки воды перед облучением, и держать на антибиотики в течение первых двух недель после инъекции костного мозга.
- Для инъекций, загрузите клетки из стадии 13.1 в 1 мл шприц с использованием тупых игл непосредственно перед инъекцией, а затем изменить иглу 27-калибровочный для инъекций, удаления следов воздуха, чтобы избежать воздушной эмболии. Тепловые мыши под нагревательной лампой и вводят 0,2 мл костного мозга на мышь внутривенно.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не позволяйте клетки сидеть в шприце для любого отрезка времени или клетки оседают. - Монитор мышей еженедельно, чтобы гарантировать, что они остаются здоровыми.
- Через 5 - 6 недель, кровь мышей , чтобы проверить для восстановления на основе GFP + / + Аметрин и ТКС коэкспрессией (Фигура 1В) 11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Костный эффективность трансдукции мозг проверяется на шаге 13.3 протокола до того , как костный мозг вводят в хвостовую вену внутривенно в Репрезентативный костного мозга трансдукции рисунок (фиг.1А), приблизительно в 10 мкл убранной костного мозга добавляли к 100-мкл PBS и анализировали на экспрессию аметрин. Как правило, процент флуоресцентных положительных клеток составляет от 25% до 70%, в зависимости от конструкции и ретровирусов титра. Через 6 недель после инъекции костного мозга мышей брали кровь для определения костного мозга восстановление (Рисунок 1В). Примерно 25 мкл периферической крови красных клеток лизируют и окрашивали анти-TCR & beta;. На рисунке 2B все TCR положительных клеток конкордантно экспрессию белка аметрин флуоресцентный.
FIGUповторное 1. Пример костного мозга и периферической Transduction TCR Retrogenic Т - клеток. А) трансдукции эффективности клеток костного мозга анализироваться на основе флуоресцентного маркера (Аметрин) на день передачи костного мозга. Примерно 10-мкл убранной костного мозга добавляли к 100-мкл PBS и анализировали на экспрессию аметрин. Успешное трансдукции костный мозг даст процент флуоресцентных положительных клеток в диапазоне от 25% до 70%. В) Пример TCR retrogenic Т - клеток в периферической крови через 6 недель после костного мозга реконструирование. Периферическая кровь получали и красные кровяные клетки лизируют с буфером для лизиса эритроцитов. Остальные клетки окрашивали для TCR & beta. Представитель анализ экспрессии аметрин и анти-TCR & beta ; окрашивание через 6 недель после воссоздания костного мозга. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть большую версию тего фигура.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В протоколе, мы подробно несколько важных шагов для обеспечения оптимального здоровья костного мозга, эффективность трансдукции и восстановления. Первый важный шаг является формирование и надлежащее обслуживание клеток вирусный производителей GP + E86. Используйте ранние прохождение клеточных линий производителей и поддерживать на 80% сплошности или ниже до использования. При создании свежих клеток вирусных производителей GP + E86, убедитесь, что 293T клетки рано проход и продолжает расти в культуре в течение 24 - 48 часов. Покрытие слишком много клеток GP + E86 во время стадии трансдукции будет снижать титр вируса. Определить титр вируса , как описано в Холста и др. 11 , чтобы обеспечить GP + E86 являются надежные вирусные производители. Кроме того, удаление красных кровяных клеток из заготовленной костного мозга повышает эффективность трансдукции. Обеспечение здоровья прародителей костного мозга имеет решающее значение для успеха протокола. С этой целью, всегда используйте свежие средства массовой информации (менее 4 недель при температуре 4 ° С после того, дополненной FCS) и свежие цитокины (менеечем через 2 недели при хранении при 4 ° С). Полибрен также чувствителен к деградации и должны быть сделаны свежие, как только он находится в растворе, каждые 2 месяца. Другие детали, которые обеспечат оптимальное здоровье костного мозга и трансдукции включают предварительного нагрева центрифугу перед спиновой трансдукции. Спин-трансдукции при температуре 37 ° С и обернуть пластины с полиэтиленовой пленкой, чтобы уменьшить газообмен в максимально возможной степени. Кроме того, не давайте костный мозг сидеть снаружи инкубатора 37 ° С или на льду в течение длительных периодов времени, так как это увеличит гибель клеток и уменьшающих костного мозга трансдукции и восстановления. После того, как клетки костного мозга, которые были собраны в 4-й день (этап 13), загружать только шприцы непосредственно перед инъекцией мышам. И, наконец, убедитесь, что мышей помещают на антибиотики за день до или в день облучения.
Использование данного ретровируса опосредованной протокола трансдукции позволяет трансдукции клеток-предшественников костного мозга, что приводит кгенерация retrogenic мышей Т-клеточного рецептора. Retrogenic мыши быстрее, чем генерировать TCR трансгенных мышей и стоимость значительно меньше, чем создание единого TCR трансгенным. Однако retrogenic мышей не могут быть выращены и должны генерироваться заново с каждым экспериментом 10. Число периферических Т - клеток ниже , в retrogenic мышей , чем видели в TCR трансгенных мышей , однако регуляция TCR сравнима между TCR retrogenic и TCR трансгенов 10. Retrogenic система ТКС позволяет экспрессию нескольких ТКР в пределах той же колонии, и даже в том же самом эксперименте. Используя retrogenic протокол TCR, описанный здесь, позволяет следователю для проверки и трафаретная разработки и функциональность многочисленных вновь выявленных MHC класса I или II ограничил ТКО. С развитием модели 18,19 "гуманизированный мышь", то retrogenic ТКС далее может быть расширен с использованием клонированных человеческих ТКО. Кроме того, 2А связаны конструктов Cтакже использоваться для изучения других многофункциональных белков , включая цепочки CD3, интерлейкины и химерных рецепторов антигенов 20-24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантами NIH (5K22A1119151-01 и 1R56DK104903-01) в MLB, Pilot / Технико-экономическое Программы научно-исследовательского центра диабета (P30-DK079638) в BCM, JDRF 1-FAC-2014-243-AN ФПА, ADA 1-15-JF-07, AAI Карьера в Immunology Товарищество с МБ, а Роберт и Дженис Макнейр Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM, high glucose + glutamine | Corning Cellgro | 10-013-CV | Dulbecco's Modification of Eagle's Medium with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate |
| FBS | Atlanta Biological | S11550 | |
| Trypsin-Versene | Lonza | 17-161F | |
| 0.45 µm syringe filter | Thermo Scientific | 194-2545 | |
| polybrene | Sigma | H9268-10G | Sterile Filtered in dH2O |
| Ciprofloxacin | VWR | AAJ61970-06 | |
| 5-fluorouracil (5-FU) | VWR | AAA13456-06 | |
| Sodium Pyruvate | Corning Cellgro | 25-000-CI | |
| MEM nonessential Amino Acids | Corning Cellgro | 25-025-CI | |
| HEPES 1 M solution | Corning Cellgro | 25-060-CI | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco by Life Technologies | 21985-023 | |
| Pen/Strept | Corning Cellgro | 30-002-CI | |
| L-glutamine | Corning Cellgro | 25-005-CI | |
| 150 mm tissue culture dishes | Greiner Bio-one | 639160 | |
| Tisue culture-treated 6-well flat plate | Greiner Bio-one | 657160 | |
| 70 µm nylon cell strainers | Falcon | 352350 | |
| Mouse IL-3 | Invitrogen | PMC0033 | |
| Human IL-6 | Invitrogen | PHC0063 | |
| Mouse Stem Cell Factor | Invitrogen | PMC2113L | |
| 10x PBS | Corning Cellgro | 46-D13-CM | |
| HANKS Buffer | Corning Cellgro | 21020147 | |
| BD 10 ml Syringe | BD | 300912 | |
| BD 1 ml Syringe | BD | 309659 | |
| 27 G x 1/2 BD Precision Glide Needle | BD | 305109 | |
| 30 G x 1/2 BD Precision Glide Needle | BD | 305106 |
References
- Qi, Q., et al. Diversity and clonal selection in the human T-cell repertoire. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 13139-13144 (2014).
- Zarnitsyna, V. I., Evavold, B. D., Schoettle, L. N., Blattman, J. N., Antia, R. Estimating the diversity, completeness, and cross-reactivity of the T cell repertoire. Frontiers in immunology. 4, 485 (2013).
- Kisielow, P., Bluthmann, H., Staerz, U. D., Steinmetz, M., von Boehmer, H. Tolerance in T-cell-receptor transgenic mice involves deletion of nonmature CD4+8+ thymocytes. Nature. 333, 742-746 (1988).
- Hogquist, K. A., et al. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76, 17-27 (1994).
- Verdaguer, J., et al. Spontaneous autoimmune diabetes in monoclonal T cell nonobese diabetic mice. J Exp Med. 186, 1663-1676 (1997).
- Katz, J. D., Wang, B., Haskins, K., Benoist, C., Mathis, D. Following a diabetogenic T cell from genesis through pathogenesis. Cell. 74, 1089-1100 (1993).
- Pauza, M. E., et al. T-cell receptor transgenic response to an endogenous polymorphic autoantigen determines susceptibility to diabetes. Diabetes. 53, 978-988 (2004).
- Jasinski, J. M., et al. Transgenic insulin (B:9-23) T-cell receptor mice develop autoimmune diabetes dependent upon RAG genotype, H-2g7 homozygosity, and insulin 2 gene knockout. Diabetes. 55, 1978-1984 (2006).
- Kersh, G. J., et al. TCR transgenic mice in which usage of transgenic alpha- and beta-chains is highly dependent on the level of selecting ligand. Journal of immunology. 161, 585-593 (1998).
- Bettini, M. L., Bettini, M., Vignali, D. A. TCR retrogenic mice: A rapid, flexible alternative to TCR transgenic mice. Immunology. 136 (3), 265-272 (2012).
- Holst, J., et al. Generation of T-cell receptor retrogenic mice. Nat Protoc. 1, 406-417 (2006).
- Holst, J., Vignali, K. M., Burton, A. R., Vignali, D. A. Rapid analysis of T-cell selection in vivo using T cell-receptor retrogenic mice. Nat Methods. 3, 191-197 (2006).
- Bettini, M. L., Bettini, M., Nakayama, M., Guy, C. S., Vignali, D. A. Generation of T cell receptor-retrogenic mice: improved retroviral-mediated stem cell gene transfer. Nat Protoc. 8, 1837-1840 (2013).
- Donnelly, M. L., et al. Analysis of the aphthovirus 2A/2B polyprotein 'cleavage' mechanism indicates not a proteolytic reaction, but a novel translational effect: a putative ribosomal 'skip'. J Gen Virol. 82, 1013-1025 (2001).
- Atkins, J. F., et al. A case for "StopGo": reprogramming translation to augment codon meaning of GGN by promoting unconventional termination (Stop) after addition of glycine and then allowing continued translation (Go). RNA. 13, 803-810 (2007).
- Doronina, V. A., et al. Site-specific release of nascent chains from ribosomes at a sense codon. Mol Cell Biol. 28, 4227-4239 (2008).
- Bettini, M., et al. TCR affinity and tolerance mechanisms converge to shape T cell diabetogenic potential. Journal of immunology. 193, 571-579 (2014).
- Brehm, M. A., Wiles, M. V., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Generation of improved humanized mouse models for human infectious diseases. J Immunol Methods. 410, 3-17 (2014).
- Brehm, M. A., Shultz, L. D., Greiner, D. L. Humanized mouse models to study human diseases. Curr Opin Endocrinol Diabetes Obes. 17, 120-125 (2010).
- Chaplin, P. J., et al. Production of interleukin-12 as a self-processing 2A polypeptide. J Interferon Cytokine Res. 19, 235-241 (1999).
- Collison, L. W., et al. The inhibitory cytokine IL-35 contributes to regulatory T-cell function. Nature. 450, 566-569 (2007).
- Holst, J., et al. Scalable signaling mediated by T cell antigen receptor-CD3 ITAMs ensures effective negative selection and prevents autoimmunity. Nature immunology. 9, 658-666 (2008).
- Kalos, M., et al. T cells with chimeric antigen receptors have potent antitumor effects and can establish memory in patients with advanced leukemia. Sci Transl Med. 3, 95ra73 (2011).
- VanSeggelen, H., et al. T Cells Engineered With Chimeric Antigen Receptors Targeting NKG2D Ligands Display Lethal Toxicity in Mice. Mol Ther. 23, 1600-1610 (2015).
