Dosage de Adhérence Sous contrainte de cisaillement pour l'étude des lymphocytes T-Adhesion Molecule Interactions
Summary
Ce test d'adhésion de flux fournit un modèle d'impact simple, élevé d'interactions cellulaires de cellules épithéliales T. Une pompe à seringue est utilisée pour générer une contrainte de cisaillement, et la microscopie confocale capture des images pour la quantification. Le but de ces études est de quantifier efficacement l'adhérence des cellules T en utilisant des conditions d'écoulement.
Abstract
Dans l'ensemble, l'adhérence des cellules T est une composante essentielle de la fonction, ce qui contribue aux processus distincts de recrutement cellulaire à des sites d'inflammation et de l'interaction avec les cellules présentatrices d'antigènes (APC) dans la formation des synapses immunologiques. Ces deux contextes de T adhésion cellulaire diffèrent en ce que T interactions cellule-APC peuvent être considérés comme statique, alors que les interactions des vaisseaux cellules T dans le sang sont contestées par la contrainte de cisaillement générée par la circulation elle-même. les interactions cellule T-APC sont classés comme statique en ce que les deux partenaires cellulaires sont statiques par rapport à l'autre. En règle générale, cette interaction se produit dans les ganglions lymphatiques. Comme une cellule T interagit avec la paroi du vaisseau sanguin, les cellules arrêtent et doivent résister à la contrainte de cisaillement générée. 1,2 Ces différences mettent en évidence la nécessité de mieux comprendre l' adhérence statique et l' adhérence dans des conditions d'écoulement comme deux processus réglementaires distincts. La régulation de T adhérence cellulaire peut être très succinctement décrit comme conpêche à la traîne de l'état de molécules d'intégrine exprimées sur la surface cellulaire, et régulant ainsi l'interaction des intégrines avec les ligands de molécules d'adhérence exprimées à la surface de la cellule d'interaction d'affinité. Notre compréhension actuelle de la réglementation des intégrines états d'affinité provient souvent simpliste dans des systèmes modèles in vitro. L'essai d'adhérence en utilisant des conditions d'écoulement décrites ici permet la visualisation et la quantification précise des interactions cellulaires de cellules épithéliales T en temps réel, suite à un stimulus. Une adhérence sous test d'écoulement peut être appliqué à l'étude de l'adhérence de signalisation au sein des cellules T après un traitement avec des substances inhibitrices ou stimulateurs. De plus, ce dosage peut être étendu au-delà de la signalisation des cellules T à une population leucocytaire adhésif et une paire quelconque d'une molécule d'intégrine-adhérence.
Introduction
Adhérence des lymphocytes T médiatise un certain nombre de processus distincts dans un système immunitaire sain, 3 jouant un rôle essentiel dans le trafic des lymphocytes T et la présentation de l' antigène. Que ce soit lors de la surveillance immune ou une réponse immunitaire active ces deux tâches d'adhérence sont critiques. 4 Les événements de signalisation physiologiques des interactions cellulaires de cellules endothéliales T sont distinctes des cellules T cellule présentatrice d' antigène (APC) des interactions, et donc nécessitent des méthodes distinctes de étude pour comprendre mieux les cascades de signalisation impliquées. L'adhérence ferme d'une cellule T à une paroi du vaisseau sanguin pendant l'extravasation des lymphocytes nécessite une activation rapide et dynamique intégrine. L'interaction étroite entre une intégrine et d' adhérence des molécules d'État actifs le long de l'endothélium conduit à résistant à l'écoulement du sang adhérence, qui permet aux cellules T à ramper le long de la surface à la recherche d'une zone permissive au passage cellulaire. 5 L'exploration d'un bi cellulaire T -directionally alonga paroi du vaisseau sanguin est tributaire de l' adhésion polarisée, avec une extrémité avant adhésive distincte de la cellule T. 6 Plus important encore , l' adhésion ferme et la transmigration exigent une résistance à la force de cisaillement générée par la circulation du flux sanguin.
Lors de la conception des expériences pour étudier l'adhérence des lymphocytes, l'attention devrait être accordée à la relance d'intérêt spécifique. Bien que l'activation des intégrines est un composant commun et critique de toutes les formes de T adhésion cellulaire, les cascades d'activation sont susceptibles d'être unique en aval des récepteurs individuels et co-récepteurs. De même, les paires d'intégrine et la molécule d'adhésion en fonction des micro-environnements spécialisés et sur des sous-populations spécifiques. De cette façon, ces paires peuvent être réglées différemment. Le modèle présenté ici est idéal pour l'étude des cascades conduisant à l' activation qui se déroule dans des conditions de contrainte de cisaillement intégrine de signalisation. 7 Ces interactions ne peuvent être compris de manière adéquate dans un ADHESI statiquesur le système en raison de l'impact a été démontré que ces forces d'avoir directement sur le comportement des cellules T. 8 Bien que présenté ici avec des cellules T et CHO (ovaire de hamster chinois) , les cellules modifiées pour exprimer (cellules CHO-ICAM) ICAM-1 humain , le système peut facilement être modifié pour étudier différentes populations leucocytaires ou des molécules d'adhésion.
Cet essai fournit un procédé pour quantifier adhésivité des cellules T et l'activation de l'intégrine en utilisant une contrainte de cisaillement, en fournissant un modèle pour la phase solide d'adhérence de leucocyte extravasation. Grâce à l'utilisation de cellules CHO-ICAM l'affinité de LFA-1 pour son ligand dans les cellules vivantes peuvent être examinées en temps réel en réponse à divers stimuli d'intérêt. Cette technique nécessite facilement obtenu, disponibles dans le commerce des chambres micro-flux en combinaison avec une pompe seringue, grandement simplifier l'équipement nécessaire pour modéliser le flux sanguin et la contrainte de cisaillement par rapport aux autres modèles. 9 Un autre avantage majeur de cette analyse est que la signalisation spécifiquecascades et l'état d'activation résultant des intégrines individuelles peuvent être étudiées proprement grâce à l'utilisation de cellules CHO modifiées exprimant des molécules d'adhésion humaines d'intérêt. En outre, la combinaison des données quantitatives avec l'imagerie des cellules vivantes est un avantage important de cette méthode. Dans l'ensemble, tandis qu'un certain nombre d'essais de statique adhérence des cellules T ont été décrit que bien modéliser les interactions des cellules T-APC, ces modèles ne sont pas suffisantes pour capturer le processus dynamique de T adhérence de cellules épithéliales. Pour cette raison, lors du choix d'un test d'adhérence du stimulus en question doit être envisagée.
Protocol
Representative Results
Discussion
Afin d'analyser correctement T l' adhésion cellulaire, le stimulant à inclure dans l'étude doit être pris en compte lors du choix d' une méthode in vitro. Bien qu'il existe plusieurs tests pour étudier les signaux menant à LFA-1 activation et ICAM-1 liant toutes les méthodes ne sont pas interchangeables. Un essai d'adhérence statique 10 est le mieux adapté pour étudier les interactions des cellules T-APC; En variante, le procédé de la contrainte de cisaillement d?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The Rheumatology Research Foundation and the Hirschil Trust supported this work.
Materials
| T cell samples (cell line or primary) | ATCC | TIB-152 | Peripheral human T cells |
| CHO-ICAM-1 cells | ATCC | CRL-2093 | |
| µ-Slide VI 0.4 ibiTreat | ibidi | 80606 | |
| 500 ml glass bottle | Fisher | FB800500 | |
| 250 ml glass bottle | Fisher | FB800250 | |
| Silicone tubing 0.8 mm | ibidi | 10841 | |
| Confocal microscope with incubator chamber | Ziess | 700 | Any wide field fluorescent microscope |
| Syringe pump | New Era Pump Systems | NE-300 | |
| 60 ml syringe | BD | 309653 | |
| CFSE | eBioscience | 65-0850 | |
| SDF-1α | R&D | 350-NS-010/CF | |
| RPMI | Lonza | 12-702F/12 | |
| PBS | Lonza | 17-516F | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| D-Glucose | Sigma Aldrich | G8270 | |
| PMA | Sigma Aldrich | 16561-29-8 | |
| Volocity software | Perkin Elmer | Version 6.2.1 | |
| ImageJ software | NIH | Version 1.48V | |
| Tissue-culture treated culture dishes | Falcon | 353003 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) Phenol Red | Gibco | 25200114 | |
| Heat Inactivated FBS | Denville | FB5001-H | |
| Penicillin/Streptomycin | Fisher | BP295950 |
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