Este ensaio de adesão fluxo fornece um modelo de impacto simples, alta de interações celulares de células-epitelial T. Uma bomba de seringa é utilizado para gerar a tensão de corte, e microscopia confocal captura imagens para efeitos de quantificação. O objectivo destes estudos é o de quantificar eficazmente a adesão de células T utilizando condições de fluxo.
Em geral, a adesão de células T é um componente crítico da função, contribuir para os processos distintos de recrutamento celular para os locais de inflamação e a interacção com as células apresentadoras de antigénio (APC), na formação de sinapses imunológicas. Estes dois contextos de adesão celular T diferem em que T interações célula-APC pode ser considerado estático, enquanto interações dos vasos células T no sangue são desafiados pela tensão de cisalhamento gerada pela própria circulação. interacções célula T-APC são classificados como estático em que os dois parceiros celulares são estáticos em relação ao outro. Normalmente, esta interacção ocorre dentro dos nódulos linfáticos. Como uma célula T interage com a parede do vaso sanguíneo, as células de prender e devem resistir à tensão de cisalhamento gerada. 1,2 Estas diferenças evidenciam a necessidade de compreender melhor a aderência estática e a aderência em condições de escoamento como dois processos reguladores distintos. A regulação da adesão das células T pode ser sucintamente descrito como conpesca à linha do estado de afinidade de integrina moléculas expressas na superfície da célula, e regulando assim a interacção de integrinas com os ligandos da molécula de adesão expressas na superfície da célula que interage. A nossa compreensão atual da regulação dos estados afinidade para a integrina vem muitas vezes simplista em sistemas modelo in vitro. O ensaio de adesão usando condições de fluxo descritos aqui permite a visualização e a quantificação precisa de interacções celulares de células-T epitelial em tempo real, na sequência de um estímulo. Uma adesão sujeito ao ensaio de fluxo pode ser aplicado a estudos de adesão de sinalização nas células T, após o tratamento com substâncias inibidoras ou estimuladores. Além disso, este ensaio pode ser expandido para além de sinalização de células T para qualquer população de leucócitos adesivo e qualquer integrina-molécula de adesão par.
T medeia a adesão de linfócitos de um número de processos diferentes, em um sistema imunitário saudável, 3 desempenhando papéis críticos no tráfico de células T e a apresentação do antigénio. Se durante a vigilância imunitária ou uma resposta imunitária activa estas duas grandes funções de adesão são críticos. 4 Os eventos de sinalização fisiológicos de interacções de células de células do endotélio T são distintos de células T-célula que apresenta antigénios (APC) interacções, e, portanto, requerem métodos distintos de estudo para melhor compreender as cascatas de sinalização envolvidos. A adesão firme de uma célula T a uma parede do vaso sanguíneo durante o extravasamento de linfócitos requer activação rápida e dinâmica integrina. A interacção estreita entre uma integrina e adesão activas moléculas de estado ao longo do endotélio leva a aderência resistente ao fluxo de sangue, permitindo que as células T para rastrear ao longo da superfície em busca de uma área permissiva para a passagem de células. 5 O rastreamento de um bi células T -directionally Alonda parede do vaso sanguíneo GA é dependentes de adesão polarizada, com uma extremidade dianteira adesiva distinta da célula T. 6 Mais importante ainda, a adesão e transmigração firme requerem resistência à força de corte gerada pela circulação de fluxo sanguíneo.
Ao projetar experimentos para estudar a adesão de linfócitos, deve ser dada atenção ao estímulo específico de interesse. Enquanto a activação de integrina é um componente comum e crítica de todas as formas de adesão das células T, as cascatas de activação são susceptíveis de ser único a jusante dos receptores individuais e co-receptores. Do mesmo modo, pares de integrina e molécula de adesão funcionam em microambientes especializados e em subpopulações específicas. Desta forma, estes pares podem ser regulados de forma bastante diferente. O modelo aqui apresentado é ideal para o estudo da cascata de sinalização que levam à integrina ativação ocorrendo em condições de tensão de cisalhamento. 7 Essas interações não podem ser adequadamente compreendidas em um ADHESI estáticano sistema devido ao impacto ter sido mostrado que estas forças têm directamente no comportamento das células T. 8 Embora apresentado aqui com as células T e as células CHO (Ovário de Hamster Chinês) manipuladas para expressar (células CHO-ICAM) humano ICAM-1, o sistema pode facilmente ser modificado para estudar diferentes populações de leucócitos ou moléculas de adesão.
Este ensaio proporciona um método para quantificar a aderência de células T e a activação da integrina utilizando tensão de corte, fornecendo um modelo para a fase de adesão firme dos leucócitos extravasamento. Através da utilização de células CHO-ICAM a afinidade de LFA-1 para o seu ligando em células vivas pode ser examinada em tempo real, em resposta a vários estímulos de interesse. Esta técnica requer facilmente obtida, câmaras de micro-fluxo disponíveis comercialmente em combinação com uma bomba de seringa, o que simplifica grandemente o equipamento necessário para modelar o fluxo sanguíneo e tensão de cisalhamento, em comparação com outros modelos. 9 Uma outra vantagem principal deste ensaio é que a sinalização específicacascatas e do estado de activação das integrinas resultante individuais podem ser estudados de forma limpa através da utilização de células CHO modificadas que expressam moléculas de adesão humanos de interesse. Além disso, a combinação dos dados quantitativos com imagem de células vivas é uma vantagem significativa do presente método. Em geral, embora um certo número de ensaios de adesão de células T estática ter sido descrito que bem modelar as interacções célula T-APC, estes modelos são insuficientes na captura do processo dinâmico de adesão celular epitelial-T. Por este motivo, quando a escolha de um ensaio de adesão do estímulo em questão deve ser considerado.
A fim de analisar adequadamente a adesão de células T, o estimulante seja incluída no estudo deve ser considerado na escolha de um método in vitro. Embora existam vários ensaios para estudar os sinais que conduzem a LFA-1 e ICAM-activação uma ligação todos os métodos não são intercambiáveis. Um ensaio de adesão estático 10 é o mais adequado para estudar as interações de células T-APC; Alternativamente, o método de tensão de corte detalhado aqui é ideal para modelar as interacç?…
The authors have nothing to disclose.
The Rheumatology Research Foundation and the Hirschil Trust supported this work.
T cell samples (cell line or primary) | ATCC | TIB-152 | Peripheral human T cells |
CHO-ICAM-1 cells | ATCC | CRL-2093 | |
µ-Slide VI 0.4 ibiTreat | ibidi | 80606 | |
500 ml glass bottle | Fisher | FB800500 | |
250 ml glass bottle | Fisher | FB800250 | |
Silicone tubing 0.8 mm | ibidi | 10841 | |
Confocal microscope with incubator chamber | Ziess | 700 | Any wide field fluorescent microscope |
Syringe pump | New Era Pump Systems | NE-300 | |
60 ml syringe | BD | 309653 | |
CFSE | eBioscience | 65-0850 | |
SDF-1α | R&D | 350-NS-010/CF | |
RPMI | Lonza | 12-702F/12 | |
PBS | Lonza | 17-516F | |
Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 | |
D-Glucose | Sigma Aldrich | G8270 | |
PMA | Sigma Aldrich | 16561-29-8 | |
Volocity software | Perkin Elmer | Version 6.2.1 | |
ImageJ software | NIH | Version 1.48V | |
Tissue-culture treated culture dishes | Falcon | 353003 | |
Trypsin-EDTA (0.25%) Phenol Red | Gibco | 25200114 | |
Heat Inactivated FBS | Denville | FB5001-H | |
Penicillin/Streptomycin | Fisher | BP295950 |