Summary
Этот анализ адгезии потока обеспечивает простую, высокую модель удара клеток-эпителиального взаимодействия Т-клеток. Шприцевой насос используется для генерирования напряжения сдвига, и конфокальной микроскопии захватывает изображения для количественной оценки. Целью этих исследований является эффективно количественно адгезию Т-клеток с использованием условий потока.
Abstract
В целом, адгезия Т-клеток является важным компонентом функции, вносит свой вклад в различных процессах клеточного набора на участках воспаления и взаимодействия с антиген-представляющих клеток (APC) в формировании иммунологических синапсов. Эти два контекста адгезии Т-клеток отличаются тем, что Т-клеток APC взаимодействия можно считать статичным, в то время как взаимодействие Т-клетками кровеносных сосудов сталкиваются с проблемой напряжения сдвига, порожденного самого обращения. Т-клетки-Арс взаимодействия классифицируются как статические в том, что две клеточные партнеры являются статическими по отношению друг к другу. Как правило, это взаимодействие происходит в лимфатических узлах. Поскольку Т - клетка взаимодействует со стенкой кровеносного сосуда, клетки арестовывать и должны противостоять сгенерированного напряжения сдвига. 1,2 Эти различия подчеркивают необходимость более глубокого понимания статической адгезии и адгезии в проточных условиях в виде двух отдельных регуляторных процессов. Регулирование адгезии Т-клеток может быть наиболее лаконично описан как контроллинг состояние сродства интегрина молекул экспрессируется на поверхности клетки, и, таким образом, регулируя взаимодействие интегринов с молекулой лигандами адгезии, экспрессированным на поверхности клетки, взаимодействующей. Наше нынешнее понимание регуляции интегрина сродства состояний происходит от часто упрощенно в пробирке модельных системах. Анализ адгезии с использованием условий потока, описанных здесь, позволяет для визуализации и точной количественной оценки клеток-эпителиальной взаимодействий Т-клеток в реальном времени после стимула. Адгезией при анализе потока могут быть применены к изучению адгезии сигнализации в Т-клетках после обработки ингибирующими или стимулирующими веществами. Кроме того, этот анализ может быть расширен за пределы сигнализации Т-клеток в популяции любого адгезив лейкоцитарного и любой пары интегрином молекул адгезии.
Introduction
Т - лимфоцит адгезия опосредует ряд различных процессов в здоровой иммунной системы, 3 играет критически важную роль в торговле людьми Т - клеток и презентации антигена. Если во время иммунного надзора или активного иммунного ответа эти две широкие роли для адгезии являются критическими. 4 Физиологические сигнальные события клеток-эндотелиальной взаимодействия Т - клеток отличаются от Т - клеток-антигенпрезентирующих клеток (АРС) взаимодействия, и , следовательно , требуют различных методов исследование, чтобы наилучшим образом понять сигнальные каскады, вовлеченные. Фирма адгезия Т-клеток к стенке кровеносного сосуда во время экстравазации лимфоцитов требует быстрого и динамического активации интегрина. Тесное взаимодействие между активным государством интегрином и адгезионных молекул по эндотелию приводит к адгезии , устойчивой к потоку крови, что позволяет Т - клетки ползать по поверхности в поисках области разрешительного до клеточного прохода. 5 сканированию сотовом Bi T -directionally Алонга стенки кровеносного сосуда полагается на поляризованной адгезии, с отчетливым клеевой передним концом Т - клетки. 6 Что наиболее важно, фирма адгезии и трансмиграции требуют устойчивости к сдвиговой силы , генерируемой за счет циркуляции кровотока.
При разработке экспериментов по изучению адгезии лимфоцитов, внимание должно быть обращено на специфический стимул интереса. В то время как активации интегрина является общим и важным компонентом всех форм адгезии Т-клеток, каскады активации, вероятно, будут уникальными ниже по потоку от отдельных рецепторов и ко-рецепторов. Кроме того, пары интегрин и молекулы адгезии функционируют в специализированных микросреды и на конкретных подгруппах. Таким образом, эти пары могут регулироваться совершенно по-разному. Модель , представленная здесь , идеально подходит для изучения сигнальных каскадов , приводящих к активации интегрина , происходящие при сдвиге условиях стресса. 7 Эти взаимодействия не могут быть адекватно понимать в статическом adhesiна системе из - за воздействия этих сил было показано, что непосредственно на поведение Т - клеток. 8 Хотя представленные здесь с Т - клетками и СНО (яичника китайского хомячка) клетки , сконструированные для экспрессии человеческого ICAM-1 (СНО-ICAM клетки) система может легко модифицировать для изучения различных популяций лейкоцитов или молекулы адгезии.
Этот анализ предоставляет метод количественной оценки клеток адгезионную T и активацию интегрина с использованием напряжения сдвига, обеспечивая модель для твердой стадии адгезии лейкоцитов. Благодаря использованию ЧО-ICAM клеток сродство LFA-1 для его лиганда в живых клетках, могут быть рассмотрены в режиме реального времени, в ответ на различные стимулы, представляющие интерес. Этот метод требует легко получить, коммерчески доступные камеры микро-потока в сочетании с насосом со шприцем, что значительно упрощает оборудование , необходимое для моделирования кровотока и напряжения сдвига по сравнению с другими моделями. 9 Другим важным преимуществом этого анализа является то , что специфической сигнализациикаскады и результирующее состояние активации отдельных интегринов может быть чисто изучены посредством использования сконструированных клеток СНО, экспрессирующих молекулы адгезии человека, представляющие интерес. Кроме того, сочетание количественных данных с изображений живых клеток является существенным преимуществом этого метода. В целом, в то время как количество анализов статической адгезии Т-клеток было описано, что хорошо модель Т-клеток-APC взаимодействия, эти модели недостаточно для захвата динамичного процесса клеточного эпителиальной адгезии T. По этой причине при выборе анализа адгезии стимул в вопросе должны быть рассмотрены.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Покрытие Клетки СНО-ICAM
Примечание: Цель этого шага заключается в высевания CHO-ICAM клеток в проточных камерах для роста в течение ночи с целью создания сливающийся монослой.
- Поддержание ЧО-ICAM клеток в 10 см тканевых культур обрабатывают культуральных чашках в 10 мл RPMI среде с 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина / стрептомицина (СНО-ICAM полной культуральной среды) при 37 ° С с 5% CO 2.
- Для того, чтобы собрать клетки, добавляют 1 мл 0,5% трипсин-ЭДТА и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 мин при осторожном встряхивании. Нейтрализовать трипсина с 4 мл среды.
- Граф клеток СНО-ICAM с использованием гемоцитометра и расчета 0,75 × 10 5 клеток на камеру. Примечание: В этом эксперименте: 2,25 х 10 5 клеток будут необходимы для семян 3 камеры.
- Центрифуга 0,75 х 10 5 CHO-ICAM клеток в камере в течение 5 мин при 500g, комнатной температуре и ресуспендируют осадок клеток в 30 мкл на камеру ЧО-ICAM Полная культура средств массовой информации.
Примечание: В этом эксперименте потребуется 90 мкл семян 3 камеры. - Медленно добавить ячейки в один резервуар проточной камеры. Разрешить клетки урегулировать в течение 5 мин в 37 ° C инкубаторе с 5% CO 2.
- Добавить 200 мкл полной культуральной среды через два резервуара каждой камеры. Альтернативные дополнения между ними, чтобы избежать перемещения элементов, как система уравновешивается.
- Инкубируйте клетки в течение ночи в 37 ° C инкубаторе с 5% CO 2.
2. Получение Т-клеток
Примечание: Этот анализ может быть сделано с первичных человеческих Т-клеток или Т-клеточной линии. Протокол по изоляции Т - клеток из крови было описано ранее. 10 Если с помощью Т - клетки человека используют первичные свежеизолированных клетки для достижения наилучших результатов. При использовании Т-клеточной линии, следовать протоколу культуры, указанного источника клеток. Для того чтобы обнаружить клетки на флуоресцентном microscoП.Е. Т-клетки метили флуоресцеина карбокси сукцинимидил эфира (CFSE).
- Подсчитайте Т - клеток с помощью гемоцитометра и вычислить 2 × 10 6 клеток в камере. Примечание: В этом эксперименте, 6 х 10 6 клеток будут необходимы для 3 -х камер.
- Центрифуга 2 × 10 6 клеток на Т камере в течение 5 мин при 500g, комнатной температуре и клетки вновь суспендируют в 1 мл фосфатно - буферного раствора (PBS) , содержащего 1% глюкозу или 2% FBS.
- Добавить CFSE в соотношении 1: 1000 разбавление (запас сделаны 5 мМ). Накройте от света и инкубировать в течение 8 минут при комнатной температуре
- Спин при 500 мкг в течение 5 мин, RT.
- Ресуспендируют осадок клеток с 240 мкл на состояние (смотри раздел 4 "Примечание") в RPMI средах без сыворотки. В этом эксперименте, ресуспендируют осадок клеток в 720 мкл среды RPMI обычной. Разделите клетки в пустые 1,5 мл пробирки, меченных для каждой камеры, 240 мкл на пробирку. Держите клетки в C тепла блока 37 ° С до использования.
3. Настройка-гое ввода / вывода и шланги шприцевой насос
- Подогреть камеру микроскопа живого изображения до 37 ° C.
- Подготовьте входной подсоединенные шланги:
- Заполните стеклянную бутылку емкостью 500 мл с водой и сделайте 2 отверстия в крышке. Этикетка дыры "в" и "вне". Это будет выступать в качестве водогрейного ванны для ввода средств массовой информации.
- Выполните вход через шланги , отверстия в крышке и в водяной бане. Убедитесь , что сторона шланга , который подключается к шприц приходит через "в" отверстие и сторона , которая будет подключаться к входу резервуара поступает через «аут» отверстие.
- Промыть вход обливание 60 мл воды , чтобы удалить воздух из системы.
- Заливка вход обливание RPMI средах без сыворотки нагревалась до 37 ° С. Заполните 60 мл шприц и протащить через средства массовой информации до тех пор, пока шланги полностью загрунтованную и отсутствие пузырьков воздуха.
Примечание: В зависимости от lengtч тюбинга объема, необходимого для простого числа будет меняться.- Рассчитать объем носителя, необходимых для эксперимента путем умножения скорости потока (здесь 0,3 мл / мин) на количество минут (5 мин) по количеству камер в эксперименте (здесь 3); В этом эксперименте используют 4,5 мл среды. Примечание: Мы рекомендуем иметь 5 мл дополнительный объем (здесь на общую сумму 9,5 мл), оставшийся в шприце после грунтования.
- Поместите все настройки входа в живой оболочки визуализации микроскопа для поддержания 37 ° C. Запустите подсоединенные шланги и шприц из корпуса и загрузите шприц в шприцевой насос.
- Подготовьте выходной подсоединенные шланги:
- Сделайте отверстие в крышке бутылки 250 мл для использования в качестве вывода отходов.
- Запуск выходной трубопровод через отверстие и в бутылку. Неплотно закрыть крышку, не закрывая весь путь.
- Установите настройки вывода в корпусе живого изображения Миcroscope.
- Рассчитывают расход (мл / мин) , необходимые для создания желаемого напряжения сдвига (дин / см 2). Напряжение сдвига варьирует в различных сосудистых отделениях, поэтому принимать во внимание общую модель, включая типы клеток для изучения и лечения при решении вопроса о сдвига уровня напряжения.
Примечание: Эти эксперименты проводились при 0,4 дин / см 2 , чтобы точно имитировать небольшую установку вены.- Возьмите размеры камеры во внимание при расчете напряжения сдвига. Используйте следующую формулу (предоставляемая производителем 11) для проточных камер , используемых здесь (см Таблицу материалов): T = η * 176,1 * O , где напряжение т = сдвига, η = динамическая вязкость, диаметр = скорость потока. Примечание: Динамическая вязкость RPMI сред при температуре 37 ° С составляет 0,007.
4. Загрузка потока камер и стимуляции клеток
Примечание: Для того, чтобы начать адгезию,Т-клетки должны быть стимулированы. В следующем эксперименте клетки либо останется нестимулируемый или стимулируются SDF-1α 12 или форболмиристатацетата (РМА; положительный контроль) 13. Для правильной презентации хемокина на Т-клетки, CHO-ICAM-клетки предварительно инкубировали с SDF-1 & alpha; (с последующим последовательным стирок), что позволяет для представления на поверхности клетки. РМА представляет собой форболовый эфир, который структурно похож на второй мессенджер диацилглицерин (DAG); Здесь он используется в качестве положительного контроля. Т-клетки непосредственно обрабатывают РМА перед загрузкой в проточную камеру.
- Установите камеру потока на слайд микроскопа и установить фокальной плоскости на монослой CHO-ICAM с использованием цели 20X.
- Держите CFSE окрашенных Т-клеток для всех других условий в C тепла блока 37 °. Готовят клетки СНО-ICAM или Т следующим образом непосредственно перед анализом, для этого условия:
- Для нестимулированных условия (камера 1), держите одну трубку / ПОДАЮЩЕЙянтарный необработанный, чтобы служить в качестве отрицательного контроля для стимуляции.
- Для стимуляции РМА (камера 2), стимулируют одну трубку Т-клеток с РМА (10 нг / мл), чтобы служить в качестве положительного контроля; лечить непосредственно перед загрузкой в проточную камеру.
- Для SDF-1 & alpha; стимуляции (камера 3), стимулируют третью камеру потока с SDF-1 & alpha; (100 нг / мл) путем удаления 70 мкл в то время , 3 раза из верхнего резервуара (выходной резервуар) , а затем добавляя 70 мкл SDF -1α (100 нг / мл) в нижний резервуар (вход резервуара). Инкубировать в течение 5 мин.
- Снимите и выбросьте 70 мкл в то время , 3 раза из выходного коллектора одной камеры.
- Добавьте 70 мкл предварительно обработанного (если применимо) клеточной суспензии Т во входной резервуар 3 раза. Подождите 5 минут, чтобы позволить клеткам перемещаться от входного отверстия камеры ( "In"), и достичь проксимальный выпускное отверстие ( "Out") камеры.
- В течение этого времени изображение 5поля для CFSE-окрашенными Т-клеток. Выберите поля , которые разбросаны по всему центру камеры (рисунок 1). Используйте следующие условия возбуждения / излучения: длина волны лазера возбуждения: 488 нм; Коллекция эмиссионный фильтр: 500 - 540 нм. Эти изображения будут служить в качестве кровяных клеток предварительно потока.
- Подключите входной и выходной трубопровод одновременно проточную камеру резервуаров.
Примечание: Присоединение трубки одновременно имеет решающее значение для того, чтобы не вводить пузырьков воздуха в камеру и поддержание общего равновесия внутри камеры. - Начинают потока при 0,3 мл / мин (0,4 дин / см 2) , в то время как визуализируя CFSE-запачканные Т - клеток. Как начинается поток, особенно с первой камерой, часто возникает задержка между началом потока и наблюдения Т-клеток прокатки, поэтому начала отсчета времени 5 мин при начале движения Т-клеток.
- Прекратить поток через 5 мин, и изображения 5 полей в канале CFSE. Выберите поля случайным образом рассредоточенные беспересадочныйughout центре проточной камеры (Рисунок 1). Эти изображения будут служить в качестве кровяных клеток после потока.
5. Определение Процент адгезивных клеток
Примечание: Определение количества клеток в полученных изображений делается объективно с автоматизированным программным обеспечением. Для наших исследований мы использовали программное обеспечение Volocity (версия 6.2.1), но и другие программы, такие как ImageJ (версия 1.48V), также применимы.
- Определить количество клеток в поле предварительного потока для каждого условия. В среднем из 5 полей является "предварительной подачи среднее количество клеток." 7
- Определить количество клеток на поле после потока для каждого условия. В среднем из 5 полей "пост-потока среднее число клеток." 7
- Рассчитывают процент адгезивных клеток , используя следующую формулу: процент адгезивных клеток = (пост-поток Среднее количество клеток) / (предварительно поток Среднее количество клеток) × 100%.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Типичные результаты приведены из анализа адгезии потока с использованием Jurkat и первичных человеческих CD3 + Т - клеток, как показано, стимулировали SDF-1alpha. Негативные управления во всех показанных экспериментах нестимулированных клеток. Порог базальный процент адгезии стимулированных клеток составляет от 5 - 10%; базовая адгезия заметно выше этого диапазона указывает на проблемный эксперимент и предполагает начало популяции Т-клеток были неспецифически предварительно активировали в препарате. Кратному увеличению числа прикрепленных клеток после потока в каждом условии, что в течение нестимулированных клеток может быть вычислена в дополнение к расчету процентов адгезии. Данные, представляющие эти два метода расчета здесь включены.
На фиг.2А показаны репрезентативные образы полей внутри камеры потока для каждого состояния до и после потока. До начала эксперимента, Jurkat (показатьп на рисунке 2А) или первичных человеческих CD3 + Т - клеток, очищают, подсчитывали и метили CFSE. Для каждого условия эксперимента были помечены 2 х 10 6 клеток. Нестимулированные Т-клетки были загружены в проточных камерах, содержащих СНО-ICAM клеток в присутствии или в отсутствие SDF-1 & alpha;. Т-клетки позволили перемещаться и накапливаться в камере в течение 5 мин, и в течение этого времени изображения были захвачены, чтобы определить, счетчики предварительной подачи. Сопоставимое число клеток предварительно потока между различными раздражений имеет важное значение, чтобы обеспечить равномерные условия эксперимента. После 5 мин непрерывного напряжения сдвига, порожденного потока, изображения были вновь захвачены, чтобы определить, после подсчета расхода. Очевидно, с помощью этих представительных образов, SDF-1α увеличивает число Т-клеток, способных придерживаться CHO-ICAM клеток под напряжением сдвига.
Фигура 2В показывает кратное изменение адгезии Т - клеток , как калженной на основании числа Jurkat Т-клеток до и после потока либо нестимулируемый или в присутствии SDF-1 & alpha;. Для каждого состояния средние количества клеток из 5 полей предварительного потока и 5 полей были определены после потока, а также сравнение SDF-1alpha стимуляции нестимулируемый используется для расчета кратного изменения в адгезии Т-клеток. Как показано здесь, SDF-1α индуцирует около 2-кратное увеличение адгезии по сравнению с нестимулируемый.
Рисунок 2C демонстрирует альтернативный метод расчета данных. При этом процент адгезии первичных человеческих CD3 + Т - клеток в присутствии или в отсутствие SDF-1 & alpha; определяется первым определения средних до и после потока количество Т - клеток, а затем разделив средний пост-потока по средней предварительной подачи и умножения на 100. с помощью этого расчета все население до потока составляет 100% адгезию. Как показано здесь, 15% от стимулированных Т-клеток прилипать под Stre сдвигасс, по сравнению с 50% Т-клеток, стимулированных SDF-1 & alpha;.
Рисунок 1. Важно анализировать только в местах с однородного потока. Схематическое изображение проточных камер , используемых с указанием , где поля должны быть отображены. Согласно информации, предоставленной производителями камер, скорость потока предварительно установленный достигается только через центр камеры, обозначается оранжевым цветом в этой схеме. Ближе к границам камеры уменьшается скорость потока и не должны быть включены в экспериментальной визуализации или анализа. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. <сильный> SDF-1α индуцирует адгезию Т - клеток к ICAM-1 при напряжении сдвига. А. Jurkat Т - клетки были мечены CFSE при концентрации 5 мкМ. Затем клетки были загружены в проточных камер, которые были предварительно обработаны с SDF-1alpha (100 нг / мл) или нестимулируемый и создать на конфокальной микроскопии и может перемещаться и накапливаться в камере в течение 5 мин. В качестве альтернативы, Jurkat Т-клетки предварительно обрабатывали ФМА (10 нг / мл) перед добавлением к проточных камер. В течение этих 5 мин изображений предварительного потока были захвачены в плен. Затем поток был инициирован на уровне 0,4 дин / см 2 , чтобы создать напряжение сдвига в течение 5 мин. После завершения, были захвачены изображения после потока. Типичные изображения Jurkat Т - клеток , показаны, Шкалы 50 мкм. Б. Fold изменение адгезии Jurkat Т - клеток , рассчитывали путем предварительного определения средних до и после расхода количества клеток для каждого условия и разделив среднее количество пост-потока по средней со предварительной подачиUNT индивидуально для каждого условия. Это прилипание фактор для каждого условия стимуляции, здесь SDF-1alpha или PMA, затем делится на нестимулированных фактор адгезии, чтобы определить кратное изменение адгезии. Полосы представляют среднее значение из 3 экспериментов ± SEM. C. Процент адгезии первичных человеческих CD3 + Т - клеток , рассчитывали путем первоначального определения количества клеток в среднем до и после потока для каждого состояния. Для каждого состояния, среднее число пост-поток делится на среднее количество предварительно потока и умноженное на 100. Полученный в результате процент адгезии основан на счет предварительной подачи клеток на 100% адгезию. Полосы представляют в среднем 5 экспериментов ± SEM. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. TКлетки первого накапливаются затем перелиться через ЧО-ICAM монослое. Jurkat Т - клетки были мечены CFSE при концентрации 5 мкМ. Затем клетки были загружены в проточных камер, которые были предварительно обработаны с SDF-1alpha (100 нг / мл) и установить на конфокальной микроскопии и может перемещаться и накапливаться в камере в течение 5 мин. На протяжении этих 5 мин изображений были захвачены в качестве серии покадровой; стоп - кадров (A). Затем поток был инициирован на уровне 0,4 дин / см 2 , чтобы создать напряжение сдвига в течение 5 мин. На протяжении этих 5 мин изображений были захвачены в качестве серии покадровой; стоп - кадров (B). Направление потока в этих изображениях снизу вверх, а в фокальной плоскости устанавливается в монослое CHO-ICAM. Т-клетки могут быть разделены на 3 группы: (1) Т-клетки вдоль прокатки монослоя при скорости потока визуализируются в виде коротких горизонтальных линий, движущихся снизу вверх по всему полю, так как они быстро продвигаются в то время как изображаемого. (2) Т-клетки crawlinг вдоль монослоя. Эти клетки прочно придерживалась основаны на сопротивление потоку, и ползут вероятно в поисках области разрешительного к клеточному проход, который не наблюдается в этой модели. (3) Т-клетки, которые прочно прилипают к монослое, устойчивы к действию потока, но неподвижны. Эти клетки активно не прокатке или ползет по монослоя. Более сложный анализ может быть сделано, исходя из целей исследования, путем использования сценария ImageJ предназначенного для рассекают этих клеточных популяций для дальнейшей количественной оценки и характеристики. Шкала баров 50 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4. CHO-ICAM клетки должны сформировать сливающийся монослой. Представителя образ сливающийся CHO-ICAM monolayэр в проточную камеру. Масштабная линейка 10 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Для того , чтобы правильно проанализировать адгезию Т - клеток, стимулятором быть включены в исследование , необходимо учитывать при выборе метода в лабораторных условиях . Хотя существует несколько анализов для изучения сигналов, приводящих к активации LFA-1 и ICAM-1, связывающего все методы не являются взаимозаменяемыми. Статический анализ адгезии 10 лучше всего подходит для изучения Т - клеток-APC взаимодействия; В качестве альтернативы, метод сдвига напряжений подробно здесь идеально подходит для моделирования Т - клеток-эпителиальные взаимодействия клеток. В естественных условиях, так как хемокины представлены по эндотелий, прокатка Т - клетки должны реагировать, твердо придерживаясь и сопротивление касательное напряжение крови потока 14,15. По этой причине, изучение сигналов хемокинов лучше всего подходит для изучения в анализе, который включает в себя напряжение сдвига. Основное преимущество этой адгезии с использованием условий потока является его простота в моделировании взаимодействия между Т-клетками и интегринов. Этот анализ довольно уникально сочетает в себе функции и механистическогоисследования по моделированию условий для изучения одного интегрином молекул адгезии пары. Другая сила этого метода является его адаптивность; Этот метод может быть использован для количественного определения адгезии любого лейкоцита к любой молекулы адгезии. Этот метод может быть использован для скрининга эффект нескольких лекарственных средств или генетических манипуляций, как ожидается, изменить набор Т-клеток и транссудации через измененном активации интегрина.
Как и с любым методом в пробирке, существуют некоторые ограничения данного анализа. Эта модель использует сконструированные клетки СНО , а не моделировала первичный эндотелиальные клетки , как использовали и другие модели. 16 Несмотря на то , что это дает нам возможность понять сигнальные события , оказывающие влияние на состояние активации одного интегрина, это также можно считать недостатком модели. Поскольку нет селектина, выраженные клетками СНО, анализ делается в два этапа. На первом этапе (фаза накопления), Т-клетки вводят во входной ReservОИР на одной стороне камеры и поездки в другую сторону минимальным давлением и капиллярных сил. Поведение Т - клеток на протяжении этих 5 мин можно наблюдать на фигуре 3А. Через 5 мин, а на втором этапе (фаза потока) скорость потока увеличивается, а клетки начнет разбег и прилипать. Важно отметить , что не все Т - клетки инъецировали в подающие пластового перемещаться по камере во время фазы накопления, и эти клетки катиться вдоль монослое в качестве потока увеличивается (фигура 3В). Таким образом, прокатный стадия экстравазации искусственно усиливается, но не устранена, в этой модели.
Поскольку максимальное количество прикрепленных клеток является выражением числа входных элементов, которые входят в камеру есть потенциал для изменчивости необработанного числа среди экспериментов. В то время как изображения предварительной подачи не в полной мере представляет 100% максимальной Т клеточной популяции, потому что они не принимают в accounт входного коллектора, это является важным контроль, чтобы включать в расчетах особенно, когда два различных типа клеток подсчитанные по отдельности должны быть сравнены. Кроме того, не рекомендуется, чтобы первичный взрыв лимфоциты быть использованы в одной переменной анализа адгезии. То есть, предварительно стимуляция Т-клеток посредством рецепторов Т-клеток (TCR), и / или ко-рецепторов, могут затруднить эффект лечения интереса на адгезию. Эти переменные должны быть рассмотрены в ходе эксперимента. Кроме того, функциональные исследования с ранее замороженном МНПК часто приводят к недостоверным результатам, и по этой причине клеточных линий или первичных свежеизолированных МНПК работают лучше всего с этим анализом. Понимание нормального уровня базового нестимулированных сцепления для РВМС, включенных в исследование имеет решающее значение в определении клеточной популяции, которая была неспецифически предварительно активированную что приводит к недостоверным результатам.
Для того, чтобы повторить этот анализ с точностью, очень важно, чтобы некоторые шагs в протоколе, в том числе оседание и инкубационных поток времени, быть точным и единообразным среди всех условий. В этом же свете, CHO-ICAM клетки должны быть равномерно конфлюэнтны во всех камерах потока (рисунок 4) и отсчетов Т - клеток также должны быть точными. 17 Даже небольшие различия в этих факторов может повлиять на точность подсчета клеток в конце концов. В будущем применение этого анализа является разработка ряда клеточных линий, экспрессирующих по отдельности селектинами и молекул адгезии расширить влияние этого метода на других сигнальных каскадов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| T cell samples (cell line or primary) | ATCC | TIB-152 | Peripheral human T cells |
| CHO-ICAM-1 cells | ATCC | CRL-2093 | |
| µ-Slide VI 0.4 ibiTreat | ibidi | 80606 | |
| 500 ml glass bottle | Fisher | FB800500 | |
| 250 ml glass bottle | Fisher | FB800250 | |
| Silicone tubing 0.8 mm | ibidi | 10841 | |
| Confocal microscope with incubator chamber | Ziess | 700 | Any wide field fluorescent microscope |
| Syringe pump | New Era Pump Systems | NE-300 | |
| 60 ml syringe | BD | 309653 | |
| CFSE | eBioscience | 65-0850 | |
| SDF-1α | R&D | 350-NS-010/CF | |
| RPMI | Lonza | 12-702F/12 | |
| PBS | Lonza | 17-516F | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| D-Glucose | Sigma Aldrich | G8270 | |
| PMA | Sigma Aldrich | 16561-29-8 | |
| Volocity software | Perkin Elmer | Version 6.2.1 | |
| ImageJ software | NIH | Version 1.48V | |
| Tissue-culture treated culture dishes | Falcon | 353003 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) Phenol Red | Gibco | 25200114 | |
| Heat Inactivated FBS | Denville | FB5001-H | |
| Penicillin/Streptomycin | Fisher | BP295950 |
References
- Alon, R., Ley, K. Cells on the run: shear-regulated integrin activation in leukocyte rolling and arrest on endothelial cells. Curr Opin Cell Biol. 20 (5), 525-532 (2008).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7 (9), 678-689 (2007).
- Dustin, M. L., Bivona, T. G., Philips, M. R. Membranes as messengers in T cell adhesion signaling. Nat Immunol. 5 (4), 363-372 (2004).
- Mor, A., Dustin, M. L., Philips, M. R. Small GTPases and LFA-1 reciprocally modulate adhesion and signaling. Immunol Rev. 218, 114-125 (2007).
- Rose, D. M., Alon, R., Ginsberg, M. H. Integrin modulation and signaling in leukocyte adhesion and migration. Immunol Rev. 218, 126-134 (2007).
- Alon, R., Feigelson, S. W. Chemokine-triggered leukocyte arrest: force-regulated bi-directional integrin activation in quantal adhesive contacts. Curr Opin Cell Biol. 24 (5), 670-676 (2012).
- Su, W., et al. Rap1 and its effector RIAM are required for lymphocyte trafficking. Blood. 126 (25), 2695-2703 (2015).
- Judokusumo, E., Tabdanov, E., Kumari, S., Dustin, M. L., Kam, L. C. Mechanosensing in T lymphocyte activation. Biophys J. 102 (2), L5-L7 (2012).
- Zeltzer, E., et al. Diminished adhesion of CD4+ T cells from dialysis patients to extracellular matrix and its components fibronectin and laminin. Nephrol Dial Transplant. 12 (12), 2618-2622 (1997).
- Strazza, M., Azoulay-Alfaguter, I., Pedoeem, A., Mor, A. Static adhesion assay for the study of integrin activation in T lymphocytes. J Vis Exp. (88), (2014).
- Ibidi GmbH. Shear stress and shear rates for ibidi μ-Slides - based on numerical calculations. Application Note 11. , Available from: http://ibidi.com/fileadmin/support/application_notes/AN11_Shear_stress.pdf (2014).
- van Gijsel-Bonnello, M., et al. Pantethine Alters Lipid Composition and Cholesterol Content of Membrane Rafts, With Down-Regulation of CXCL12-Induced T Cell Migration. J Cell Physiol. 230 (10), 2415-2425 (2015).
- Tozeren, A., et al. Micromanipulation of adhesion of phorbol 12-myristate-13-acetate-stimulated T lymphocytes to planar membranes containing intercellular adhesion molecule-1. Biophys J. 63 (1), 247-258 (1992).
- Mortier, A., Van Damme, J., Proost, P. Overview of the mechanisms regulating chemokine activity and availability. Immunol Lett. 145 (1-2), 2-9 (2012).
- Rot, A. In situ binding assay for studying chemokine interactions with endothelial cells. J Immunol Methods. 273 (1-2), 63-71 (2003).
- Yang, L., et al. ICAM-1 regulates neutrophil adhesion and transcellular migration of TNF-alpha-activated vascular endothelium under flow. Blood. 106 (2), 584-592 (2005).
- Long, E. O. ICAM-1: getting a grip on leukocyte adhesion. J Immunol. 186 (9), 5021-5023 (2011).
