Анализ адгезии при сдвиге стресса для изучения Т-лимфоцитами взаимодействий молекул адгезии
Summary
Этот анализ адгезии потока обеспечивает простую, высокую модель удара клеток-эпителиального взаимодействия Т-клеток. Шприцевой насос используется для генерирования напряжения сдвига, и конфокальной микроскопии захватывает изображения для количественной оценки. Целью этих исследований является эффективно количественно адгезию Т-клеток с использованием условий потока.
Abstract
В целом, адгезия Т-клеток является важным компонентом функции, вносит свой вклад в различных процессах клеточного набора на участках воспаления и взаимодействия с антиген-представляющих клеток (APC) в формировании иммунологических синапсов. Эти два контекста адгезии Т-клеток отличаются тем, что Т-клеток APC взаимодействия можно считать статичным, в то время как взаимодействие Т-клетками кровеносных сосудов сталкиваются с проблемой напряжения сдвига, порожденного самого обращения. Т-клетки-Арс взаимодействия классифицируются как статические в том, что две клеточные партнеры являются статическими по отношению друг к другу. Как правило, это взаимодействие происходит в лимфатических узлах. Поскольку Т – клетка взаимодействует со стенкой кровеносного сосуда, клетки арестовывать и должны противостоять сгенерированного напряжения сдвига. 1,2 Эти различия подчеркивают необходимость более глубокого понимания статической адгезии и адгезии в проточных условиях в виде двух отдельных регуляторных процессов. Регулирование адгезии Т-клеток может быть наиболее лаконично описан как контроллинг состояние сродства интегрина молекул экспрессируется на поверхности клетки, и, таким образом, регулируя взаимодействие интегринов с молекулой лигандами адгезии, экспрессированным на поверхности клетки, взаимодействующей. Наше нынешнее понимание регуляции интегрина сродства состояний происходит от часто упрощенно в пробирке модельных системах. Анализ адгезии с использованием условий потока, описанных здесь, позволяет для визуализации и точной количественной оценки клеток-эпителиальной взаимодействий Т-клеток в реальном времени после стимула. Адгезией при анализе потока могут быть применены к изучению адгезии сигнализации в Т-клетках после обработки ингибирующими или стимулирующими веществами. Кроме того, этот анализ может быть расширен за пределы сигнализации Т-клеток в популяции любого адгезив лейкоцитарного и любой пары интегрином молекул адгезии.
Introduction
Т – лимфоцит адгезия опосредует ряд различных процессов в здоровой иммунной системы, 3 играет критически важную роль в торговле людьми Т – клеток и презентации антигена. Если во время иммунного надзора или активного иммунного ответа эти две широкие роли для адгезии являются критическими. 4 Физиологические сигнальные события клеток-эндотелиальной взаимодействия Т – клеток отличаются от Т – клеток-антигенпрезентирующих клеток (АРС) взаимодействия, и , следовательно , требуют различных методов исследование, чтобы наилучшим образом понять сигнальные каскады, вовлеченные. Фирма адгезия Т-клеток к стенке кровеносного сосуда во время экстравазации лимфоцитов требует быстрого и динамического активации интегрина. Тесное взаимодействие между активным государством интегрином и адгезионных молекул по эндотелию приводит к адгезии , устойчивой к потоку крови, что позволяет Т – клетки ползать по поверхности в поисках области разрешительного до клеточного прохода. 5 сканированию сотовом Bi T -directionally Алонга стенки кровеносного сосуда полагается на поляризованной адгезии, с отчетливым клеевой передним концом Т – клетки. 6 Что наиболее важно, фирма адгезии и трансмиграции требуют устойчивости к сдвиговой силы , генерируемой за счет циркуляции кровотока.
При разработке экспериментов по изучению адгезии лимфоцитов, внимание должно быть обращено на специфический стимул интереса. В то время как активации интегрина является общим и важным компонентом всех форм адгезии Т-клеток, каскады активации, вероятно, будут уникальными ниже по потоку от отдельных рецепторов и ко-рецепторов. Кроме того, пары интегрин и молекулы адгезии функционируют в специализированных микросреды и на конкретных подгруппах. Таким образом, эти пары могут регулироваться совершенно по-разному. Модель , представленная здесь , идеально подходит для изучения сигнальных каскадов , приводящих к активации интегрина , происходящие при сдвиге условиях стресса. 7 Эти взаимодействия не могут быть адекватно понимать в статическом adhesiна системе из – за воздействия этих сил было показано, что непосредственно на поведение Т – клеток. 8 Хотя представленные здесь с Т – клетками и СНО (яичника китайского хомячка) клетки , сконструированные для экспрессии человеческого ICAM-1 (СНО-ICAM клетки) система может легко модифицировать для изучения различных популяций лейкоцитов или молекулы адгезии.
Этот анализ предоставляет метод количественной оценки клеток адгезионную T и активацию интегрина с использованием напряжения сдвига, обеспечивая модель для твердой стадии адгезии лейкоцитов. Благодаря использованию ЧО-ICAM клеток сродство LFA-1 для его лиганда в живых клетках, могут быть рассмотрены в режиме реального времени, в ответ на различные стимулы, представляющие интерес. Этот метод требует легко получить, коммерчески доступные камеры микро-потока в сочетании с насосом со шприцем, что значительно упрощает оборудование , необходимое для моделирования кровотока и напряжения сдвига по сравнению с другими моделями. 9 Другим важным преимуществом этого анализа является то , что специфической сигнализациикаскады и результирующее состояние активации отдельных интегринов может быть чисто изучены посредством использования сконструированных клеток СНО, экспрессирующих молекулы адгезии человека, представляющие интерес. Кроме того, сочетание количественных данных с изображений живых клеток является существенным преимуществом этого метода. В целом, в то время как количество анализов статической адгезии Т-клеток было описано, что хорошо модель Т-клеток-APC взаимодействия, эти модели недостаточно для захвата динамичного процесса клеточного эпителиальной адгезии T. По этой причине при выборе анализа адгезии стимул в вопросе должны быть рассмотрены.
Protocol
Representative Results
Discussion
Для того , чтобы правильно проанализировать адгезию Т – клеток, стимулятором быть включены в исследование , необходимо учитывать при выборе метода в лабораторных условиях . Хотя существует несколько анализов для изучения сигналов, приводящих к активации LFA-1 и ICAM-1, связывающего все …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The Rheumatology Research Foundation and the Hirschil Trust supported this work.
Materials
| T cell samples (cell line or primary) | ATCC | TIB-152 | Peripheral human T cells |
| CHO-ICAM-1 cells | ATCC | CRL-2093 | |
| µ-Slide VI 0.4 ibiTreat | ibidi | 80606 | |
| 500 ml glass bottle | Fisher | FB800500 | |
| 250 ml glass bottle | Fisher | FB800250 | |
| Silicone tubing 0.8 mm | ibidi | 10841 | |
| Confocal microscope with incubator chamber | Ziess | 700 | Any wide field fluorescent microscope |
| Syringe pump | New Era Pump Systems | NE-300 | |
| 60 ml syringe | BD | 309653 | |
| CFSE | eBioscience | 65-0850 | |
| SDF-1α | R&D | 350-NS-010/CF | |
| RPMI | Lonza | 12-702F/12 | |
| PBS | Lonza | 17-516F | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| D-Glucose | Sigma Aldrich | G8270 | |
| PMA | Sigma Aldrich | 16561-29-8 | |
| Volocity software | Perkin Elmer | Version 6.2.1 | |
| ImageJ software | NIH | Version 1.48V | |
| Tissue-culture treated culture dishes | Falcon | 353003 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) Phenol Red | Gibco | 25200114 | |
| Heat Inactivated FBS | Denville | FB5001-H | |
| Penicillin/Streptomycin | Fisher | BP295950 |
References
- Alon, R., Ley, K. Cells on the run: shear-regulated integrin activation in leukocyte rolling and arrest on endothelial cells. Curr Opin Cell Biol. 20 (5), 525-532 (2008).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7 (9), 678-689 (2007).
- Dustin, M. L., Bivona, T. G., Philips, M. R. Membranes as messengers in T cell adhesion signaling. Nat Immunol. 5 (4), 363-372 (2004).
- Mor, A., Dustin, M. L., Philips, M. R. Small GTPases and LFA-1 reciprocally modulate adhesion and signaling. Immunol Rev. 218, 114-125 (2007).
- Rose, D. M., Alon, R., Ginsberg, M. H. Integrin modulation and signaling in leukocyte adhesion and migration. Immunol Rev. 218, 126-134 (2007).
- Alon, R., Feigelson, S. W. Chemokine-triggered leukocyte arrest: force-regulated bi-directional integrin activation in quantal adhesive contacts. Curr Opin Cell Biol. 24 (5), 670-676 (2012).
- Su, W., et al. Rap1 and its effector RIAM are required for lymphocyte trafficking. Blood. 126 (25), 2695-2703 (2015).
- Judokusumo, E., Tabdanov, E., Kumari, S., Dustin, M. L., Kam, L. C. Mechanosensing in T lymphocyte activation. Biophys J. 102 (2), L5-L7 (2012).
- Zeltzer, E., et al. Diminished adhesion of CD4+ T cells from dialysis patients to extracellular matrix and its components fibronectin and laminin. Nephrol Dial Transplant. 12 (12), 2618-2622 (1997).
- Strazza, M., Azoulay-Alfaguter, I., Pedoeem, A., Mor, A. Static adhesion assay for the study of integrin activation in T lymphocytes. J Vis Exp. (88), (2014).
- Ibidi GmbH. Shear stress and shear rates for ibidi μ-Slides – based on numerical calculations. Application Note 11. , (2014).
- van Gijsel-Bonnello, M., et al. Pantethine Alters Lipid Composition and Cholesterol Content of Membrane Rafts, With Down-Regulation of CXCL12-Induced T Cell Migration. J Cell Physiol. 230 (10), 2415-2425 (2015).
- Tozeren, A., et al. Micromanipulation of adhesion of phorbol 12-myristate-13-acetate-stimulated T lymphocytes to planar membranes containing intercellular adhesion molecule-1. Biophys J. 63 (1), 247-258 (1992).
- Mortier, A., Van Damme, J., Proost, P. Overview of the mechanisms regulating chemokine activity and availability. Immunol Lett. 145 (1-2), 2-9 (2012).
- Rot, A. In situ binding assay for studying chemokine interactions with endothelial cells. J Immunol Methods. 273 (1-2), 63-71 (2003).
- Yang, L., et al. ICAM-1 regulates neutrophil adhesion and transcellular migration of TNF-alpha-activated vascular endothelium under flow. Blood. 106 (2), 584-592 (2005).
- Long, E. O. ICAM-1: getting a grip on leukocyte adhesion. J Immunol. 186 (9), 5021-5023 (2011).
