Denne strøm adhæsion assay tilvejebringer en enkel, høj slagstyrke model af T-celle-epitel celle-interaktioner. En sprøjte pumpe anvendes til at generere forskydningsspænding, og konfokal mikroskopi tager billeder til kvantificering. Målet med disse undersøgelser er at effektivt kvantificere T-celle adhæsion ved hjælp strømningsforhold.
Samlet, T-celle-adhæsion er et afgørende element i funktion, bidrager til de forskellige processer af cellulær rekruttering til steder med inflammation og interaktion med antigenpræsenterende celler (APC) i dannelsen af immunologiske synapser. Disse to sammenhænge T-celle-adhæsion forskellige med, at T-celle-APC-interaktioner kan betragtes statisk, mens celle T-blodkarrenes interaktioner udfordres af forskydningsspændingen genereret af selve cirkulation. T-celle-APC-interaktioner er klassificeret som statisk ved, at de to cellulære partnere er statisk i forhold til hinanden. Sædvanligvis er denne interaktion sker inden lymfeknuderne. Som T-celle interagerer med blodet karvæggen, cellerne anholde og skal modstå den genererede forskydningsspænding. 1,2 Disse forskelle understreger behovet for bedre at forstå statisk klæbeevne og vedhæftning under strømningsforhold som to distinkte regulatoriske processer. Reguleringen af T-celle adhæsion kan mest rammende beskrives som controlling affinitet tilstand af integrin-molekyler udtrykt på celleoverfladen og derved regulere interaktionen af integriner med adhæsionsmolekylet ligander udtrykt på overfladen af det interagerende celle. Vores nuværende forståelse af reguleringen af integrin affinitet stater kommer fra ofte forsimplede in vitro modelsystemer. Assayet af adhæsion under anvendelse af strømningsforhold beskrevet her tillader visualisering og nøjagtig kvantificering af T-celle-epitel celle-interaktioner i realtid efter en stimulus. En adhæsion under flow assay kan anvendes til studier af adhæsion signalering inden T-celler efter behandling med inhiberende eller stimulerende stoffer. Derudover kan dette assay udvides ud over T-celle-signalering til enhver klæbende leukocytpopulationen og enhver integrin-adhæsionsmolekyle par.
T-lymfocyt vedhæftning medierer en række forskellige processer i et sundt immunsystem, 3 spiller kritiske roller i T-celle menneskehandel og antigen præsentation. Hvad enten under immunovervågning eller et aktivt immunrespons disse to brede roller for adhæsion er kritiske. 4 De fysiologiske signaleringsbegivenheder af T-celle-endotelcelle-interaktioner er forskellige fra T-celle-antigen-præsenterende celle (APC) interaktioner, og derfor kræver helt forskellige måder undersøgelse til bedst forstår signaleringskaskader involveret. Den faste adhæsion af en T celle til et blodkar væg under lymfocyt ekstravasation kræver hurtig og dynamisk aktivering integrin. Den stramme interaktion mellem en aktiv tilstand integrin og adhæsionsmolekyler langs endotel fører til adhæsion resistent over for strømmen af blod, hvilket tillader T-celler at kravle langs overfladen i søgning af et område permissiv til celle passage. 5 gennemgang af en T celle bi -directionally alonga blodkarvæggen er afhængige af polariseret adhæsion, med et særskilt klæbende forende af T-cellen. 6 Vigtigst faste adhæsion og transmigration kræver resistens over for forskydningskraften frembragt ved cirkulerende blod flow.
Når du designer eksperimenter for at studere lymfocyt vedhæftning, bør man være opmærksom på den specifikke stimulus af interesse. Mens integrinaktivering er en almindelig og kritisk komponent af alle former for T-celle-adhæsion, de kaskader af aktivering vil sandsynligvis være unik nedstrøms for individuelle receptorer og co-receptorer. Ligeledes integrin og vedhæftning molekyle par fungerer i specialiserede mikromiljøer og om særlige subpopulationer. På denne måde kan disse par reguleres ganske forskelligt. Modellen præsenteret her er ideel for studiet af signalering kaskader fører til integrinaktivering finder sted under forskydning stressbetingelser. 7 Disse interaktioner kan ikke i tilstrækkelig forstås i en statisk adhesion system på grund af virkningen af disse kræfter er blevet vist at have direkte på T-celle adfærd. 8 Selvom præsenteres her med T-celler og CHO (kinesisk hamsterovarie) celler konstrueret til at udtrykke human ICAM-1 (CHO-ICAM-celler) dåsen systemet let modificeres til at studere forskellige leukocytpopulationer eller adhæsionsmolekyler.
Dette assay tilvejebringer en fremgangsmåde til at kvantificere T-celle klæbeevne og integrin-aktivering ved hjælp af shear stress, hvilket giver en model for faste adhæsion fase af leukocyt-ekstravasation. Gennem brug af CHO-ICAM-celler kan undersøges affiniteten af LFA-1 til liganden med levende celler i realtid som respons på forskellige stimuli af interesse. Denne teknik kræver let opnås kommercielt tilgængelige mikro-flow kamre i kombination med en sprøjtepumpe, i høj grad forenkler det nødvendige udstyr til at modellere blodgennemstrømning og forskydningsspænding i forhold til andre modeller. 9 En anden stor fordel ved dette assay er, at signaleringkaskader og den resulterende aktiveringstilstanden af individuelle integriner kan rent undersøgt ved anvendelse af gensplejsede CHO-celler udtrykker humane adhæsionsmolekyler af interesse. Derudover kan kombinationen af kvantitative data med levende celler er en væsentlig fordel ved denne fremgangsmåde. Samlet, medens en række assays af statisk T-celle adhæsion er blevet beskrevet, at pænt Model T-celle-APC interaktioner, disse modeller er utilstrækkelig til at fange den dynamiske proces med T-celle-epitel vedhæftning. Af denne grund, når de vælger en adhæsion assay må betragtes som den stimulus pågældende.
For at kunne analysere T-celle adhæsion, at det stimulerende middel være inkluderet i undersøgelsen skal overvejes ved valg af en in vitro-fremgangsmåde. Mens der er flere analyser for at studere signaler, der fører til LFA-1 aktivering og ICAM-1 binding alle metoder ikke er indbyrdes udskiftelige. En statisk vedhæftning assay 10 er bedst egnet til at studere T-celle-APC-interaktioner; alternativt forskydningsspændingen metode beskrevet her er ideel til model T-celle-epitel celle-interaktioner…
The authors have nothing to disclose.
The Rheumatology Research Foundation and the Hirschil Trust supported this work.
T cell samples (cell line or primary) | ATCC | TIB-152 | Peripheral human T cells |
CHO-ICAM-1 cells | ATCC | CRL-2093 | |
µ-Slide VI 0.4 ibiTreat | ibidi | 80606 | |
500 ml glass bottle | Fisher | FB800500 | |
250 ml glass bottle | Fisher | FB800250 | |
Silicone tubing 0.8 mm | ibidi | 10841 | |
Confocal microscope with incubator chamber | Ziess | 700 | Any wide field fluorescent microscope |
Syringe pump | New Era Pump Systems | NE-300 | |
60 ml syringe | BD | 309653 | |
CFSE | eBioscience | 65-0850 | |
SDF-1α | R&D | 350-NS-010/CF | |
RPMI | Lonza | 12-702F/12 | |
PBS | Lonza | 17-516F | |
Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 | |
D-Glucose | Sigma Aldrich | G8270 | |
PMA | Sigma Aldrich | 16561-29-8 | |
Volocity software | Perkin Elmer | Version 6.2.1 | |
ImageJ software | NIH | Version 1.48V | |
Tissue-culture treated culture dishes | Falcon | 353003 | |
Trypsin-EDTA (0.25%) Phenol Red | Gibco | 25200114 | |
Heat Inactivated FBS | Denville | FB5001-H | |
Penicillin/Streptomycin | Fisher | BP295950 |