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Immunology and Infection

टी लिम्फोसाइट-आसंजन अणु बातचीत का अध्ययन के लिए आसंजन के तहत कतरनी तनाव की परख

doi: 10.3791/54203 Published: June 29, 2016

Summary

इस प्रवाह आसंजन परख टी सेल उपकला सेल बातचीत का एक सरल, उच्च प्रभाव मॉडल उपलब्ध कराता है। एक सिरिंज पंप कतरनी तनाव उत्पन्न करने के लिए प्रयोग किया जाता है, और confocal माइक्रोस्कोपी मात्रा का ठहराव के लिए छवियों कब्जा। इन अध्ययनों के लक्ष्य को प्रभावी ढंग से प्रवाह की स्थिति का उपयोग कर टी सेल आसंजन यों की है।

Abstract

कुल मिलाकर, टी सेल आसंजन सूजन और प्रतिरक्षा synapses के गठन में प्रतिजन कोशिकाओं (एपीसी) के साथ बातचीत की साइटों के लिए सेलुलर भर्ती के विशिष्ट प्रक्रियाओं के लिए योगदान, समारोह के एक महत्वपूर्ण घटक है। टी सेल आसंजन के इन दो संदर्भों, कि टी सेल एपीसी बातचीत स्थिर माना जा सकता है में मतभेद है, जबकि टी सेल की रक्त वाहिनियों की बातचीत परिसंचरण खुद के द्वारा उत्पन्न कतरनी तनाव से चुनौती दी है। टी सेल एपीसी कि बातचीत में स्थिर के रूप में वर्गीकृत कर रहे हैं दो सेलुलर भागीदारों एक दूसरे को स्थिर रिश्तेदार हैं। आमतौर पर, इस बातचीत लिम्फ नोड्स के भीतर होता है। एक टी सेल रक्त वाहिनियों की दीवार के साथ सूचना का आदान प्रदान के रूप में, कोशिकाओं को गिरफ्तार करने और उत्पन्न कतरनी तनाव का विरोध करना चाहिए। 1,2 इन मतभेदों को बेहतर दो अलग नियामक प्रक्रियाओं के रूप में प्रवाह शर्तों के तहत स्थिर आसंजन और आसंजन को समझने की आवश्यकता पर प्रकाश डाला। टी सेल आसंजन के नियमन के सबसे संक्षेप चोर के रूप में वर्णित किया जा सकताकोशिका की सतह पर व्यक्त अणुओं इंटीग्रिन, और इस तरह आसंजन अणु बातचीत कोशिका की सतह पर व्यक्त ligands के साथ इंटेग्रिन की बातचीत को विनियमित करने की आत्मीयता राज्य trolling। हमारे इंटीग्रिन आत्मीयता के राज्यों के नियमन की वर्तमान समझ अक्सर इन विट्रो मॉडल प्रणाली में ही साधारण से आता है। आसंजन प्रवाह यहाँ वर्णित शर्तों का उपयोग करने की परख दृश्य और एक उत्तेजना के बाद वास्तविक समय में टी सेल उपकला सेल बातचीत की सही मात्रा का ठहराव के लिए अनुमति देता है। प्रवाह परख के तहत एक आसंजन निरोधात्मक या उत्तेजक पदार्थ के साथ इलाज के बाद टी कोशिकाओं के भीतर संकेत आसंजन के अध्ययन के लिए लागू किया जा सकता है। साथ ही, इस परख किसी भी चिपकने वाला ल्युकोसैट आबादी और किसी भी इंटीग्रिन आसंजन अणु जोड़ी को टी सेल संकेतन परे का विस्तार किया जा सकता है।

Introduction

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टी लिम्फोसाइट आसंजन, एक स्वस्थ प्रतिरक्षा प्रणाली में विशिष्ट प्रक्रियाओं की एक संख्या में मध्यस्थता 3 टी सेल की तस्करी और प्रतिजन प्रस्तुति में महत्वपूर्ण भूमिका निभा रहा है। प्रतिरक्षा निगरानी या एक सक्रिय प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया आसंजन के लिए इन दो व्यापक भूमिकाओं महत्वपूर्ण हैं दौरान या नहीं। 4 टी सेल endothelial सेल बातचीत के शारीरिक संकेत घटनाओं सेल पेश (एपीसी) बातचीत टी सेल प्रतिजन से अलग कर रहे हैं, और इसलिए की अलग तरीकों की आवश्यकता होती है अध्ययन सबसे अच्छा शामिल cascades संकेत समझने के लिए। लिम्फोसाइट परिस्त्राव के दौरान एक रक्त वाहिका दीवार के लिए एक टी सेल की फर्म आसंजन तेजी से और गतिशील इंटीग्रिन सक्रियण की आवश्यकता है। Endothelium साथ एक सक्रिय राज्य इंटीग्रिन और आसंजन अणुओं के बीच बातचीत तंग आसंजन रक्त के प्रवाह के लिए प्रतिरोधी की ओर जाता है, टी कोशिकाओं एक क्षेत्र सेल पारित होने के लिए अनुमोदक की तलाश में सतह के साथ क्रॉल करने के लिए अनुमति देता है। 5 एक टी सेल द्वि के रेंगने -directionally Alonगा रक्त वाहिनियों की दीवार ध्रुवीकरण आसंजन पर निर्भर है। टी सेल की एक अलग चिपकने वाला सामने अंत के साथ, 6 सबसे महत्वपूर्ण बात, फर्म आसंजन और स्थानांतरगमन कतरनी रक्त के प्रवाह में घूम द्वारा उत्पन्न बल के लिए प्रतिरोध की आवश्यकता होती है।

जब लिम्फोसाइट आसंजन का अध्ययन करने के प्रयोगों को डिजाइन, ध्यान हित के विशिष्ट प्रोत्साहन के लिए भुगतान किया जाना चाहिए। जबकि इंटीग्रिन सक्रियण टी सेल आसंजन के सभी रूपों का एक आम और महत्वपूर्ण घटक है, सक्रियण के cascades अद्वितीय व्यक्ति रिसेप्टर्स और सह रिसेप्टर्स के बहाव होने की संभावना है। इसी तरह, इंटीग्रिन और आसंजन अणु जोड़े विशेष microenvironments में और विशिष्ट उप-जनसंख्या पर कार्य करते हैं। इस तरह, इन जोड़ों काफी अलग विनियमित किया जा सकता है। मॉडल यहाँ प्रस्तुत सक्रियण कतरनी तनाव की शर्तों के तहत जगह लेने के लिए अग्रणी इंटीग्रिन cascades संकेत के अध्ययन के लिए आदर्श है। 7 इन मुलाकातों पर्याप्त रूप से एक स्थिर adhesi में नहीं समझा जा सकतासिस्टम पर प्रभाव के कारण इन बलों टी सेल व्यवहार पर सीधे है दिखाया गया है। 8 हालांकि टी कोशिकाओं और चो (चीनी हैम्स्टर अंडाशय) कोशिकाओं मानव ICAM-1 (चो ICAM सेल) को व्यक्त करने के लिए इंजीनियर सिस्टम कर सकते हैं के साथ यहां प्रस्तुत आसानी से अलग ल्युकोसैट आबादी या आसंजन अणुओं का अध्ययन करने के लिए संशोधित किया जाना है।

इस परख कतरनी तनाव का उपयोग कर, ल्युकोसैट परिस्त्राव की फर्म आसंजन चरण के लिए एक मॉडल उपलब्ध कराने के टी सेल चिपचिपाहट और इंटीग्रिन सक्रियण यों तो एक तरीका प्रदान करता है। चो ICAM कोशिकाओं के उपयोग के माध्यम से जीवित कोशिकाओं में अपने ligand के लिए LFA-1 की आत्मीयता हित के विभिन्न उत्तेजनाओं के जवाब में वास्तविक समय में जांच की जा सकती है। इस तकनीक को आसानी से एक सिरिंज पंप के साथ प्राप्त की आवश्यकता है, संयोजन में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सूक्ष्म प्रवाह कक्षों, बहुत उपकरणों रक्त प्रवाह और कतरनी तनाव मॉडल करने के लिए आवश्यक सरल बनाने के अन्य मॉडलों की तुलना में। 9 इस परख का एक अन्य प्रमुख लाभ यह है कि विशिष्ट संकेत हैझरने और व्यक्तिगत इंटेग्रिन के परिणामस्वरूप सक्रियण राज्य सफाई से इंजीनियर चो कोशिकाओं हित के मानव आसंजन अणुओं को व्यक्त करने के उपयोग के माध्यम से अध्ययन किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, जीना सेल इमेजिंग के साथ मात्रात्मक डेटा का संयोजन इस पद्धति का एक महत्वपूर्ण लाभ है। कुल मिलाकर, स्थिर टी सेल आसंजन की assays के एक नंबर का वर्णन किया गया है, जबकि कि अच्छी तरह से टी सेल एपीसी बातचीत मॉडल, इन मॉडलों टी सेल उपकला आसंजन के गतिशील प्रक्रिया पर कब्जा करने में अपर्याप्त हैं। इस कारण से, जब एक आसंजन परख चुनने के सवाल में प्रोत्साहन विचार किया जाना चाहिए।

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Protocol

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1. चढ़ाना चो ICAM प्रकोष्ठों

नोट: इस कदम का लक्ष्य चो ICAM कोशिकाओं को एक मिला हुआ monolayer पैदा करने के लक्ष्य के साथ रात भर के विकास के लिए प्रवाह कक्षों में थाली करने के लिए है।

  1. 5% के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (चो ICAM पूरी संस्कृति मीडिया) के साथ पूरक 10 मिलीलीटर RPMI मीडिया में 10 सेमी ऊतक संस्कृति इलाज संस्कृति बर्तन में चो ICAM कोशिकाओं को बनाए रखें सीओ 2।
  2. कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए, 1 मिलीलीटर 0.5% trypsin EDTA जोड़ें और कोमल झटकों के साथ 1 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं। मीडिया के 4 मिलीलीटर के साथ trypsin बेअसर।
  3. एक hemacytometer का उपयोग चो ICAM कोशिकाओं की गणना और चैम्बर प्रति 0.75 x 10 5 कोशिकाओं की गणना। नोट: इस प्रयोग में 2.25 x 10 5 कोशिकाओं 3 कक्षों बीज के लिए आवश्यक हो जाएगा।
  4. अपकेंद्रित्र 0.75 x 10 5 चो ICAM चैम्बर प्रति 5 मिनट के लिए 500 XG, कमरे के तापमान पर कोशिकाओं और चो के चैंबर प्रति 30 μl में सेल गोली resuspend-ICAM पूरी संस्कृति मीडिया।
    नोट: इस प्रयोग में 90 μl 3 कक्षों बीज के लिए आवश्यक हो जाएगा।
  5. धीरे-धीरे प्रवाह चैम्बर के एक जलाशय में कोशिकाओं को जोड़ने। कोशिकाओं 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 5 मिनट के लिए व्यवस्थित करने की अनुमति दें।
  6. प्रत्येक कक्ष के दो जलाशयों भर में पूरी संस्कृति मीडिया के 200 μl जोड़ें। दोनों के बीच वैकल्पिक जोड़ कोशिकाओं के आंदोलन से बचने के लिए के रूप में प्रणाली equilibrates।
  7. 5% सीओ 2 के साथ एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर अंदर रातोंरात कोशिकाओं को सेते हैं।

2. टी कोशिकाओं की तैयारी

नोट: यह परख प्राथमिक मानव टी कोशिकाओं या एक टी सेल लाइन के साथ किया जा सकता है। खून से टी सेल अलगाव पर एक प्रोटोकॉल पहले से वर्णित किया गया है। 10 का उपयोग प्राथमिक मानव टी कोशिकाओं अच्छे परिणाम के लिए हौसले से अलग कक्षों का उपयोग करते हैं। एक टी सेल लाइन का उपयोग करते हैं, तो कोशिकाओं का स्रोत द्वारा निर्दिष्ट संस्कृति प्रोटोकॉल का पालन करें। आदेश में एक फ्लोरोसेंट microsco पर कोशिकाओं का पता लगाने के लिएपीई टी कोशिकाओं carboxy fluorescein succinimidyl एस्टर (CFSE) के साथ लेबल रहे हैं।

  1. एक hemacytometer का उपयोग टी कोशिकाओं की गणना और चैम्बर प्रति 2 एक्स 10 6 कोशिकाओं की गणना। नोट: इस प्रयोग में, 6 x 10 6 कोशिकाओं 3 कक्षों के लिए आवश्यक हो जाएगा।
  2. अपकेंद्रित्र 2 एक्स 10 6 टी 500 XG, कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए चैम्बर प्रति कोशिकाओं और फॉस्फेट बफर खारा के 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं (पीबीएस) 1% ग्लूकोज या 2% FBS युक्त resuspend।
  3. CFSE 1 में जोड़ें: 1,000 कमजोर पड़ने (शेयर 5 मिमी) बनाया है। प्रकाश से कवर और आरटी पर 8 मिनट के लिए सेते
  4. 5 मिनट, आरटी के लिए 500 XG पर स्पिन।
  5. शर्त के अनुसार 240 μl के साथ Resuspend सेल गोली RPMI मीडिया कमी सीरम की (धारा 4 "नोट" देखें)। इस प्रयोग में, सादा RPMI के 720 μl में सेल गोली resuspend। खाली 1.5 मिलीलीटर ट्यूबों प्रत्येक कक्ष, ट्यूब प्रति 240 μl के लिए लेबल में कोशिकाओं के विभाजन। उपयोग करें जब तक एक 37 डिग्री सेल्सियस गर्मी ब्लॉक में कोशिकाओं रखें।

3. वें स्थापनाई इनपुट / आउटपुट Hosing और सिरिंज पंप

  1. 37 डिग्री सेल्सियस के लिए माइक्रोस्कोप लाइव इमेजिंग कक्ष गर्म।
  2. इनपुट hosing तैयार:
    1. पानी के साथ एक 500 मिलीलीटर कांच की बोतल भरें और ढक्कन में 2 छेद करते हैं। और "में" छेद लेबल "बाहर।" इस इनपुट मीडिया के लिए एक पानी गर्म स्नान के रूप में कार्य करेगा।
    2. इनपुट ढक्कन में और पानी के स्नान में छेद के माध्यम से hosing चलाएँ। सुनिश्चित करें कि hosing सिरिंज को जोड़ता के पक्ष छेद "में" और पक्ष है कि इनपुट जलाशय से कनेक्ट करेगा माध्यम से आता है "बाहर" छेद के माध्यम से आता है।
    3. इनपुट पानी की 60 मिलीलीटर के साथ hosing प्रणाली से किसी भी हवा निकालने के लिए फ्लश।
    4. प्रधानमंत्री इनपुट RPMI मीडिया सीरम की कमी के साथ hosing 37 डिग्री सेल्सियस तक गरम। एक 60 मिलीलीटर सिरिंज भरें और मीडिया के माध्यम से धक्का जब तक पूरी तरह से hosing primed और किसी भी हवाई बुलबुले की कमी है।
      नोट: lengt पर निर्भर करता हैट्यूबिंग का ज मात्रा प्रधानमंत्री की आवश्यकता पर अलग अलग होंगे इस्तेमाल किया।
      1. प्रयोग (यहां 3) मिनट में (5 मिनट) कक्षों की संख्या से की संख्या से प्रवाह (यहां 0.3 मिलीग्राम / मिनट) की दर से गुणा करके प्रयोग के लिए आवश्यक मीडिया की मात्रा की गणना; इस प्रयोग में, 4.5 मिलीग्राम मीडिया का उपयोग करें। नोट: हम 5 मिलीलीटर होने अतिरिक्त मात्रा (यहां 9.5 मिलीलीटर कुल) भड़काना के बाद सिरिंज में शेष सलाह देते हैं।
    5. पूरे इनपुट सेटअप माइक्रोस्कोप का जीना इमेजिंग बाड़े बनाए रखने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस में रखें। hosing चलाने के लिए और बाड़े के बाहर सिरिंज और सिरिंज पंप में सिरिंज लोड।
  3. उत्पादन hosing तैयार:
    1. उत्पादन अपशिष्ट के रूप में उपयोग करने के लिए एक 250 मिलीलीटर की बोतल के ढक्कन में एक छेद बनाओ।
    2. छेद के माध्यम से और बोतल में उत्पादन ट्यूबिंग चलाएँ। शिथिल, ढक्कन सुरक्षित सभी तरह से बंद नहीं।
    3. उत्पादन सेटअप मील का जीना इमेजिंग बाड़े में रखेंcroscope।
  4. प्रवाह की दर (मिलीग्राम / मिनट) आवश्यक गणना वांछित कतरनी तनाव (dyn / 2 सेमी) उत्पन्न करने के लिए। कतरनी तनाव अलग संवहनी डिब्बों में बदलता है, इसलिए खाते में सेल प्रकार का अध्ययन किया जा रहा है और उपचार जब एक कतरनी तनाव के स्तर पर निर्णय लेने सहित समग्र मॉडल ले।
    नोट: इन प्रयोगों 0.4 dyn / 2 सेमी पर आयोजित की जाती हैं बारीकी से एक छोटी सी नस सेटिंग नकल करने के लिए।
    1. जब कतरनी तनाव की गणना खाते में चैम्बर आयाम ले। निम्न सूत्र प्रवाह यहां इस्तेमाल किया कक्षों के लिए (निर्माता 11 द्वारा प्रदान की) का उपयोग करें (सामग्री की तालिका देखें): टी = η * 176.1 * ओ जहां टी = कतरनी तनाव, η = dynamical चिपचिपाहट, o = प्रवाह की दर। नोट: 37 डिग्री सेल्सियस पर RPMI मीडिया के dynamical चिपचिपापन 0.007 है।

4. प्रवाह कक्षों और कोशिकाओं की उत्तेजना के लोड हो रहा है

नोट: आसंजन आरंभ करने के लिए,टी कोशिकाओं को प्रेरित किया जाना चाहिए। निम्नलिखित प्रयोग में कोशिकाओं या तो unstimulated रहेगा या एसडीएफ 1α 12 या phorbol myristate एसीटेट (पीएमए, सकारात्मक नियंत्रण) के साथ प्रेरित कर रहे हैं 13। टी सेल को केमोकाइन की उचित प्रस्तुति के लिए, चो ICAM सेल, एसडीएफ 1α (सीरियल washes के द्वारा पीछा) के साथ preincubated रहे हैं कोशिका की सतह पर प्रस्तुति के लिए अनुमति देता है। पीएमए एक phorbol एस्टर कि संरचनात्मक रूप से दूसरा दूत diacyl ग्लिसरॉल (डेग) के समान है; यहाँ यह एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में प्रयोग किया जाता है। टी कोशिकाओं सीधे पीएमए के साथ व्यवहार कर रहे हैं प्रवाह कक्ष में लोड करने से पहले।

  1. माइक्रोस्कोप पर प्रवाह कक्ष स्लाइड प्लेस और 20x उद्देश्य का उपयोग चो ICAM monolayer पर फोकल हवाई जहाज़ की स्थापना की।
  2. 37 डिग्री सेल्सियस गर्मी ब्लॉक में अन्य सभी स्थितियों के लिए CFSE से सना हुआ टी कोशिकाओं रखें। के रूप में तुरंत कि इस हालत के लिए परख करने से पहले इस प्रकार चो ICAM या टी कोशिकाओं को तैयार:
    1. unstimulated हालत (चैम्बर 1) के लिए, एक ट्यूब / प्रवाह CH रखनेएम्बर इलाज, उत्तेजना के लिए के रूप में नकारात्मक नियंत्रण सेवा के लिए।
    2. पीएमए उत्तेजना (चैम्बर 2) के लिए, पीएमए (10 एनजी / एमएल) के साथ टी कोशिकाओं के रूप में सकारात्मक नियंत्रण की सेवा करने की एक ट्यूब को प्रोत्साहित; प्रवाह कक्ष में लोड करने से पहले तुरंत इलाज करते हैं।
    3. एसडीएफ 1α उत्तेजना, (चैम्बर 3) के लिए, ऊपरी जलाशय (उत्पादन जलाशय) से 3 बार एक समय में 70 μl को हटाने और फिर एसडीएफ के 70 μl जोड़कर एसडीएफ 1α (100 एनजी / एमएल) के साथ तीसरे प्रवाह कक्ष को प्रोत्साहित -1α (100 एनजी / एमएल) के निचले जलाशय (इनपुट जलाशय) में। 5 मिनट के लिए सेते हैं।
  3. एक कक्ष का उत्पादन जलाशय से निकालें और 3 बार एक समय में 70 μl त्यागें।
  4. इनपुट जलाशय में पूर्व इलाज (जो लागू हो) टी सेल निलंबन के 70 μl जोड़ें 3 बार। कोशिकाओं चैम्बर ( "में") की प्रवेश से स्थानांतरित करने के लिए अनुमति देने के लिए 5 मिनट रुको, और चैम्बर के समीपस्थ आउटलेट ( "बाहर") तक पहुँचने के लिए।
  5. इस समय के दौरान, छवि 5CFSE से सना हुआ टी कोशिकाओं के लिए खेतों। क्षेत्रों है कि चैम्बर (चित्रा 1) के केंद्र भर में बिखरे हैं चुनें। उत्तेजना लेजर तरंगदैर्ध्य: निम्नलिखित / उत्तेजना उत्सर्जन की स्थिति का उपयोग 488 एनएम; उत्सर्जन संग्रह फिल्टर: 500 - 540 एनएम। इन छवियों को प्री-प्रवाह सेल की गिनती के रूप में काम करेगा।
  6. प्रवाह कक्ष जलाशयों को एक साथ इनपुट और आउटपुट ट्यूबिंग संलग्न।
    नोट: एक साथ ट्यूबिंग संलग्न महत्वपूर्ण है के रूप में तो कक्ष में हवा बुलबुले परिचय और कक्ष के भीतर समग्र संतुलन को बनाए रखने के लिए नहीं है।
  7. 0.3 मिलीग्राम / मिनट (0.4 dyn / 2 सेमी) पर प्रवाह शुरू CFSE से सना हुआ टी कोशिकाओं visualizing है। प्रवाह शुरू होता है, के रूप में विशेष रूप से पहली कक्ष के साथ, वहाँ अक्सर प्रवाह की शुरुआत और टी सेल रोलिंग के अवलोकन के बीच एक अंतराल है, इसलिए टी सेल आंदोलन की शुरुआत में शुरू समय 5 मिनट।
  8. 5 मिनट के बाद प्रवाह बर्खास्त, और CFSE चैनल में छवि 5 क्षेत्रों। बेतरतीब ढंग से अपरोक्ष छितरी क्षेत्रों का चयनप्रवाह कक्ष के केंद्र ughout (चित्रा 1)। इन छवियों को पोस्ट-प्रवाह सेल की गिनती के रूप में काम करेगा।

5. पक्षपाती कोशिकाओं का प्रतिशत निर्धारित

नोट: अधिग्रहीत छवियों में कोशिकाओं की संख्या का निर्धारण स्वचालित सॉफ्टवेयर के साथ निष्पक्ष किया जाता है। हमारे अध्ययन के लिए हम सॉफ्टवेयर Volocity (संस्करण 6.2.1), लेकिन अन्य सॉफ्टवेयर ऐसे ImageJ (संस्करण 1.48V) के रूप में इस्तेमाल भी लागू होते हैं।

  1. प्रति हर हालत के लिए पूर्व क्षेत्र प्रवाह कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करते हैं। 5 क्षेत्रों की औसत "पूर्व प्रवाह औसत सेल गिनती है।" 7
  2. प्रति हर हालत के लिए क्षेत्र के बाद प्रवाह कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करते हैं। 5 क्षेत्रों की औसत "के बाद प्रवाह औसत सेल गिनती है।" 7
  3. निम्न सूत्र का उपयोग पक्षपाती कोशिकाओं के प्रतिशत की गणना: पक्षपाती कोशिकाओं = (पोस्ट-प्रवाह औसत सेल गिनती) / (पूर्व प्रवाह औसत सेल गिनती) का प्रतिशत x 100%।

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Representative Results

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के रूप में संकेत प्रतिनिधि परिणाम, Jurkat और प्राथमिक मानव CD3 + टी कोशिकाओं का उपयोग प्रवाह आसंजन परख से दिखाए जाते हैं, एसडीएफ 1α के साथ प्रेरित। सभी दिखाए गए प्रयोगों में नकारात्मक नियंत्रण unstimulated कोशिकाओं रहे हैं। unstimulated कोशिकाओं की एक सीमा बेसल प्रतिशत आसंजन के बीच 5 - 10%; विशेष रूप से इस सीमा से ऊपर आधार आसंजन एक समस्याग्रस्त प्रयोग इंगित करता है और पता चलता है टी कोशिकाओं की शुरुआत आबादी nonspecifically तैयारी में पूर्व सक्रिय थे। पक्षपाती कोशिकाओं unstimulated कोशिकाओं के उस पर हर हालत में पोस्ट-प्रवाह प्रतिशत आसंजन की गणना के लिए इसके अलावा में गणना की जा सकती की संख्या में वृद्धि मोड़ो। इन दोनों गणना के तरीकों का प्रतिनिधित्व डेटा यहां शामिल किया गया है।

चित्रा 2A हर हालत पूर्व और बाद के प्रवाह के लिए प्रवाह कक्ष के भीतर क्षेत्रों के प्रतिनिधि छवियों से पता चलता। प्रयोग करने से पहले, Jurkat (शोn 2A चित्रा) या प्राथमिक मानव CD3 + टी कोशिकाओं में शुद्ध, गिना, और CFSE के साथ लेबल रहे हैं। प्रत्येक प्रयोगात्मक हालत के लिए 2 एक्स 10 6 कोशिकाओं लेबल रहे थे। Unstimulated टी कोशिकाओं प्रवाह उपस्थिति या एसडीएफ 1α के अभाव में चो ICAM कोशिकाओं से युक्त कक्षों में भरी हुई थी। टी कोशिकाओं 5 मिनट के लिए ले जाते हैं और चैम्बर में जमा करने के लिए अनुमति दी गई है, और इस समय के दौरान छवियों पूर्व प्रवाह में गिना जाता है निर्धारित करने के लिए कब्जा कर लिया गया। अलग stimulations के बीच कोशिकाओं के एक तुलनीय नंबर प्री-प्रवाह वर्दी प्रयोगात्मक शर्तों बीमा के लिए आवश्यक है। प्रवाह द्वारा उत्पन्न निरंतर कतरनी तनाव के 5 मिनट के बाद, छवियों फिर से पोस्ट-प्रवाह में गिना जाता है निर्धारित करने के लिए कब्जा कर लिया गया। यह इन छवियों प्रतिनिधि है कि एसडीएफ 1α टी कतरनी तनाव के तहत चो ICAM कोशिकाओं का पालन करने में सक्षम कोशिकाओं की संख्या बढ़ जाती है के माध्यम से स्पष्ट है।

चित्रा 2 बी कैलोरी के रूप में टी सेल आसंजन में गुना परिवर्तन को दर्शाता हैJurkat टी कोशिकाओं की संख्या पूर्व और बाद के प्रवाह या तो unstimulated या एसडीएफ 1α की उपस्थिति में के आधार पर culated। हर हालत के लिए 5 क्षेत्रों पूर्व प्रवाह की औसत सेल मायने रखता है और 5 क्षेत्रों पोस्ट-प्रवाह निर्धारित किया गया है, और unstimulated को एसडीएफ 1α उत्तेजना की तुलना टी सेल आसंजन में गुना परिवर्तन की गणना करने के लिए प्रयोग किया जाता है। यहाँ दिखाया गया है, एसडीएफ 1α आसंजन में एक के पास 2 गुना वृद्धि unstimulated की तुलना में लाती है।

चित्रा -2 डेटा गणना का एक वैकल्पिक तरीका दर्शाता है। यहां उपस्थिति या एसडीएफ 1α के अभाव में प्राथमिक मानव CD3 + टी कोशिकाओं का प्रतिशत आसंजन पहले, औसत पूर्व और बाद के प्रवाह टी कोशिकाओं की गिनती का निर्धारण तो पूर्व प्रवाह औसत से पोस्ट-प्रवाह औसत विभाजित करके निर्धारित किया जाता है और इस गणना के माध्यम से 100 से गुणा पूरे पूर्व प्रवाह जनसंख्या 100% आसंजन प्रतिनिधित्व करता है। यहाँ दिखाया गया है, unstimulated टी कोशिकाओं का 15% कतरनी stre के तहत पालनके रूप में एसडीएफ 1α के साथ प्रेरित टी कोशिकाओं के 50% की तुलना में एस एस।

आकृति 1
चित्रा 1. यह समरूप प्रवाह के संपर्क में केवल क्षेत्रों का विश्लेषण करने के लिए महत्वपूर्ण है। प्रवाह जहां खेतों imaged किया जाना चाहिए के संकेत के साथ इस्तेमाल किया कक्षों की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। प्रति चैम्बर निर्माताओं द्वारा उपलब्ध कराई गई जानकारी के रूप में, पूर्व निर्धारित प्रवाह की दर केवल कक्षों का केंद्र है, इस योजना में नारंगी ने संकेत के माध्यम से हासिल की है। चैम्बर की सीमाओं के करीब प्रवाह की दर कम हो जाती है और प्रयोगात्मक इमेजिंग या विश्लेषण में शामिल नहीं किया जाना चाहिए। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2 <strong> एसडीएफ 1α कतरनी तनाव के तहत ICAM-1 टी सेल आसंजन लाती है। Jurkat टी कोशिकाओं 5 माइक्रोन की एकाग्रता पर CFSE के साथ लेबल रहे थे। इसके बाद, कोशिकाओं प्रवाह कक्षों कि एसडीएफ 1α (100 एनजी / एमएल) या unstimulated साथ pretreated और confocal खुर्दबीन पर स्थापित किया है और 5 मिनट के लिए ले जाते हैं और चैम्बर में जमा करने के लिए अनुमति दी गई थी में भरी हुई थी। वैकल्पिक रूप से, Jurkat टी कोशिकाओं पीएमए (10 एनजी / एमएल) के प्रवाह कक्षों के अलावा करने से पहले साथ pretreated थे। उन 5 मिनट पूर्व प्रवाह छवियों के दौरान कब्जा कर लिया गया। प्रवाह तो 0.4 dyn / 2 सेमी पर शुरू किया गया था 5 मिनट के लिए कतरनी तनाव पैदा करने के लिए। पूरा होने पर, पद-प्रवाह छवियों पर कब्जा कर लिया गया था। Jurkat टी कोशिकाओं के प्रतिनिधि चित्र दिखाए जाते हैं, पैमाने बार 50 माइक्रोन। बी Jurkat टी कोशिकाओं के आसंजन में मोड़ो परिवर्तन पहले हर हालत के लिए औसत पूर्व और बाद के प्रवाह कोशिकाओं की गिनती का निर्धारण करने और औसत के बाद प्रवाह गिनती विभाजित करके गणना की गई औसत पूर्व प्रवाह सह द्वाराहर हालत के लिए व्यक्तिगत रूप से UNT। प्रत्येक उत्तेजना की स्थिति, यहां एसडीएफ 1α या पीएमए के लिए यह आसंजन भागफल, तो आसंजन में गुना परिवर्तन का निर्धारण करने के unstimulated आसंजन भागफल से विभाजित है। बार्स ± प्राथमिक मानव CD3 + टी कोशिकाओं के SEM। सी प्रतिशत आसंजन 3 प्रयोगों की औसत प्रतिनिधित्व करते हैं पहले हर हालत के लिए औसत पूर्व और बाद के प्रवाह कोशिकाओं की गिनती के निर्धारण से गणना की गई। हर हालत के लिए औसत पद-प्रवाह गिनती जिसके परिणामस्वरूप प्रतिशत आसंजन पूर्व प्रवाह कोशिकाओं की संख्या 100% आसंजन जा रहा है पर आधारित है औसत पूर्व प्रवाह गिनती से विभाजित है और 100 से गुणा किया जाता है। सलाखों SEM ± 5 प्रयोगों की औसत प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. टीकोशिकाओं को पहले तो जमा चो ICAM monolayer पर प्रवाह। Jurkat टी कोशिकाओं 5 माइक्रोन की एकाग्रता पर CFSE के साथ लेबल रहे थे। इसके बाद, कोशिकाओं प्रवाह कक्षों कि एसडीएफ 1α (100 एनजी / एमएल) के साथ pretreated और confocal खुर्दबीन पर स्थापित किया है और 5 मिनट के लिए ले जाते हैं और चैम्बर में जमा करने के लिए अनुमति दी गई थी में भरी हुई थी। इन 5 मिनट छवियों के दौरान एक समय चूक श्रृंखला के रूप में कब्जा कर लिया गया; अभी भी फ्रेम (ए)। प्रवाह तो 0.4 dyn / 2 सेमी पर शुरू किया गया था 5 मिनट के लिए कतरनी तनाव पैदा करने के लिए। इन 5 मिनट छवियों के दौरान एक समय चूक श्रृंखला के रूप में कब्जा कर लिया गया; अभी भी (बी) के फ्रेम। इन छवियों में प्रवाह की दिशा नीचे से ऊपर तक है, और फोकल हवाई जहाज़ चो ICAM monolayer पर सेट है। कम के रूप में, क्षैतिज लाइनों (1) टी प्रवाह दर पर monolayer साथ रोलिंग कोशिकाओं कल्पना कर रहे हैं नीचे से चलती क्षेत्र भर में शीर्ष करने के बाद से वे तेजी से आगे बढ़ रहे हैं, जबकि imaged किया जा रहा: टी कोशिकाओं 3 समूहों में वर्गीकृत किया जा सकता है। (2) टी कोशिकाओं crawlinmonolayer साथ जी। इन कोशिकाओं को मजबूती से प्रतिरोध करने के लिए प्रवाह के आधार पर पालन कर रहे हैं, और एक क्षेत्र सेलुलर पारित होने के लिए स्वतंत्र है, जो इस मॉडल में नहीं मनाया जाता है की तलाश में होने की संभावना रेंग रहे हैं। (3) टी कोशिकाओं है कि मजबूती से monolayer का पालन करना, प्रवाह करने के लिए प्रतिरोधी रहे हैं, लेकिन स्थिर रहे हैं। इन कोशिकाओं को सक्रिय रूप से नहीं चल रहे हैं या monolayer साथ रेंगने। एक और अधिक परिष्कृत विश्लेषण किया जा सकता है, इस अध्ययन के लक्ष्यों के आधार पर, आगे मात्रा का ठहराव या लक्षण वर्णन के लिए इन सेल आबादी काटना लिए बनाया गया एक ImageJ स्क्रिप्ट के उपयोग के माध्यम से। स्केल 50 माइक्रोन सलाखों। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. चो ICAM कोशिकाओं को एक मिला हुआ monolayer फार्म चाहिए। एक मिला हुआ चो ICAM monolay के प्रतिनिधि छविएक प्रवाह कक्ष के भीतर इंजी। स्केल बार 10 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

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क्रम में ठीक से टी सेल आसंजन का विश्लेषण करने के लिए, उत्तेजक अध्ययन में शामिल किया जा सकता है जब इन विट्रो विधि चुनने पर विचार किया जाना चाहिए। जबकि वहाँ LFA-1 सक्रियण और ICAM-1 बाइंडिंग के लिए अग्रणी संकेतों का अध्ययन करने के लिए कई assays हैं सभी तरीकों विनिमेय नहीं हैं। एक स्थिर आसंजन परख 10 सर्वश्रेष्ठ टी सेल एपीसी बातचीत का अध्ययन करने के लिए अनुकूल है; वैकल्पिक रूप से, कतरनी तनाव विधि यहाँ विस्तृत आदर्श टी सेल उपकला सेल बातचीत करने के लिए मॉडल के रूप में Chemokines, endothelium साथ प्रस्तुत कर रहे हैं टी कोशिकाओं रोलिंग मजबूती से पालन करने और प्रवाह खून की कतरनी तनाव 14,15 विरोध से जवाब चाहिए है। विवो में। इस कारण से, केमोकाइन संकेत के अध्ययन के लिए सबसे अच्छा एक परख है कि कतरनी तनाव को शामिल किया गया में अध्ययन किया जा करने के लिए उपयुक्त है। इस आसंजन प्रवाह की स्थिति का उपयोग करने का प्राथमिक लाभ टी कोशिकाओं और इंटेग्रिन के बीच बातचीत मॉडलिंग में अपनी सादगी है। इस परख काफी अनोखे समारोह और यंत्रवत को जोड़ती हैएक इंटीग्रिन आसंजन अणु जोड़ी के अध्ययन के लिए एक वातावरण मॉडलिंग से अध्ययन करता है। इस पद्धति का एक और ताकत उसकी अनुकूलनशीलता है; इस विधि के किसी भी आसंजन अणु के लिए किसी भी ल्युकोसैट के आसंजन यों इस्तेमाल किया जा सकता है। इस विधि के कई दवाओं या आनुवंशिक जोड़तोड़ बदल इंटीग्रिन सक्रियण के माध्यम से टी सेल भर्ती और परिस्त्राव को बदलने के लिए उम्मीद का असर स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

किसी भी इन विट्रो विधि के साथ के रूप में, वहाँ इस परख की कुछ सीमाएं हैं। इस मॉडल को प्रेरित प्राथमिक endothelial कोशिकाओं चो कोशिकाओं के बजाय के रूप में अन्य मॉडलों का इस्तेमाल किया है इंजीनियर का उपयोग करता है। 16 जबकि यह हमें संकेत घटनाओं के लिए एक एकल इंटीग्रिन की सक्रियता के राज्य को प्रभावित करने को समझने की क्षमता देता है, यह भी मॉडल की एक कमजोरी माना जा सकता है। कोई selectins चो कोशिकाओं द्वारा व्यक्त कर रहे हैं के रूप में, परख दो चरणों में किया जाता है। पहला कदम (संचय चरण) के दौरान, टी कोशिकाओं इनपुट reserv में इंजेक्ट कर रहे हैंकम से कम दबाव और केशिका बलों द्वारा चैम्बर और दूसरे पक्ष के साथी के एक पक्ष में OIR। इन 5 मिनट भर में टी कोशिकाओं के व्यवहार चित्रा 3 ए में मनाया जा सकता है। 5 मिनट के बाद, और दूसरे चरण के लिए (प्रवाह चरण) के दौरान प्रवाह की दर में वृद्धि हुई है और कोशिकाओं रोल और पालन करने के लिए शुरू कर देंगे। यह ध्यान रखें कि नहीं सभी टी कोशिकाओं संचय चरण के दौरान चैम्बर भर इनपुट जलाशय चाल में इंजेक्शन, और इन कोशिकाओं monolayer के साथ रोल से कर के रूप में प्रवाह बढ़ जाता है (चित्रा 3 बी) महत्वपूर्ण है। इस तरह, परिस्त्राव के रोलिंग चरण कृत्रिम रूप से बढ़ाया है, लेकिन इस मॉडल में समाप्त नहीं किया।

चूंकि पक्षपाती कोशिकाओं की अधिकतम संख्या इनपुट कोशिकाओं की संख्या कि कक्ष में प्रवेश की अभिव्यक्ति है वहाँ प्रयोगों के बीच कच्चे नंबर परिवर्तनशीलता के लिए संभावित है। preflow छवियों को पूरी तरह से 100% अधिकतम टी सेल की आबादी का प्रतिनिधित्व नहीं करते क्योंकि वे लेखा और लेखा में नहीं लेते हैंइनपुट जलाशय टी, यह एक महत्वपूर्ण नियंत्रण गणना में शामिल करने के लिए विशेष रूप से जब दो अलग अलग प्रकार की कोशिकाओं को व्यक्तिगत रूप से गिना तुलना में किया जा करने के लिए कर रहे हैं। इसके अतिरिक्त, यह अनुशंसित नहीं है कि प्राथमिक विस्फोट लिम्फोसाइट एक एकल चर आसंजन विश्लेषण में इस्तेमाल किया जाएगा। यह कहना है टी सेल रिसेप्टर्स (TCR) और / या सह-रिसेप्टर्स के माध्यम से टी कोशिकाओं की, पूर्व उत्तेजना आसंजन पर ब्याज की उपचार के प्रभाव उलझाना सकता है। इन चर प्रयोगात्मक डिजाइन के दौरान विचार किया जाना चाहिए। इसी तरह, पहले से जमे हुए PBMCs के साथ कार्यात्मक अध्ययन अक्सर confounding परिणाम निकलेगा, और इस कारण सेल लाइनों या हौसले से पृथक प्राथमिक PBMCs के लिए इस परख के साथ सबसे अच्छा काम करते हैं। unstimulated आसंजन के सामान्य आधार स्तर को समझने के लिए PBMC अध्ययन में शामिल एक सेल की आबादी है कि nonspecifically पूर्व सक्रिय कर दिया गया है confounding परिणामों के लिए अग्रणी पहचान करने में महत्वपूर्ण है।

सटीकता के साथ इस परख को दोहराने के लिए, यह जरूरी है कि कुछ कदमबसने और प्रवाह ऊष्मायन बार सहित प्रोटोकॉल में, सटीक और सभी परिस्थितियों के बीच एक समान होना। इस एक ही प्रकाश में, चो ICAM कोशिकाओं समान रूप से सभी प्रवाह कक्षों (चित्रा 4) और टी कोशिकाओं की गिनती के दौरान मिला हुआ होना चाहिए भी सटीक होना चाहिए। 17 इन कारकों में भी छोटे मतभेदों अंत में कोशिकाओं की गिनती की सटीकता को प्रभावित कर सकता है। इस परख की एक भविष्य के आवेदन सेल लाइनों को व्यक्तिगत रूप से selectins और आसंजन अणुओं व्यक्त अन्य cascades संकेत करने के लिए इस विधि का प्रभाव का विस्तार करने की एक श्रृंखला का विकास है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
T cell samples (cell line or primary) ATCC TIB-152 Peripheral human T cells
CHO-ICAM-1 cells ATCC CRL-2093
µ-Slide VI 0.4 ibiTreat ibidi 80606
500 ml glass bottle Fisher FB800500
250 ml glass bottle Fisher FB800250
Silicone tubing 0.8 mm ibidi 10841
Confocal microscope with incubator chamber Ziess 700 Any wide field fluorescent microscope
Syringe pump New Era Pump Systems NE-300
60 ml syringe BD 309653
CFSE eBioscience 65-0850
SDF-1α R&D 350-NS-010/CF
RPMI Lonza 12-702F/12
PBS  Lonza 17-516F
Microcentrifuge Eppendorf  5424
D-Glucose Sigma Aldrich G8270 
PMA Sigma Aldrich 16561-29-8
Volocity software Perkin Elmer Version 6.2.1
ImageJ software NIH Version 1.48V
Tissue-culture treated culture dishes Falcon 353003
Trypsin-EDTA (0.25%) Phenol Red Gibco 25200114
Heat Inactivated FBS Denville FB5001-H
Penicillin/Streptomycin Fisher BP295950

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References

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टी लिम्फोसाइट-आसंजन अणु बातचीत का अध्ययन के लिए आसंजन के तहत कतरनी तनाव की परख
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Strazza, M., Azoulay-Alfaguter, I., Peled, M., Mor, A. Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions. J. Vis. Exp. (112), e54203, doi:10.3791/54203 (2016).More

Strazza, M., Azoulay-Alfaguter, I., Peled, M., Mor, A. Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions. J. Vis. Exp. (112), e54203, doi:10.3791/54203 (2016).

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