Denne strømnings adhesjonsassayet tilveiebringer en enkel, høy slag modell av T-celle-epitelial-celle-interaksjoner. En sprøytepumpe blir brukt til å generere skjærspenninger, og konfokal mikroskopi tar bilder for kvantifisering. Målet med disse studiene er å effektivt kvantifisere T-celle adhesjon ved hjelp av strømningsforhold.
Totalt sett er T-celle adhesjon en kritisk komponent i funksjon, bidrar til de ulike prosessene i mobilnettet rekrutteringen til områder av betennelser og samhandling med antigenpresenterende celler (APC) i dannelsen av immunologiske synapser. Disse to sammenhenger av T-celle-adhesjon varierer i at T-celle-APC-interaksjoner kan betraktes som statiske, mens T-celle-interaksjoner blodkar blir utfordret av skjærspenningen generert av sirkulasjon i seg selv. T-celle-APC-interaksjoner er klassifisert som statisk ved at de to cellulære partnere er statisk i forhold til hverandre. Vanligvis skjer dette samspillet i lymfeknutene. Som en T-celle samhandler med blodet åreveggen, cellene arrestere og må motstå generert skjærspenning. 1,2 Disse forskjellene markere behovet for å bedre forstå statisk feste og heft i henhold strømningsforhold som to forskjellige reguleringsprosesser. Reguleringen av T-celle adhesjon kan mest konsist beskrevet som controlling affiniteten tilstand av integrin-molekyler som uttrykkes på celleoverflaten, og derved regulere interaksjonen mellom integriner med adhesjonsmolekylet ligander som uttrykkes på overflaten av cellen i samspill. Vår nåværende forståelse av reguleringen av integrin affinitetstilstander kommer fra ofte forenklede in vitro modellsystemer. Analysen av adhesjon ved hjelp av strømnings-betingelser som er beskrevet her gjør det mulig for visualisering og nøyaktig kvantifisering av T-celle-epitelial-celle-interaksjoner i sann tid etter et stimulus. En adhesjon i henhold til strømnings analysen kan brukes til studier av adhesjon signalisering i løpet av T-celler etter behandling med hemmende eller stimulerende substanser. I tillegg kan denne analysen utvides utover T-celle-signalisering til en hvilken som helst klebemiddel leukocytt-populasjonen og eventuelle integrin-adhesjonsmolekyl par.
T-lymfocytt adhesjon medierer en rekke forskjellige prosesser i et sunt immunsystem, 3 spiller viktige roller i T-celletrafikken og antigen presentasjon. Både ved immunovervåkning eller en aktiv immunrespons i disse to hovedroller for adhesjon er kritiske. 4 Den fysiologiske signaleringshendelser av T-celle-endotel-celle-interaksjoner er forskjellig fra T-celle-antigen-presenterende celle (APC) interaksjoner, og derfor krever forskjellige metoder for studie for å best forstå de signal kaskader involvert. Den faste adhesjon av en T-celle til en blodkarveggen under lymfocytt ekstravasasjon krever rask og dynamisk integrin-aktivering. Den stramme interaksjonen mellom en aktiv tilstand integrin og adhesjonsmolekyler langs endotelet fører til adhesjon motstandsdyktig mot strømmen av blod, slik at T-cellene til å krype langs overflaten på jakt etter et område som ettergivende til celle passasje. 5 den gjennomsøking av en T-celle-bi -directionally Alonga karveggen er avhengige på polarisert adhesjon, med en distinkt klebemiddel fremre ende av T-celle. 6 Viktigst, fast adhesjon og transmigrasjon krever motstand mot skjærkraften generert av sirkulerende blodstrøm.
Ved utforming eksperimenter for å studere lymfocytt heft, bør det tas hensyn til den spesifikke stimulans av interesse. Mens inte aktivering er en vanlig og viktig del av alle former for T-celle adhesjon, kaskader av aktivering er sannsynlig å være unik nedstrøms av individuelle reseptorer og co-reseptorer. Likeledes inte og adhesjonsmolekyl parene fungere i spesialiserte microenvironments og på bestemte subpopulasjoner. På denne måte kan disse parene reguleres ganske annerledes. Modellen som presenteres her er ideell for studiet av signaleringskaskader som fører til integrin-aktivering fant sted under skjærspenningsbetingelser. 7. Disse interaksjonene ikke kan være tilstrekkelig forstås i en statisk lim;på systemet på grunn av virkningen disse styrkene har vist seg å ha rett på T-celle atferd. 8 Selv presenteres her med T-celler og CHO (kinesisk hamster) celler konstruert for å uttrykke menneskelige ICAM-1 (CHO-ICAM celler) den kan systemet enkelt modifiseres til å studere forskjellige leukocyttpopulasjonene eller adhesjonsmolekyler.
Denne analysen tilveiebringer en fremgangsmåte for å kvantifisere T-celle-klebrighet og integrin-aktivering ved hjelp av skjærspenning, som gir en modell for den faste adhesjon fasen av leukocytt-ekstravasasjon. Gjennom bruk av CHO-ICAM-celler affiniteten av LFA-1 til dets ligand i levende celler kan undersøkes i sanntid som respons på forskjellige stimuli av interesse. Denne teknikken krever lett oppnås, kommersielt tilgjengelige mikro-ningskammere i kombinasjon med en sprøytepumpe, mye enklere utstyr som er nødvendig for å modellere blodstrøm og skjærspenning i forhold til andre modeller. 9 En annen stor fordel med denne analysen er den bestemte signalkaskader og den resulterende aktiveringstilstanden av de enkelte integriner kan være rent studeres ved anvendelse av modifiserte CHO-celler som uttrykker humane adhesjonsmolekyler av interesse. Dessuten er kombinasjonen av kvantitative data med levende celle avbildning er en betydelig fordel ved denne metoden. Alt i alt, mens en rekke analyser av statisk T-celle-adhesjon, er blitt beskrevet som pent modell T-celle-APC-interaksjoner, disse modellene er utilstrekkelige for å fange den dynamiske prosessen med T-celle-epitelial adhesjon. Av denne grunn ved valg av adhesjonsanalysen stimulus aktuelle må vurderes.
For å kunne analysere T-celle-adhesjon, sentralstimulerende å bli inkludert i studien må tas i betraktning ved valg av en in vitro-metode. Mens det er flere analyser for å studere signaler som fører til LFA-1-aktivering og ICAM-1-bindende alle metoder er ikke utskiftbare. En statisk vedheft analysen 10 er best egnet til å studere T-celle-APC interaksjoner; alternativt skjærspenningen metoden beskrevet her gjør det enkelt å modellere T-celle-epitelial celle-interaksjoner. In vivo, so…
The authors have nothing to disclose.
The Rheumatology Research Foundation and the Hirschil Trust supported this work.
T cell samples (cell line or primary) | ATCC | TIB-152 | Peripheral human T cells |
CHO-ICAM-1 cells | ATCC | CRL-2093 | |
µ-Slide VI 0.4 ibiTreat | ibidi | 80606 | |
500 ml glass bottle | Fisher | FB800500 | |
250 ml glass bottle | Fisher | FB800250 | |
Silicone tubing 0.8 mm | ibidi | 10841 | |
Confocal microscope with incubator chamber | Ziess | 700 | Any wide field fluorescent microscope |
Syringe pump | New Era Pump Systems | NE-300 | |
60 ml syringe | BD | 309653 | |
CFSE | eBioscience | 65-0850 | |
SDF-1α | R&D | 350-NS-010/CF | |
RPMI | Lonza | 12-702F/12 | |
PBS | Lonza | 17-516F | |
Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 | |
D-Glucose | Sigma Aldrich | G8270 | |
PMA | Sigma Aldrich | 16561-29-8 | |
Volocity software | Perkin Elmer | Version 6.2.1 | |
ImageJ software | NIH | Version 1.48V | |
Tissue-culture treated culture dishes | Falcon | 353003 | |
Trypsin-EDTA (0.25%) Phenol Red | Gibco | 25200114 | |
Heat Inactivated FBS | Denville | FB5001-H | |
Penicillin/Streptomycin | Fisher | BP295950 |