We introduce the VacuSIP, a simple, non-intrusive, and reliable method for clean and accurate point sampling of water. The system was developed and evaluated for the simultaneous collection of the water inhaled and exhaled by benthic suspension feeders in situ, to cleanly measure removal and excretion of particulate and dissolved compounds.
Benthic suspension feeders play essential roles in the functioning of marine ecosystems. By filtering large volumes of water, removing plankton and detritus, and excreting particulate and dissolved compounds, they serve as important agents for benthic-pelagic coupling. Accurately measuring the compounds removed and excreted by suspension feeders (such as sponges, ascidians, polychaetes, bivalves) is crucial for the study of their physiology, metabolism, and feeding ecology, and is fundamental to determine the ecological relevance of the nutrient fluxes mediated by these organisms. However, the assessment of the rate by which suspension feeders process particulate and dissolved compounds in nature is restricted by the limitations of the currently available methodologies. Our goal was to develop a simple, reliable, and non-intrusive method that would allow clean and controlled water sampling from a specific point, such as the excurrent aperture of benthic suspension feeders, in situ. Our method allows simultaneous sampling of inhaled and exhaled water of the studied organism by using minute tubes installed on a custom-built manipulator device and carefully positioned inside the exhalant orifice of the sampled organism. Piercing a septum on the collecting vessel with a syringe needle attached to the distal end of each tube allows the external pressure to slowly force the sampled water into the vessel through the sampling tube. The slow and controlled sampling rate allows integrating the inherent patchiness in the water while ensuring contamination free sampling. We provide recommendations for the most suitable filtering devices, collection vessel, and storing procedures for the analyses of different particulate and dissolved compounds. The VacuSIP system offers a reliable method for the quantification of undisturbed suspension feeder metabolism in natural conditions that is cheap and easy to learn and apply to assess the physiology and functional role of filter feeders in different ecosystems.
Benthische schorsing feeders spelen een essentiële rol in het functioneren van mariene ecosystemen 1. Door het filteren van grote hoeveelheden water 2,3, ze te verwijderen en scheiden deeltjes (plankton en detritus) en opgeloste verbindingen 1 (en referenties daarin) en zijn een belangrijk middel van benthische-pelagische koppeling 4,5 en voedselkringloop 6,7. Nauwkeurig meten van de deeltjes en opgeloste stoffen verwijderd en uitgescheiden door benthische schorsing feeders (zoals sponzen, ascidians, borstelwormen en tweekleppigen) is fundamenteel voor hun fysiologie, metabolisme en het voeden van de ecologie te begrijpen. Samen met pompsnelheid metingen, maar maakt het ook mogelijk een kwantificering van de nutriënten gemedieerd door deze organismen en de ecologische invloed op de kwaliteit van het water als op het ecosysteem grootschalige processen.
Het kiezen van de juiste methode voor het meten van verwijdering en productiesnelheden van deeltjes en opgeloste compond door ophanging filter feeders is van cruciaal belang voor het verkrijgen van betrouwbare gegevens over hun voedselopname 8. Zoals opgemerkt door Riisgård en anderen, ongepast methodieken vooroordelen resultaten, vervormen experimentele omstandigheden, produceren onjuiste schattingen van de inname en uitscheiding van bepaalde stoffen, en kan leiden tot foutieve kwantificering van de nutriënten verwerkt door deze organismen.
De twee meest gebruikte methoden om deeltjes en opgeloste nutriëntfluxen in filter feeders meten betrekken ofwel incubatie (indirecte technieken) of gelijktijdig verzamelen van omgevings- en uitgeademde water (directe technieken). Incubatie technieken zijn gebaseerd op het meten van de verandering in de concentratie van deeltjes en opgeloste voedingsstoffen in het water geïncubeerd, en het schatten productiesnelheden of verwijdering vergelijking aan afdoende 8. Echter, het omsluiten van een organisme in een incubatie kamer kan zijn feedin verandereng en pompen gedrag als gevolg van veranderingen in de natuurlijke stroming regime door een daling in zuurstof en / of voedselconcentratie of door accumulatie van verbindingen uitscheiding in de incubatie 7,9 water (en referenties daarin). Naast de effecten van de begrenzing en gewijzigd water, een grote voorspanning van incubatie technieken voort uit re-filtratie effecten (zie bijvoorbeeld 10). Hoewel sommige van deze methodologische problemen zijn overwonnen door de juiste omvang en vorm van het incubatievat 11 of de introductie van een recirculerend stolp systeem in situ 12, deze techniek vaak onderschat verwijdering en productiesnelheden. Kwantificeren van de stofwisseling van opgeloste stoffen zoals opgeloste organische stikstof (DON) en koolstof (DOC) of anorganische nutriënten, heeft bewezen bijzonder gevoelig voor vertekeningen veroorzaakt door incubatie technieken 13 worden.
In de late jaren '60 en vroege jaren '70, Henry Reiswig9,14,15 een pionier in de toepassing van de rechtstreekse technieken om de verwijdering deeltjes te kwantificeren door reusachtige Caribbean sponzen, door afzonderlijk bemonstering van de water ingeademd en uitgeademd door de organismen in situ. Vanwege de moeilijkheid om Reiswig techniek toegepast bij kleinere suspensie feeders en meer uitdagende onderwater omstandigheden het grootste deel van het onderzoek op dit gebied was beperkt tot het laboratorium (in vitro) waarin de meeste indirecte technieken 16 incubatie. Yahel en collega's omgebouwd Reiswig directe in situ techniek om te werken in kleinere schaal omstandigheden. Hun methode, genaamd INEX 16, is gebaseerd op de gelijktijdige onderwater bemonstering van het water ingeademd (In) en uitgeademd (Ex) van ongestoorde organismen. De verschillende concentratie van een middel (bijvoorbeeld bacteriën) tussen twee monsters (INEX) een maat voor de retentie (of productie) van die stof door het dier. De Inex techniek maakt gebruik van een open einde buizen enafhankelijk van de excurrent straal door de pompende werking van het onderzochte organisme passief vervangen vaarwater in de verzamelbuis. Terwijl Yahel en collega succesvol deze techniek toegepast bij het onderzoek van meer dan 15 verschillende suspensie feeders taxa (bijvoorbeeld 17), wordt de werkwijze beperkt door de hoge mate van oefening en ervaring nodig door de minuscule omvang van sommige excurrent openingen, en omstandigheden op zee.
Om deze obstakels te overwinnen, ontwikkelden we een alternatieve techniek gebaseerd op gecontroleerde zuiging van de bemonsterde water door minuut buizen (uitwendige diameter van <1,6 mm). Ons doel was om een eenvoudige, betrouwbare en goedkope apparaat dat schoon en gecontroleerd in situ water sampling uit een zeer specifiek punt, zou toelaten zoals de excurrent opening van bodemdieren schorsing feeders te creëren. Om effectief te zijn, heeft de werkwijze niet opdringerig zijn om te voorkomen dat de omgevingstemperatuur stromingsregiem beïnvloeden of wijzigen behavior van de bestudeerde organismen. Het apparaat hier gepresenteerd wordt genoemd VacuSIP. Het is een vereenvoudiging van het SIP is ontwikkeld door Yahel et al. (2007) 18 voor ROV-gebaseerde point sampling in de diepzee. De VacuSIP is aanzienlijk goedkoper dan de originele SIP en het is aangepast voor SCUBA-based werken. Het systeem is ontworpen volgens de principes gepresenteerd en getest door Wright en Stephens (1978) 19 en Møhlenberg en Riisgård (1978) 20 voor het laboratorium instellingen.
Hoewel het VacuSIP systeem is ontworpen voor in situ studies van het metabolisme van benthische feeders suspensie kan ook worden gebruikt voor laboratoriumonderzoek en waar een gecontroleerde en schoon puntbronnen watermonster vereist. Het systeem is vooral handig wanneer de integratie gedurende langere perioden (min-uur) of in situ filtraties vereist. De VacuSIP is met succes gebruikt bij de Yahel lab sinds 2011, en ooktewerkgesteld in twee recente studies van nutriënten gemedieerd door het Caribisch gebied en de Middellandse Zee sponssoorten 21 (Morganti et al., ingediend).
Het gebruik van specifieke samplers, de verlengde bemonstering, en het veld omstandigheden, waarin VacuSIP wordt toegepast, leiden tot een aantal afwijkingen van de standaard oceanografische protocollen voor het verzamelen, filteren, en het opslaan van monsters voor gevoelige analyten. Om het risico van besmetting te verminderen door het VacuSIP systeem of het risico van wijziging van de bemonsterde water door bacteriële activiteit na inzameling, testten we diverse in situ procedures filtratie en opslag. Verschillende filterinrichtingen, opvangbakken en opslaan procedures om de meest geschikte techniek voor het analyseren van opgeloste anorganische (PO 4 3- NO x -, NH4 +, SiO 4) bereiken onderzocht en organische (DOC + DON) verbindingen, en ultra-plankton (<1081; m) en deeltjes organische (POC + PON) sampling. Om het risico van verontreiniging verder te verminderen, vooral onder veldomstandigheden, het aantal behandelingsstappen werd teruggebracht tot een minimum. De visueel formaat waarin de werkwijze wordt aangeboden is gericht op reproduceerbaarheid vergemakkelijken en de tijd die nodig is om de techniek efficiënt gehandeld.
Systeem overzicht
Monsters in situ gepompte water suspensie voeders met exhalant openingen van slechts 2 mm, wordt de pompactiviteit van elk monster eerst gevisualiseerd door het vrijgeven gefiltreerd fluoresceïne gekleurd zeewater naast de inhalatie-opening (en) en het observeren van de stroom vanaf de excurrent opening 16 (zie ook figuur 2B 18). Het water in- en uitgeademde door de studie monster (incurrent en excurrent) worden dan gelijktijdig bemonsterd met behulp van een paar minuten buizen op maat gemaakte manipulator geïnstalleerd of twee van de "arms "van een omgekeerde flexibele draagbare driepoot (figuur 1 en aanvullende Video 1). Het water ingeademd door de studie organisme wordt verzameld door nauwkeurig positioneren van het proximale uiteinde van een buis in of nabij de inhalatie opening van het onderzoek organisme. Een identiek buis wordt dan gepositioneerd binnen het excurrent opening. voor deze functie moet goede zorg contact of verstoring van het dier, bijvoorbeeld door sediment resuspensie voorkomen. de bemonstering beginnen een duiker doorboort een septum in het verzamelvat met een injectienaald aan de distale uiteinde van elke buis, zodat de uitwendige waterdruk in de steekproef er water in het vat door de monsterbuis. de zuiging wordt geïnitieerd door het vacuüm reeds gemaakt in de flacons en het drukverschil tussen de uitwendige water en afgevoerd monsterhouder .
Om te zorgen voor een schone collectie van uitgeademde water en per ongeluk opzuigen van ambi voorkomenent water 16, het water sampling rate heeft op een aanzienlijk lager tarief (<10%) dan de excurrent debiet te worden gehouden. De afzuiging wordt geregeld door de lengte van de buis en de inwendige diameter (ID). De kleine inwendige diameter zorgt ook voor een verwaarloosbaar dood volume (<200 pi per meter buis). Bemonstering gedurende langere tijd (minuten tot uren) kan de inherente patchiness van de meeste stoffen plaats integreren. Opdat voldoende monsters worden bewaard in langdurige onderwater bemonsteringen en voor vervoer naar het laboratorium, een in situ filtratie wordt aanbevolen voor gevoelige analyten. De selectie van de bemonstering schepen, filtratie assemblage, en slangen worden gedicteerd door de studie organismen en de specifieke onderzoeksvraag. De hieronder beschreven protocol veronderstelt dat een volledige metabolisch profiel van belang (voor een overzicht zie figuur 2). Echter, het modulaire karakter van het protocol maakt fof eenvoudige modificatie eenvoudiger of zelfs heel andere bemonsteringsschema's tegemoet te komen. Voor een volledige metabole profiel, moet de sampling protocol omvatten de volgende stappen: (1) Flow visualisatie; (2) Sampling ultra-plankton voeding (plankton <10 pm); (3) Steekproef anorganische voedingsstoffen opname en excretie (met behulp van in-line filters); (4) Sampling opgeloste organische opname en excretie (met behulp van in-line filters); (5) Particulate voeden en excretie (met behulp van in-line filters); (6) Herhaal stap 2 (ultra-plankton voeden als kwaliteitscontrole); (7) Flow visualisatie.
Wanneer het logistiek mogelijk is, verdient het aanbeveling het metabolische metingen worden gecombineerd met pompsnelheid (bijvoorbeeld de kleurstof voorkant snelheid werkwijze, 16) en de ademhaling metingen. Deze metingen worden het best genomen bij het begin en einde van de sessiesteekproeven. Voor de ademhaling meten, onderwater optoden of micro-elektroden de voorkeur.
voorbereidende stappen
Collector flesjes voor DOM en nutriëntenanalyses
Sinds collector schepen kunnen interageren met opgeloste micro-bestanddelen en de sampler muren kan een substraat voor de groei van bacteriën 30-34, verschillende flesjes voor DOM en voedingsstoffen collectie werden getest zijn. Borosilicate wordt niet aanbevolen voor silica kwantificering 33,35, omdat glazen flessen de aanvan…
The authors have nothing to disclose.
Wij danken Manel Bolivar voor zijn hulp bij het veldwerk. We zijn dankbaar voor de "Parc Natural del Montgrí, les Illes Medes i el Baix Ter" voor hun steun aan ons onderzoek en bemonstering permissies. De onderwaterwereld manipulator is ontworpen door Ayelet Dadon-Pilosof en gefabriceerd door Mr. Pilosof. Dit werk werd ondersteund door de Spaanse regering project CSI-Coral [subsidie aantal CGL2013-43106-R RC en MR] en door een FPU beurs van "Ministerio de Educación, Cultura y Deporte (MECD)" naar TM. Dit is een bijdrage van de Marine biogeochemie en Global Change onderzoeksgroep gefinancierd door de Catalaanse regering [subsidie nummer 2014SGR1029] en ISF subsidie 1280-1213 en BSF subsidie 2.012.089 G. Yahel.
GorillaPod, Original | Joby | GP000001 | flexible portable tripod |
Flangeless Ferrule | IDEX Health & Science | P-200X | 1/16" in Blue/pk |
Male Nut | IDEX Health & Science | P-205X | 1/16" in Green/10pk |
Female to Female Luer | IDEX Health & Science | P-658 | |
Female-Male Luer | IDEX Health & Science | P-655 | |
Peek Tubing (250µm ID) | IDEX Health & Science | 1531 | 1/16" OD x 0.01in ID x 5ft lenght. Alternative ID can be used |
Two component resin epoxy | IVEGOR | 9257 | Mix well the two component resin before use |
(TOC) EPA VIALS | Cole -Parmer | 03756-20 | 40 ml glass vials. Manifactured also by Thomas Scientific (ref. number 9711F09) |
HDPE VIALS | Wheaton | 986701 (E78620) | 20 ml high-density polyethylene vials |
Vacuette Z no additive | Greiner bio-one | 455001 | pre-vacuum by the manufacturer |
Septum Sample Bottles | Thomas Scientific | 1755C01 | 250 ml glass bottles |
Septum Cap 1 | Wheaton | W240844SP (E7865R) | 22-400 for HDPE vials |
Septum Cap 2 | Wheaton | W240846 (1078-5553) | 24-400 for glass vials and bottles. Also manufactured by Thermo Scientific National (ref. 03-377-42) |
In-line stainless steel Swinney Filter holders | Pall | 516-9067 | 13mm of diameter |
PTFE Seal Washer | Pall | 516-8064 | ring for stainless steel filter holders |
TCLP Glass Filters | Pall | 516-9126 | binder-free glass fiber filters, 13mm of diameter, pore size 0.7µm |
Polycarbonate Filter Holders | Cole -Parmer | 17295 | 13mm of diameter |
Isopore Membrane Filters | Millipore | GTTP01300 | 13mm of diameter, pore size 0.2 µm |
Contrad 2000 Solution | Decon Labs | E123FH | highly soluble basic mix of anionic and non-ionic surfactant solution |
Sterile Syringe Filters | VWR International Eurolab S.L. | 514-0061P | 25mm of diameter , pore size 0.2 µm |
Fluorescein | Sigma-Aldrich | (old ref.28802) 46955-100G | 100g |
Holdex, disposable,sterile | Greiner bio-one | 450263 | sterile, single-use tube holder with off-center luer for Vacuette |
Sterile Needles | IcoGammaPlus | 5160 | 0.7mm x 30mm |
Cryovials Nalgene | Nalgene | V5007(Cat. No.5000-0020) | 2ml |
Cryobox carton | Rubilabor | M-600 | 145x145x55mm p/microtube 1.5 ml |
Orthophosphoric Acid | Sigma | 79617 | |
Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | 500g |
Glutaraldehyde | Merck | 8,206,031,000 | 25%, 1 L |
Hand Vacuum Pump | Bürkle | 5620-2181 |