Erstellung von Einzel-Kohorte Kolonien und Hormonbehandlung von Arbeitshonigbienen Physiologie Assoziierte Analysieren mit Rolle und / oder endokrine System
Summary
Hier beschreiben wir unser ausführliches Protokoll zur Herstellung von Single-Kohorte Bienenvölker – ein nützliches Werkzeug für die Analyse der Rolle-assoziierten Arbeiter Physiologie. Wir beschreiben auch detaillierte Protokolle für Arbeitnehmer mit Juvenilhormons und Ecdyson Behandlung der Beteiligung dieser Hormone an der Regulation der Arbeiter Verhalten und / oder Physiologie zu bewerten.
Abstract
Honeybee workers are engaged in various tasks related to maintaining colony activity. The tasks of the workers change according to their age (age-related division of labor). Young workers are engaged in nursing the brood (nurse bees), while older workers are engaged in foraging for nectar and pollen (foragers). The physiology of the workers changes in association with this role shift. For example, the main function of the hypopharyngeal glands (HPGs) changes from the secretion of major royal jelly proteins (MRJPs) to the secretion of carbohydrate-metabolizing enzymes. Because worker tasks change as the workers age in typical colonies, it is difficult to discriminate the physiological changes that occur with aging from those that occur with the role shift. To study the physiological changes in worker tissues, including the HPGs, in association with the role shift, it would be useful to manipulate the honeybee colony population by preparing single-cohort colonies in which workers of almost the same age perform different tasks. Here we describe a detailed protocol for preparing single-cohort colonies for this analysis. Six to eight days after single-cohort colony preparation, precocious foragers that perform foraging tasks earlier than usual appear in the colony. Representative results indicated role-associated changes in HPG gene expression, suggesting role-associated HPG function. In addition to manipulating the colony population, analysis of the endocrine system is important for investigating role-associated physiology. Here, we also describe a detailed protocol for treating workers with 20-hydroxyecdysone (20E), an active form of ecdysone, and methoprene, a juvenile hormone analogue. The survival rate of treated bees was sufficient to examine gene expression in the HPGs. Gene expression changes were observed in response to 20E- and/or methoprene-treatment, suggesting that hormone treatments induce physiological changes of the HPGs. The protocol for hormone treatment described here is appropriate for examining hormonal effects on worker physiology.
Introduction
Die Europäische Honigbiene, Apis mellifera, ist ein eusocial Insekt mit einer hoch organisierten Gesellschaft 1. Arbeiter Honigbienen (Arbeits Kaste) sind in verschiedener Aufgaben Kolonie Aktivität zu erhalten, und diese Aufgaben ändern sich je nach dem Alter des Arbeitnehmers Honigbiene nach dem Schlüpfen, die als altersbedingte Arbeitsteilung bezeichnet wird 2-4. Junge Arbeitnehmer (<13 Tage alt) kümmern sich um die Brut in den Bienenstock von Gelée Royale sezer (Ammen), während ältere Arbeitnehmer (> 15 Tage alt) sammeln Nektar und Pollen außerhalb des Bienenstocks (foragers) 2-4. Die Physiologie der Arbeiter ändert sich in Verbindung mit dieser Rolle Verschiebung. Zum Beispiel kann die Funktion der Hypopharynxdrüsen (HPGs), gepaart im Kopf befindet exokrinen Drüsen, Änderungen im Zusammenhang mit der Rolle Verschiebung von Pflege bis 2,5 Nahrungssuche. Krankenschwester Biene HPGs synthetisieren hauptsächlich großen Gelee royale Proteine, die wichtigsten Komponenten der Bienenmilch sind. Auf der anderen Seite, forager HPGs hauptsächlichKohlenhydrat-metabolisierende Enzyme wie α-Glucosidase III synthetisieren Nektar in Honig zu verarbeiten, indem Saccharose in Glucose und Fructose umwandelt. Unseren früheren Studien zeigten , dass die Expression von mrjp2, die einen Haupt Gelée royale – Protein kodiert, und Hbg3, die während der Rolle Verschiebung 6-9 α-Glucosidase III, Änderungen kodiert.
Um zu bestimmen, ob die physiologischen Veränderungen in den Arbeiter Geweben, einschließlich der HPGs, mit der Rolle Verschiebung oder mit dem Alter der Arbeiter verbunden ist, wäre es nützlich, die Population Zusammensetzung eines Bienenvolk zu manipulieren, beispielsweise single-Kohorte vorzubereiten Kolonien , in denen Arbeiter fast im gleichen Alter führen verschiedene Aufgaben 10,11. Robinson et al. (1989) beschrieben , ein Verfahren zur Herstellung einer Einzelkolonie Kohorten 10 herzustellen. Einzel-Kohorte Kolonien umfassen zunächst eine Königin und 0-2 Tage alten Arbeiter. Einige Tage nach der Kolonien Gründung, Arbeiter von almost im gleichen Alter übernehmen verschiedene Aufgaben. Einige Arbeiter verrichten Pflegeaufgaben wie in typischen Kolonien, während andere Arbeiter Nahrungssuche Aufgaben früher als üblich und werden so altklug foragers genannt. Die Genexpression Vergleiche zwischen Ammen und altklug foragers würde nützliche Informationen über die Rolle assoziierte Physiologie der Arbeiter Gewebe 16.12. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für 16 Single-Kohorte Kolonien für die Analyse der rollen- und / oder altersassoziierte Physiologie der HPGs vorbereitet. Wir beschreiben auch kurz , wie die Genexpression von mrjp2 und Hbg3 durch quantitative reverse Transkription-Polymerase – Kettenreaktion (RT-PCR) zu untersuchen HPG Physiologie zu untersuchen.
Neben der Analyse der Arbeiter Physiologie im Einzel Kohorte Kolonien, Prüfung des endokrinen Systems ist wichtig für die Regulationsmechanismen der Rolle assoziierten Arbeiter Physiologie zu analysieren. Juvenile Hormon (JH), die kno istwn als in Insektenlarven Hormon 'Status quo', beschleunigt den Wandel in der Rolle von Pflege in Arbeitshonigbienen 11 bis Nahrungssuche. Weiterhin Ecdyson, das als Häutungshormons während der Metamorphose bekannt ist, könnte in der Rolle Verschiebung als Gene , die für Ecdyson Signalmoleküle in den Pilzkörpern, ein höheres Zentrum des Arbeiters brain 17-19 exprimiert werden beteiligt sein. Deshalb beschreiben wir auch das detaillierte Protokoll in unserer früheren Studie 16 verwendet , um Arbeitnehmer mit 20E behandeln, die eine aktive Form von Ecdyson ist, und Methopren, ein JH analog zur Analyse der Wirkung des endokrinen Systems auf HPG Physiologie (Expression von mrjp2 und Hbg3).
Protocol
Representative Results
Discussion
Herstellung von Single-Kohorte Kolonien
Hier haben wir beschrieben , das Protokoll in unserer früheren Studie 16 verwendet , um Single-Kohorte Kolonien für die Analyse von HPG Physiologie vorzubereiten im Zusammenhang mit der Verschiebung der Rolle der Arbeiterbienen. Krankenschwester Bienen und altklug foragers, die die Kriterien in den Verfahren beschrieben erfüllt 1,6-1,7 und 2 wurden in den Single-Kohorte Kolonien (Tabelle 1) beobachtet. Di…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a Grant-in-Aid for Scientific Research (B) and a Grant-in Aid for Scientific Research on Innovative Areas ‘Systems Molecular Ethology’ from the Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology (MEXT) of Japan. T.U. was the recipient of a Grant-Aid from the Japan Society for the Promotion of Science for Young Scientists.
Materials
| UNIPOSCA | Mitsubishi pencil | PC-5M | Marker pen for the application of marks to bees |
| 20-hydroxyecdysone | Sigma Aldrich | H5142 | |
| Methoprene | Sigma Aldrich | 33375 | |
| Breeding case insect | IRIS OHYAMA | CP-SS | |
| Electromotion mixier | ISO | 23M-R25 | homogenization of tissue |
| TRIZol Reagent | Invitrogen | 15596-026 | the reagent for total RNA extraction |
| DNase I | Takara | 2270A | |
| PrimeScript RT reagent kit | Takara | RR037A | the reagent for reverse transcription |
| SYBR Premix ExTaq II | Takara | RR820A | the reagent for real-time PCR |
| LightCycle 1.2 Instrument | Roche | 12011468001 | the instrument for real-time PCR |
| LightCycle Capillaries (20μl) | Roche | 4929292001 | the material for real-time PCR |
References
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