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Neuroscience

Préparation des colonies mono-cohorte et Traitement hormonal des travailleurs Honeybees à Analyser Physiologie Associé à Rôle et / ou le système endocrinien

doi: 10.3791/54240 Published: September 6, 2016

Summary

Nous décrivons ici notre protocole détaillé pour la préparation de colonies d'abeilles seule cohorte - un outil utile pour analyser le travailleur physiologie rôle associé. Nous décrivons également des protocoles détaillés pour traiter les travailleurs avec l'hormone juvénile et ecdysone pour évaluer l'implication de ces hormones dans la régulation du comportement et / ou de la physiologie des travailleurs.

Introduction

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L'abeille européenne, Apis mellifera, est un insecte eusocial avec une société hautement organisée 1. Abeilles travailleurs (caste de travail) sont engagés dans diverses tâches pour maintenir l' activité de la colonie, et ces tâches changent en fonction de l'âge de l'abeille des travailleurs après l' éclosion, qui est désigné comme division du travail 2-4 liée à l' âge. Les jeunes travailleurs (<13 jours old) prendre soin de la couvée dans la ruche en sécrétant la gelée royale (infirmières des abeilles), tandis que les travailleurs plus âgés (> 15 jours old) recueillent le nectar et le pollen à l' extérieur de la ruche (butineuses) 2-4. La physiologie des travailleurs change en association avec ce rôle changement. Par exemple, la fonction des glandes hypopharyngiennes (de HPG), jumelé glandes exocrines situées dans la tête, des changements en association avec le rôle passage de soins infirmiers à la recherche de nourriture 2,5. HPG infirmière d'abeilles synthétisent majoritairement des protéines majeures de la gelée royale, qui sont les principaux composants du lait d'abeille. D'autre part, HPG butineuses principalementla synthèse des hydrates de carbone, les enzymes du métabolisme tels que α-glucosidase III, pour traiter le nectar en miel en convertissant le saccharose en glucose et fructose. Nos études antérieures ont révélé que l'expression de mrjp2, qui code pour une protéine de gelée royale majeure, et Hbg3, qui code pour α-glucosidase III, les changements au cours du rôle déplacement 6-9.

Pour déterminer si les changements physiologiques dans les tissus des travailleurs, y compris les HPG, est associé au rôle décalage ou avec l'âge des travailleurs, il serait utile de manipuler la composition de la population d'une colonie d'abeilles, comme pour préparer une seule cohorte colonies dans lesquelles les travailleurs de presque le même âge effectuer différentes tâches 10,11. Robinson et al. (1989) ont décrit un procédé pour établir une colonie unique cohorte 10. colonies mono-cohorte comprennent d'abord une reine et 0-2 jour anciens travailleurs. Plusieurs jours après avoir établi les colonies, les travailleurs de almost le même âge assumer des tâches différentes. Certains travailleurs effectuent des tâches de soins infirmiers dans les colonies typiques, alors que d'autres travailleurs effectuent des tâches butinage plus tôt que d'habitude et sont donc appelés butineuses précoces. Comparaisons d'expression génique entre les infirmières et les abeilles butineuses précoces fournirait des informations utiles sur la physiologie de rôle associé à des tissus des travailleurs 12-16. Ici, nous décrivons un protocole détaillé pour la préparation de colonies seule cohorte pour l' analyse de la physiologie de rôles et / ou associée à l' âge de 16 HPG. Nous avons également décrit brièvement comment examiner l'expression du gène de mrjp2 et Hbg3 par inversion quantitative réaction en chaîne par polymérase-transcription (RT-PCR) pour évaluer HPG physiologie.

En plus de l'analyse des travailleurs de la physiologie dans les colonies seule cohorte, l'examen du système endocrinien est important d'analyser les mécanismes de régulation de rôle associé travailleur physiologie. hormone juvénile (JH), qui est known comme l'hormone «statu quo» dans les larves d' insectes, accélère le changement dans le rôle de soins infirmiers à la recherche de nourriture chez les abeilles ouvrières 11. En outre, ecdysone, qui est connu comme l'hormone de mue durant la métamorphose, pourrait être impliqué dans le rôle de changement des gènes codant pour des molécules de signalisation de l' ecdysone sont exprimées dans les corps pédonculés, un centre supérieur du cerveau des travailleurs 17-19. Par conséquent, nous décrivons également le protocole détaillé utilisé dans notre étude précédente 16 pour traiter les travailleurs avec 20E, qui est une forme active de ecdysone, et méthoprène, un analogue de JH, pour l' analyse de l'effet du système endocrinien sur HPG physiologie (expression de et mrjp2 Hbg3).

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Protocol

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1. Préparation des colonies mono-cohorte

  1. Préparer trois colonies d'abeille pour créer deux colonies une seule cohorte et pour obtenir un nombre suffisant de travailleurs nouvellement apparus.
    1. Vérifiez que certains pupes dans les cellules périphériques plafonnés dans les rayons ont des yeux bruns et une cuticule pigmentée en ouvrant les peignes coiffés à l'aide de pinces. Si ces pupes existent dans les cellules peigne périphériques, la plupart des pupes dans l'ensemble des peignes émergera dans environ 1-3 jours.
    2. Par la suite, de recueillir les rayons contenant ces pupes après toutes les abeilles adultes adhérentes ont été enlevées avec un pinceau, et mélanger des peignes des trois colonies pour réduire au minimum la variabilité entre les colonies.
  2. Placez les peignes collectés dans une boîte de ruche vide et incuber à 33 ° C dans des conditions humides (> 60% d'humidité relative). Collecter environ 6000 travailleurs nouvellement apparus sur 3 jours (3.000 travailleurs par colonie) des peignes collectés.
  3. Déterminer la quantité de workers sur la base du poids de cinq travailleurs nouvellement écloses recueillies au hasard à partir de colonies non manipulées.
    1. Peser cinq travailleurs nouvellement écloses recueillies au hasard à partir de colonies non manipulées à l'aide de machines de pesage.
      Note: Le poids de cinq travailleurs nouvellement émergé est généralement 500-600 mg.
    2. Estimer la quantité de travailleurs recueillies en divisant le poids des travailleurs recueillies par le poids moyen des cinq travailleurs nouvellement apparus.
  4. Appliquer des marques de peinture aux thoraces d'environ 1 800 travailleurs (900 travailleurs par colonie) en utilisant des marqueurs de peinture d'affiches à base d'eau.
    Note: marqueur Lavable qui est utilisé pour appliquer la peinture est listé dans la table des matières.
  5. Introduire une reine et environ 3.000 des travailleurs âgés 0-2 d'une journée à une nouvelle boîte de ruche qui contient deux peignes, un peigne contenant du miel et de pollen que les aliments conservés et un autre peigne vide pour la ponte de la reine. Recueillir le peigne contenant du miel et de pollen from une autre colonie intouchée après toutes les abeilles adhérentes sont enlevées.
    Note: L'utilisation de la boîte de ruche nucléaire (petite boîte de ruche moyenne) est recommandé.
  6. Collecter nourrices et butineuses précoces avec des marques de peinture 6 à 8 jours après la création de colonies seule cohorte.
    1. Pour collecter les abeilles nourrices, ramasser les travailleurs qui mettent leur tête dans les cellules de peigne pour prendre soin de la couvée. Utilisez des pinces pour recueillir les abeilles nourricières de peignes qui contiennent de nombreux travailleurs du couvain et des adultes.
      Remarque: Si HPG des travailleurs recueillies sont développés lorsque disséqués comme décrit à l'étape 1.7, ces travailleurs sont définis comme nourrices. Tenir les thoraces par des pinces est recommandé de ramasser les travailleurs des peignes.
    2. Pour collecter des butineuses, utiliser un filet pour capturer les insectes travailleurs qui retournent à leurs ruches avec des charges de pollen sur leurs pattes de derrière.
      Remarque: Si HPG des travailleurs capturés apparaissent rétrécis quand disséqués comme décrit à l'étape 1.7, les travailleurs sont définis comme butineuses.
  7. ClasSify le HPG en trois groupes, «développés», «intermédiaire» et «ratatinées» par la dissection sous un stéréomicroscope.
    1. Anesthetize 10-15 abeilles dans une cage d'insecte dans un réfrigérateur pendant 10-15 min jusqu'à ce que les abeilles ne peuvent pas voler ou marcher. Ensuite, déplacer les abeilles sur de la glace et de compléter l'anesthésie sur la glace pendant 5 min.
      Remarque: Il faut environ 15-20 minutes au total pour réaliser une anesthésie. Si le temps de l'anesthésie doit être raccourci, le nombre d'abeilles dans une cage devrait être réduite à 1-3 abeilles par cage.
    2. Disséquer la tête du corps avec des ciseaux et des pinces. Fixer la tête de cire dentaire placé sur une boîte de Pétri avec des épingles. Insérez deux broches dans les bases des antennes pour fixer la tête. Faire tremper les têtes fixes dans une solution saline insectes (130 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 1 mM de CaCl2).
    3. Retirez la face antérieure de la cuticule de la tête en utilisant des pinces fines et un couteau chirurgical sous un microscope binoculaire.
      Remarque: Les HPG peuvent être facilement trouvés dans la tête après le retrait de cuticle. Le HPG est un organe botryoïde qui existe autour du cerveau dans la tête.
    4. Enlever le tissu trachéal qui est un tissu membraneux blanc sous la cuticule. Puis, disséquer les HPG de la tête en les tirant lentement avec des pincettes.
    5. Classez HPG avec acini grande et circulaire comme «développés». Classez HPG avec petites et déformées acini comme «ratatinées». Classifier HPG correspondant ni «Développé» ni «ratatinées» comme «intermédiaire».
      Note: les photographies représentatives qui montrent ces trois classes d'états HPG sont indiqués sur la figure 2.
    6. Sujet «développés» et HPG 'ratatinées' à l'extraction de l'ARN comme «infirmière abeille HPG» et «HPG butineuses», respectivement, et comparer l'expression des gènes dans les HPG entre les nourrices et les butineuses (section 4).

2. Injection de 20E

  1. Collecter nourrices de colonies typiques comme described dans la procédure 1.6.1.
    Remarque: HPG ne peuvent pas être examinées dans ces abeilles que les abeilles seront élevés.
  2. Anesthésier les abeilles à 4 ° C dans un réfrigérateur (et non sur la glace).
    Remarque: Il faut environ 30 minutes pour réaliser une anesthésie. Si le temps de l'anesthésie est raccourci, le nombre d'abeilles dans la cage doit être réduite à 1-3 abeilles par cage.
  3. En utilisant une pince à épiler, immobiliser les abeilles sur cire dentaire placés sur une boîte de Pétri.
  4. Injecter 1 pl de solution de 20E dans la face antérieure de la tête à l'aide d'une pointe d'injection faite à partir d'une micropipette capillaire calibré à l'aide d'un extracteur d'aiguille de verre.
    1. 20E se dissoudre dans une solution saline à l'éthanol insectes mélange (130 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 1 mM de CaCl2) (1: 4) à 2,5 pg / pl.
    2. Branchez la pointe d'injection à un tube en caoutchouc, et connecter une pointe de micropipette jaune sur le côté opposé du tube.
    3. Placez 1 pi de solution de 20E sur parafilm en utilisant une micropipette, maintenez la pointe de micropipette jaune dans la bouche, und aspirer la solution dans la pointe d'injection.
    4. Insérez la pointe d'injection dans la base des antennes, et injecter la solution en soufflant à travers la pointe de micropipette jaune.
      Remarque: Le protocole indiqué dans cette étape est le procédé d'injection représentatif, mais l'utilisation de la machine d'injection automatique est recommandée pour la sécurité nécessaire 20.
  5. Rear les abeilles injectées dans des cages d'insectes à 33-36 ° C (la température idéale est de 35 ° C) dans des conditions sombres et humides (> 60% d'humidité relative) pour 1 ou 3 jours. mélange miel-eau électrique (1: 1) pour les abeilles. Si nécessaire, comptez survivre abeilles après l'injection.

3. Application de méthoprène

  1. Ramassez les peignes qui contiennent des pupes de colonies typiques après toutes les abeilles adultes adhérentes sont enlevées avec un pinceau. Incuber les peignes à 33-36 ° C (la température idéale est de 35 ° C) dans des conditions humides (> 60% d'humidité relative) pendant 1 jour.
  2. Après 6 jours, recueillir des travailleurs peints (âgés de 6 jours) à partir des colonies. Ramassez les travailleurs peints des peignes en tenant leurs thoraces avec des pincettes.
  3. Anesthésier les abeilles à 4 ° C dans un réfrigérateur (et non sur la glace) comme dans la procédure 2.2. En utilisant une pince à épiler, immobiliser les abeilles sur cire dentaire placés sur une boîte de Pétri et appliquer 1-5 pi de solution de méthoprène (50-250 ug / ul) dissous dans de l'acétone à leurs têtes à l'aide d'une micropipette. Utiliser un embout de filtre qui est résistant à l'acétone.
    Note: Acétone peut avoir des effets nocifs sur les abeilles conduisant à la mort. Si la forte mortalité des abeilles est observée, la réduction du volume de l'acétone à 1 ul au minimum est recommandée.
  4. Rear les abeilles dans des cages d'insectes à 33-36 ° C (le t idéalemperature est de 35 ° C) pendant 7 jours dans des conditions sombres et humides (> 60% d'humidité relative). mélange miel-eau électrique (1: 1) pour les abeilles. Si nécessaire, comptez survivre abeilles après application topique.
    Remarque: Dans cet article, les abeilles survivantes sont comptées 7 jours après l' application (tableau 3).

4. Extraction de l'ARN et RT-PCR quantitative

  1. Anesthetize abeilles et de disséquer HPG comme décrit dans les étapes 1.7.1 à 1.7.4.
  2. Ramassez les HPG disséqués dans un tube à centrifuger sur glace sèche et conserver à -80 ° C jusqu'à utilisation.
  3. Ajouter 400 ul de réactif pour la dénaturation des protéines.
    Remarque: Ce réactif est disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux).
  4. Homogénéiser les tissus HPG utilisant une main tendue mélangeur électrique avec un pilon d'homogénéisation qui correspond à l'intérieur d'un tube de microcentrifugation. Homogénéiser à une vitesse de rotation d'environ 300 tours par minute pendant 1 minute sur de la glace pour briser les cellules des tissus et lysent.
    tableau des matériaux).
  5. Ajouter 80 ul de chloroforme et bien mélanger. Incuber pendant 5 min à température ambiante.
  6. Centrifuger les tubes à centrifuger à 14170 xg pendant 15 min à 4 ° C. Transférer la phase aqueuse dans un nouveau tube. Ajouter un volume égal d'isopropanol et 1 ul de glycogène (5 mg / ml). Incuber à -20 ° C pendant au moins 20 min.
  7. Centrifuger les tubes à centrifuger à 14170 xg pendant 10 min à 4 ° C et retirer le surnageant.
  8. Ajouter 400 ul de 75% d'éthanol au culot et bien mélanger, centrifuger les tubes à centrifuger à 14170 xg pendant 15 min à 4 ° C, et retirer le surnageant. Répétez ces procédures une fois de plus.
  9. Air-sécher la pastille pendant 5-10 minutes, puis le dissoudre dans 10 l'eau libre de RNase-ul.
    Remarque: Le séchage complet de la pastille peut provoquer une insolubilisation de la pastille d'ARN dans l'eau. Ainsi, le culot qui est légèrement humide est approprié pourdissolvante.
  10. Mesurer la concentration d'ARN en utilisant un spectrophotomètre tel que NanoDrop ou similaire.
  11. Traiter 500 ng d'ARN total avec 2,0 U de DNase I par incubation à 37 ° C pendant 30 minutes pour dégrader l'ADN génomique contaminant.
  12. Reverse-transcrire 200 ng d'ARN DNase I-traité et effectuer PCR en temps réel en utilisant des kits disponibles dans le commerce (voir la liste dans la table des matières et réactifs) et des amorces spécifiques du gène (mrjp2; 5'-AAATGGTCGCTCAAAATGACAGA-3 'et 5 '-ATTCATCCTTTACAGGTTTGTTGC-3', Hbg3; 5 'TACCTGGCTTCGTGTCAAC-3' et 5'-ATCTTCGGTTTCCCTAGAGAATG-3 '). Effectuer la PCR comme suit: [95 ° C x 30 sec + (95 ° C x 5 sec + 60 ° C x 15 sec + 72 ° C x 20 sec) x 45-55 cycles].
  13. Normaliser la quantité de transcription avec celle du facteur d'élongation 1α-F2 (EF1α˗F2) ou protéine ribosomique 49 (rp49) 9,16,21,22. Ces gènes sont un contrôle fiable gènes pour l'analyse de l'expression génique dans les HPG en utilisant la qRT-PCR.
  14. Effectuer deux queues t-test pour détecter les différences significatives entre les deux groupes expérimentaux (abeilles nourricières vs butineuses précoces, les abeilles 20E traité contre les abeilles de contrôle, et les abeilles de méthoprène traité contre les abeilles de contrôle) en utilisant un logiciel statistique.
    Remarque: Si F-test suppose l'homogénéité de la variance, le test t de Student peut être utilisé. Dans le cas contraire, le test t de Welch, peut être utilisé.

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Representative Results

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Un aperçu du protocole de préparation des colonies mono-cohorte est illustrée à la figure 1A. Le cours du temps des expériences de préparation de colonies seule cohorte à un prélèvement d' échantillon est représenté sur la figure 1B. Les travailleurs qui ont satisfait aux critères de comportement pour le comportement de l' allaitement ou du comportement alimentaire ont été recueillies à partir des colonies mono-cohorte, et le développement HPG a été estimé à ces travailleurs Le tableau 1 montre la classification du développement HPG en trois groupes. «Développé», «intermédiaire» et «ratatinées» selon la taille. Photographies représentatives montrant ces trois classes de HPG sont indiqués sur la figure 2. Les résultats indiquent que les deux nourrices et butineuses précoces, selon les critères décrits dans le protocole, ont également été observées dans les colonies une seule cohorte. Et l' expression de mrjp2 Hbg3 dans les HPG est enriched dans les nourrices et les butineuses précoces, respectivement, indiquant que la fonction HPG est associée avec le rôle du travailleur (figure 3) 16.

La procédure pour l' injection 20E dans les têtes de travail est illustré sur la figure 4. Abeilles survivantes ont été comptées 1, 5 et 7 jours après l' injection pour étudier la survie taux d'abeilles injectés avec une solution saline d'insectes ou de solvant pour solution 20E avant l'expérience de 20E. À 7 jours après l' injection, d' environ 60 à 80% d'abeilles injectées étaient encore en vie, et un taux d'abeilles injectés avec un solvant pour la solution de 20F de survie était comparable à celle d'une solution saline d' insecte (tableau 2). L'effet de l'injection 20E diminution de l' expression des deux mrjp2 et Hgb3 dans les HPG (figure 5) 16. En plus de 20E, l'effet de l' application topique sur le méthoprène et mrjp2 Hbg3 tableau 3). D'un autre côté, seulement d' environ 20% à 30% d'abeilles injectés avec de l' acétone / abeille solution saline (1: 4) , la solution a survécu 7 jours après l' injection lorsque les abeilles survivantes ont été comptées 1, 3, 5 et 7 jours après l' injection (tableau 4) . Ainsi, la méthode d'application pour le traitement de méthoprène est adopté. Application de méthoprène a inhibé l'expression de mrjp2 et amélioré l'expression de Hbg3 (figure 6) 16.

Figure 1
Figure 1. Vue d' ensemble de l' expérience de la colonie une seule cohorte. (A) Schéma de préparation de colonies seule cohorte. (B) Le cours du temps l' expérience de preparing colonies seule cohorte à recueillir les abeilles nourrices et butineuses précoces. flèche horizontale indique le cours de la vie d'un travailleur dans les colonies une seule cohorte. Les nombres avec des lignes verticales indiquent l'âge des travailleurs. Non seulement butineuses précoces mais aussi nourrices surâgés (ancienne 28-32 jours) sont signalés se trouvent dans les colonies seule cohorte 15. Ainsi, la comparaison de la physiologie entre les abeilles nourricières et butineuses surâgés peut être réalisée dans les colonies mono-cohorte, bien que cela n'a pas été fait dans cette étude. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. Les photographies montrant les trois classes d'états HPG. Développé (A), intermédiaire (B), et ratatinées (C S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. Rôle associé à l' expression de mrjp2 et Hbg3 dans les HPG des travailleurs des colonies mono-cohorte. Le graphique affiche une comparaison des taux d' ARNm de mrjp2 (A) et Hbg3 (B) dans les HPG entre nourrices (N) et butineuses précoces (PF) de deux co-seule cohortelonies. Le niveau de chaque gène d'ARNm a été normalisée avec celle de la protéine ribosomique 49 (de rp49). Le niveau d'ARNm relative de chaque gène dans les HPG d'abeilles nourricières a été définie comme 1. Le niveau d'ARNm de mrjp2 dans certains butineuses précoces n'a pu être quantifiée en raison des intensités de signal inférieures au seuil de détection. Par conséquent, le nombre d'échantillons est différent entre les gènes. les niveaux d'ARNm relatifs sont indiqués avec l'erreur standard. Les astérisques indiquent des différences significatives entre les infirmières et les abeilles butineuses précoces (*, p <0,05; test t). Ce chiffre a été reproduit à partir de Ueno et al., (2015) 16. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4. Schéma du protocole pour 20E injection. Procédures 2.3 et 2.4 dans la section de protocole sont illustrés dans cette figure. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5. Effet de l' injection de 20E sur mrjp2 et d' expression Hbg3 dans le HPG 16. Le graphique montre une comparaison entre les taux d' ARNm de mrjp2 (A) et Hbg3 (B) dans les HPG entre les abeilles 20E 20E-traitées (+) et les abeilles de commande (20E-). Les numéros sous le graphique indiquent le jour après le traitement 20E. Le niveau de chaque gène d'ARNm a été normalisée avec celle du facteur d'élongation 1α-F2 (EF1-F2). niveau de l'ARNm relative dechaque gène dans les HPG d'abeilles de contrôle a été défini comme 1. Les niveaux d'ARNm relatifs sont indiqués avec une erreur standard. Un astérisque indique une différence significative entre les abeilles 20E-traités et les abeilles de contrôle (*, p <0,05; test t). Ce chiffre a été reproduit à partir de Ueno et al., (2015) 16. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 6
Figure 6. Effet de l' application de méthoprène sur mrjp2 et d' expression Hbg3 dans les HPG 16. Le graphique montre la comparaison des taux d' ARNm de mrjp2 (A) et Hbg3 (B) dans les HPG entre les abeilles méthoprène traités et les abeilles de contrôle. leniveau de chaque gène d'ARNm a été normalisée avec celle de EF1-F2. niveau de l'ARNm relative de chaque gène dans les HPG d'abeilles de contrôle a été défini comme 1. Les niveaux d'ARNm relatifs sont indiqués avec l'erreur standard. Les astérisques indiquent des différences significatives entre les abeilles méthoprène traités et les abeilles de contrôle (*, p <0,05; test t). Ce chiffre a été reproduit à partir de Ueno et al., (2015) 16. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Colony No. comportement observé Nombre de personnes dans chaque classe HPG
Développé Intermédiaire Réduit Total
1 Allaitement 8 1 1 dix
Foraging 0 4 7 11
2 Allaitement 4 2 0 6
Foraging 0 0 5 5

Tableau 1: Classification des HPG des travailleurs dont le comportement des soins infirmiers ou la recherche de nourriture a été observée dans les colonies une seule cohorte. taille HPG chez les travailleurs de deux colonies une seule cohorte (nos colonies 1 et 2.) ont été regroupés en trois classes; «Développé», «intermédiaire» et «ratatinées» par la taille.

Quelques jours après l'injection aucune injection saline Insecte Solvant pour 20E soln
Essai 1 Day0 15/15 15/15 14/15
J1 15/15 14/15 13/15
J5 14/15 13/15 11/15
J7 14/15 12/15 9/15
Essai 2 Day0 15/15 15/15 15/15
J1 15/15 13/15 15/15
J5 15/15 11/15 12/15
J7 14/15 10/15 12/15

Tableau 2: Taux de survie des abeilles injectés avec solvant pour solution 20E. Quinze travailleurs ont été préparés dans chaque groupe expérimental.

Jours après l'application Acétone méthoprène
Essai 1 jour 0 7/7 8/8
jour 7 7/7 6/8
Essai 2 jour 0 7/7 8/8
jour 7 7/7 8/8

Tableau 3: Taux de survie des abeilles traitées avec sept à huit travailleurs ont été préparés dans chaque groupe expérimental méthoprène..

Quelques jours après l'injection aucune injection Acétone / Bee saline (1: 4)
jour 0 15/15 15/15
jour 1 15/15 6/15
jour 3 15/15 5/15
jour 5 15/15 4/15
jour 7 15/15 4/15

Tableau 4: Taux de survie des abeilles injectés avec de l' acétone / abeille saline (1: 4). Solution Quinze travailleurs ont été préparés pour chaque groupe expérimental. Un mélange acétone / abeille solution saline (1: 4), la solution a été injecté dans l'abdomen de travail. La composition de la solution saline est d' abeille 130 mM de NaCl, 6 mM de KCl, 4 mM de MgCl2, 2,5 mM de CaCl2, 160 mM de saccharose, 25 mM de glucose et 10 mM de HEPES (pH 7,0).

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Discussion

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Préparation des colonies mono-cohorte

Ici , nous avons décrit le protocole utilisé dans notre étude précédente 16 pour préparer des colonies mono-cohorte pour l' analyse des HPG physiologie associée au changement dans le rôle des abeilles ouvrières. Abeilles infirmières et butineuses précoces qui ont satisfait aux critères décrits dans les procédures 1,6-1,7 et la figure 2 ont été observées dans les colonies une seule cohorte (tableau 1). Les photographies de la figure 2 seraient utiles dans la classification des HPG indique comme référence. Critères basés à la fois sur le comportement des travailleurs et le développement HPG sont valides pour définir les abeilles nourrices ou butineuses dans les colonies typiques. Rôle passage de soins infirmiers à la recherche de nourriture progressivement se déroule dans les colonies: la quantité de temps passé dans le comportement des soins infirmiers diminue progressivement tandis que le comportement alimentaire augmente progressivement pendant le rôle changement 2. Par conséquent, il serait difficile de recueillir des travailleurs qu'exclusivementeffectuer des soins infirmiers ou butinage seulement par des critères comportementaux. Le résultat que l' expression de mrjp2 et Hbg3 dans les HPG est associé au rôle des travailleurs indique clairement que le protocole décrit ici peut être adoptée pour examiner HPG physiologie nourrices et les butineuses précoces de colonies mono-cohorte (figure 3). Critères basés à la fois sur le comportement des travailleurs et le développement HPG pourraient également être applicables dans la définition de nourrices et butineuses précoces des colonies mono-cohorte. En plus des HPG, d'autres glandes exocrines dans la tête subissent des changements physiologiques en association avec le rôle changement. Par exemple, la fonction des changements des glandes mandibulaires de la synthèse des acides gras pour l' alimentation du couvain à la synthèse des phéromones d' alarme 2-heptanone 2. Le protocole décrit ici peut donc être adapté pour examiner la physiologie de rôle associé à des glandes exocrines autres que les HPG.

collection réussie de nabeilles URSE et butineuses précoces de colonies mono-cohorte dépend de la collecte d'un nombre suffisant de travailleurs nouvellement apparus lorsque les colonies sont préparées. Si un faible nombre de travailleurs nouvellement écloses sont recueillis, il serait difficile de recueillir suffisamment d'abeilles nourricières et butineuses précoces. En outre, l'état des reines est un autre point clé pour la collecte d'échantillons réussie. Queens avec un grand abdomen sont bons pour pondre des œufs parce que ces reines ont généralement développé des ovaires. Ainsi, le travail des travailleurs est pensé pour être efficacement divisé, même dans les colonies seule cohorte parce que le couvain est constamment alimentée par la reine. Si aucun couvain est fourni, il serait difficile de recueillir des abeilles nourricières des colonies mono-cohorte. Enfin, le marquage des travailleurs utilisant la peinture d'affiches est nécessaire pour assurer que les travailleurs sont collectées à partir des colonies mono-cohorte, parce que les butineuses reviennent parfois à la mauvaise colonie. Pour recueillir des butineuses précoces de manière efficace, des marques de peinture doivent êtreappliquée au plus grand nombre possible de travailleurs (plus de 900 travailleurs nouvellement écloses par une seule cohorte colonie). L'utilisation de l'encre à base d'eau pour le marquage peut être recommandée, car une encre à base d'huile, qui contient habituellement des composés organiques volatils, pourrait perturber la communication chimique entre les abeilles. Les marques d'encre à base d'eau ne se décolorent pas beaucoup au cours de l'expérience.

Le traitement hormonal

Nous avons également décrit le protocole d'injection 20E dans la tête des travailleurs pour examiner l'effet de ecdysone sur HPG physiologie (mrjp2 et expression Hbg3). Le taux de survie des abeilles injecté avec une solution saline d' insecte ou le solvant pour 20E solution était suffisante pour l'analyse subséquente, ce qui indique que le protocole décrit ici pour injection à l' aide d' une pointe d'injection et solvant pour 20E solution peut être adoptée pour l'expérience d'injection de 20E (tableau 2 ). En outre, la comparaison de l'expression génique dans les HPGentre les abeilles 20E traitées et les abeilles témoins ont indiqué que la 20E injectée a changé l'expression de mrjp2 et Hbg3, les deux qui sont liés à la fonction HPG (figure 5). Ce résultat suggère que le protocole décrit ici serait utile pour examiner les effets de l'ecdysone sur HPG physiologie, et peut être adoptée pour l'examen d'autres glandes exocrines dans la tête, comme les glandes mandibulaires. En outre, le procédé d'injection peut être adoptée pour injecter d'autres produits chimiques. Par exemple, le protocole décrit ici serait approprié pour l'injection de solutions d'ARN double brin dans les têtes pour les expériences de knockdown de gènes.

En plus de 20E, nous avons décrit un protocole d'application méthoprène, qui est un analogue de l'hormone juvénile. Méthoprène est généralement appliquée à l'abdomen. D'autre part, le méthoprène a été appliquée à la tête des travailleurs, ici. Presque toutes les abeilles avec application topique de méthoprène ou de l'acétone ont survécu 7 jours après le traitement, Ce qui suggère que l' application de méthoprène 5 pi ou d'une solution d'acétone à la tête a peu d' effet sur ​​le taux de survie des travailleurs (tableau 3). En outre, la comparaison des mrjp2 et d' expression dans les Hbg3 HPG entre methoprene- et les abeilles traitées à l'acétone indique que la demande de méthoprène inhibe l' expression mrjp2 et augmente l' expression Hbg3 (figure 6). Ces résultats suggèrent que le protocole décrit ici est appropriée pour analyser les effets de méthoprène sur la physiologie des glandes exocrines comme les HPG dans la tête.

traitement hormonal réussie dépend du taux d'abeilles traitées de survie. exposition à basse température dans un réfrigérateur peut être approprié pour anesthésier les abeilles. Anesthésie sur la glace est pas recommandé parce que les abeilles vont se mouiller sur la glace, ce qui conduit à un faible taux de survie. En outre, la méthode d'injection pourrait être un autre point clé pour garder les abeilles vivant. Il est important de make la pointe d'injection long et mince, et de le façonner à une pointe acérée à l'aide du cutter pour minimiser les dommages aux abeilles par injection. Cependant, la méthode d'injection pourrait ne pas être appropriée pour examiner les effets du méthoprène sur HPG physiologie, parce que le solvant pour méthoprène acétone affecte négativement la survie des abeilles (tableau 4). En outre, la méthode d'injection décrite ici peut ne pas être approprié pour l'analyse comportementale dans les colonies d'abeilles injectées seraient exclues de leurs colonies quand ils sont réintroduits après l'injection. Les travailleurs ayant des blessures légères pourraient être exclues des colonies. D'autres méthodes, telles que l'application ou l'administration orale de l'hormone peuvent être appropriés pour l'analyse comportementale.

La seule colonie cohorte a été utilisée pour examiner la régulation de la division du travail des abeilles ouvrières 10,11. En outre, le traitement par l'hormone juvénile a été utilisé pour l'examen du comportement et du cerveau functisur lié à la division du travail 11. Cependant, des protocoles détaillés tant pour la préparation des colonies mono-cohorte et le traitement avec JH n'a pas été précédemment fournies dans un tel détail. Récemment, l'importance de l' ecdysone dans la division du travail sont de plus en plus reconnu, et la régulation de la division du travail à la fois par JH et ecdysone est suggéré 23. Les protocoles détaillés pour la préparation réussie de colonies mono-cohorte et le traitement hormonal tels que JH et ecdysone décrit dans cet article pourraient contribuer à l'avancement de l'étude de la physiologie des travailleurs.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
UNIPOSCA Mitsubishi pencil PC-5M Marker pen for the application of marks to bees  
20-hydroxyecdysone Sigma Aldrich H5142
Methoprene Sigma Aldrich 33375
Breeding case insect IRIS OHYAMA CP-SS
Electromotion mixier  ISO 23M-R25 homogenization of tissue
TRIZol Reagent Invitrogen 15596-026 the reagent for total RNA extraction
DNase I  Takara 2270A
PrimeScript RT reagent kit Takara RR037A the reagent for reverse transcription
SYBR Premix ExTaq II Takara RR820A the reagent for real-time PCR
LightCycle 1.2 Instrument Roche 12011468001 the instrument for real-time PCR
LightCycle Capillaries (20μl) Roche 4929292001 the material for real-time PCR

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References

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Préparation des colonies mono-cohorte et Traitement hormonal des travailleurs Honeybees à Analyser Physiologie Associé à Rôle et / ou le système endocrinien
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Ueno, T., Kawasaki, K., Kubo, T. Preparation of Single-cohort Colonies and Hormone Treatment of Worker Honeybees to Analyze Physiology Associated with Role and/or Endocrine System. J. Vis. Exp. (115), e54240, doi:10.3791/54240 (2016).More

Ueno, T., Kawasaki, K., Kubo, T. Preparation of Single-cohort Colonies and Hormone Treatment of Worker Honeybees to Analyze Physiology Associated with Role and/or Endocrine System. J. Vis. Exp. (115), e54240, doi:10.3791/54240 (2016).

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