הכנת מושבות אחת-עוקבה טיפול הורמונלי של דבורי הדבש Worker לנתח Associated פיזיולוגיה עם תפקיד ו / או המערכת האנדוקרינית
Summary
כאן אנו מתארים הפרוטוקול המפורט שלנו לעריכת מושבות דבורים חד עוקבה – כלי שימושי לניתוח הפיסיולוגיה עובדת הקשורים התפקיד. כמו כן, אנו מתארים פרוטוקולים מפורטים לטיפול עובדים עם הורמון נעורי ecdysone להעריך את המעורבות של הורמונים אלה בויסות התנהגות עובד ו / או פיזיולוגיה.
Abstract
Honeybee workers are engaged in various tasks related to maintaining colony activity. The tasks of the workers change according to their age (age-related division of labor). Young workers are engaged in nursing the brood (nurse bees), while older workers are engaged in foraging for nectar and pollen (foragers). The physiology of the workers changes in association with this role shift. For example, the main function of the hypopharyngeal glands (HPGs) changes from the secretion of major royal jelly proteins (MRJPs) to the secretion of carbohydrate-metabolizing enzymes. Because worker tasks change as the workers age in typical colonies, it is difficult to discriminate the physiological changes that occur with aging from those that occur with the role shift. To study the physiological changes in worker tissues, including the HPGs, in association with the role shift, it would be useful to manipulate the honeybee colony population by preparing single-cohort colonies in which workers of almost the same age perform different tasks. Here we describe a detailed protocol for preparing single-cohort colonies for this analysis. Six to eight days after single-cohort colony preparation, precocious foragers that perform foraging tasks earlier than usual appear in the colony. Representative results indicated role-associated changes in HPG gene expression, suggesting role-associated HPG function. In addition to manipulating the colony population, analysis of the endocrine system is important for investigating role-associated physiology. Here, we also describe a detailed protocol for treating workers with 20-hydroxyecdysone (20E), an active form of ecdysone, and methoprene, a juvenile hormone analogue. The survival rate of treated bees was sufficient to examine gene expression in the HPGs. Gene expression changes were observed in response to 20E- and/or methoprene-treatment, suggesting that hormone treatments induce physiological changes of the HPGs. The protocol for hormone treatment described here is appropriate for examining hormonal effects on worker physiology.
Introduction
דבורת הדבש האירופית, שהאפיס Apis, הוא חרק eusocial עם חברה מאורגנת מאוד 1. דבורי עבודה (כת עבודה) עוסקים משימות שונות כדי לשמור על פעילות מושבה, ומשימות אלה לשנות בהתאם לגיל של דבורת הדבש עובד לאחר eclosion, אשר נקרא חלוקה הקשורות לגיל העבודה 2-4. עובדים צעירים (<13 ימים) לטפל גוזלים בכוורת על ידי הפרשת מזון מלכות (דבורי אחות), ואילו עובדי מבוגרים (> 15 ימים) לאסוף צוף ואבקה מחוץ לכוורת (לקטים) 2-4. הפיזיולוגיה של העובדים משתנה בשיתוף עם משמרת את התפקיד הזה. לדוגמא, הפונקציה של בלוטות hypopharyngeal (HPGs), לזווג בלוטות אקסוקרינית הממוקמות בראש, שינויים בשיתוף עם מעבר התפקיד מ סיעודי ליקוט 2,5. HPGs דבורה מטפל בעיקר לסנתז חלבוני מזון המלכות גדולים, המהווים מרכיבים עיקריים של חלב דבורה. מצד השני, forager HPGs בעיקרלסנתז אנזימים חילוף חומרים של פחמימות, כגון-glucosidase α III, לעבד צוף לתוך דבש ידי המרת סוכרוז לגלוקוז ופרוקטוז. המחקרים הקודמים שלנו גילו כי הביטוי של mrjp2, מקודד חלבון מזון מלכות גדול, Hbg3, מקודד-glucosidase α III, שינויים במהלך תפקיד המשמרת 6-9.
כדי לקבוע אם השינויים הפיסיולוגיים ברקמות העובד, לרבות HPGs, קשור בתפקיד המשמרת או עם הגיל של העובדים, זה יהיה שימושי כדי לתפעל את רכב האוכלוסייה של מושבת דבורת דבש, כגון להכין-עוקבה יחידה מושבות בה עובדים של כמעט בני אותו גיל לבצע משימות שונות 10,11. רובינסון et al. (1989) תיאר שיטה להקמת מושבה אחת-עוקבה 10. מושבות קוהורט יחיד בתחילה מהוות מלכה 0-2 יום עובדים ישנים. ימים ספורים לאחר הקמת המושבות, עובדי ALMost באותו הגיל להניח משימות שונות. חלק מהעובדים לבצע משימות סיעוד כמו במושבות טיפוסיות, ואילו עובדים אחרים לבצע משימות ליקוט מזון מוקדם מהרגיל ולכן נקראים לקטים מוקדמים. ג'ין השוואות ביטוי בין דבורי אחות לקטים מוקדמים תספקנה מידע שימושי על הפיסיולוגיה קשור התפקיד של רקמות עובדים 12-16. כאן אנו מתארים פרוטוקול מפורט להכנת מושבות-עוקבה אחת לניתוח של משחק תפקידים ו / או גיל הקשורים לפיזיולוגיה של HPGs 16. כמו כן, אנו מתארים בקצרה כיצד לבחון את ביטוי הגנים של mrjp2 ו Hbg3 ידי תגובת שרשרת שעתוק-פולימראז הפוך כמותית (RT-PCR) להעריך פיזיולוגיה HPG.
בנוסף הניתוח של פיזיולוגיה עובד במושבות חד עוקבה, הבדיקה של מערכת האנדוקרינית חשובה לניתוח מנגנוני הוויסות של פיזיולוגיה עובדים הקשורים תפקיד. הורמון נעורים (JH), אשר known כמו ההורמון 'סטטוס קוו' ב זחלי חרקים, מאיץ את המעבר בתפקיד מ סיעוד לחפש מזון דבורים עובדים 11. יתר על כן, ecdysone, אשר ידוע בתור הורמון השרה במהלך המטמורפוזה, עשוי להיות מעורב תפקיד המשמרת כמו גנים המקודדים מולקולות איתות ecdysone באים לידי ביטוי בגופי הפטריות, מרכז גבוה של המוח עובד 17-19. לכן, אנו גם מתארים את הפרוטוקול המפורט השתמש במחקר הקודם שלנו 16 לטיפול עובדים עם 20E, שהינה בעלת צורה פעילה של ecdysone, ו methoprene, אנלוג JH, לניתוח של שפעת המערכת האנדוקרינית על פיזיולוגית HPG (ביטוי של mrjp2 ו Hbg3).
Protocol
Representative Results
Discussion
הכנת מושבות אחת-עוקבה
כאן תיארנו את פרוטוקול השתמשו במחקר הקודם שלנו 16 להכין מושבות אחת-עוקבה לניתוח של הפיזיולוגיה HPG הקשורים משמרת בתפקיד הדבורים הפועלות. הדבורים המטפלות ואת הלקטים בוגרת לגילה, שלעתים עומדת בקריטריונים…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a Grant-in-Aid for Scientific Research (B) and a Grant-in Aid for Scientific Research on Innovative Areas ‘Systems Molecular Ethology’ from the Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology (MEXT) of Japan. T.U. was the recipient of a Grant-Aid from the Japan Society for the Promotion of Science for Young Scientists.
Materials
| UNIPOSCA | Mitsubishi pencil | PC-5M | Marker pen for the application of marks to bees |
| 20-hydroxyecdysone | Sigma Aldrich | H5142 | |
| Methoprene | Sigma Aldrich | 33375 | |
| Breeding case insect | IRIS OHYAMA | CP-SS | |
| Electromotion mixier | ISO | 23M-R25 | homogenization of tissue |
| TRIZol Reagent | Invitrogen | 15596-026 | the reagent for total RNA extraction |
| DNase I | Takara | 2270A | |
| PrimeScript RT reagent kit | Takara | RR037A | the reagent for reverse transcription |
| SYBR Premix ExTaq II | Takara | RR820A | the reagent for real-time PCR |
| LightCycle 1.2 Instrument | Roche | 12011468001 | the instrument for real-time PCR |
| LightCycle Capillaries (20μl) | Roche | 4929292001 | the material for real-time PCR |
References
- Wilson, E. O. . The insect societies. , (1971).
- Winston, M. L. . The biology of the honey bee. , (1987).
- Lindauer, M. Ein Beitrag zur Frage der Arbeitsteilung im Bienenstaat. Zeitschrift für vergleichende Physiologie. 34 (4), 299-345 (1952).
- Sakagami, S. Untersuchungen uber die Arbeitsteilung in einen Zwergvolk der Honigbienen. Beitrage zur Biologie des Bienenvolkes, Apis mellifera L. I. Jap J Zool. 11, 117-185 (1953).
- Kubo, T., et al. Change in the expression of hypopharyngeal-gland proteins of the worker honeybees (Apis mellifera L.) with age and/or role. J Biochem. 119 (2), 291-295 (1996).
- Ohashi, K., Natori, S., Kubo, T. Change in the mode of gene expression of the hypopharyngeal gland cells with an age-dependent role change of the worker honeybee Apis mellifera L. Eur J Biochem. 249 (3), 797-802 (1997).
- Ohashi, K., Natori, S., Kubo, T. Expression of amylase and glucose oxidase in the hypopharyngeal gland with an age-dependent role change of the worker honeybee (Apis mellifera L). Eur J Biochem. 265 (1), 127-133 (1999).
- Ohashi, K., Sawata, M., Takeuchi, H., Natori, S., Kubo, T. Molecular cloning of cDNA and analysis of expression of the gene for alpha-glucosidase from the hypopharyngeal gland of the honeybee Apis mellifera L. Biochem Biophys Res Commun. 221 (2), 380-385 (1996).
- Ueno, T., Nakaoka, T., Takeuchi, H., Kubo, T. Differential gene expression in the hypopharyngeal glands of worker honeybees (Apis mellifera L.) associated with an age-dependent role change. Zoolog Sci. 26 (8), 557-563 (2009).
- Robinson, G. E., Page, R. E., Strambi, C., Strambi, A. Hormonal and genetic control of behavioral integration in honey bee colonies. Science. 246 (4926), 109-112 (1989).
- Sullivan, J. P., Fahrbach, S. E., Robinson, G. E. Juvenile hormone paces behavioral development in the adult worker honey bee. Horm Behav. 37 (1), 1-14 (2000).
- Ben-Shahar, Y., Robichon, A., Sokolowski, M. B., Robinson, G. E. Influence of gene action across different time scales on behavior. Science. 296 (5568), 741-744 (2002).
- Lehman, H. K., et al. Division of labor in the honey bee (Apis mellifera): the role of tyramine beta-hydroxylase. J Exp Biol. 209 (Pt 14), 2774-2784 (2006).
- Mutti, N. S., Wang, Y., Kaftanoglu, O., Amdam, G. V. Honey bee PTEN–description, developmental knockdown, and tissue-specific expression of splice-variants correlated with alternative social phenotypes). PLoS One. 6 (7), e22195 (2011).
- Whitfield, C. W., Cziko, A. M., Robinson, G. E. Gene expression profiles in the brain predict behavior in individual honey bees. Science. 302 (5643), 296-299 (2003).
- Ueno, T., Takeuchi, H., Kawasaki, K., Kubo, T. Changes in the Gene Expression Profiles of the Hypopharyngeal Gland of Worker Honeybees in Association with Worker Behavior and Hormonal Factors. PLoS One. 10 (6), e0130206 (2015).
- Paul, R. K., Takeuchi, H., Matsuo, Y., Kubo, T. Gene expression of ecdysteroid-regulated gene E74 of the honeybee in ovary and brain. Insect Mol Biol. 14 (1), 9-15 (2005).
- Takeuchi, H., et al. Identification of a novel gene, Mblk-1, that encodes a putative transcription factor expressed preferentially in the large-type Kenyon cells of the honeybee brain. Insect Mol Biol. 10 (5), 487-494 (2001).
- Takeuchi, H., Paul, R. K., Matsuzaka, E., Kubo, T. EcR-A expression in the brain and ovary of the honeybee (Apis mellifera L). Zoolog Sci. 24 (6), 596-603 (2007).
- Yamane, T., Miyatake, T. Reduced female mating receptivity and activation of oviposition in two Callosobruchus species due to injection of biogenic amines. Journal of Insect Physiology. 56 (3), 271-276 (2010).
- Ben-Shahar, Y., Leung, H. T., Pak, W. L., Sokolowski, M. B., Robinson, G. E. cGMP-dependent changes in phototaxis: a possible role for the foraging gene in honey bee division of labor. J Exp Biol. 206 (Pt 14), 2507-2515 (2003).
- Danforth, B. N., Ji, S. Elongation factor-1 alpha occurs as two copies in bees: implications for phylogenetic analysis of EF-1 alpha sequences in insects. Mol Biol Evol. 15 (3), 225-235 (1998).
- Pandey, A., Bloch, G. Juvenile hormone and ecdysteroids as major regulators of brain and behavior in bees. Current Opinion in Insect Science. 12, 26-37 (2015).
