Utarbeidelse av Single-cohort Colonies og hormonbehandling av arbeider Honeybees å analysere fysiologi Associated med Rolle og / eller endokrine systemet
Summary
Her beskriver vi vår detaljert protokoll for utarbeidelse av enkelt-kohort Honeybee kolonier – et nyttig verktøy for å analysere rollen assosierte arbeidstaker fysiologi. Vi beskriver også detaljerte protokoller for behandling av arbeidstakere med juvenil hormon og -ekdyson å evaluere involvering av disse hormonene i reguleringen av arbeideren atferd og / eller fysiologi.
Abstract
Honeybee workers are engaged in various tasks related to maintaining colony activity. The tasks of the workers change according to their age (age-related division of labor). Young workers are engaged in nursing the brood (nurse bees), while older workers are engaged in foraging for nectar and pollen (foragers). The physiology of the workers changes in association with this role shift. For example, the main function of the hypopharyngeal glands (HPGs) changes from the secretion of major royal jelly proteins (MRJPs) to the secretion of carbohydrate-metabolizing enzymes. Because worker tasks change as the workers age in typical colonies, it is difficult to discriminate the physiological changes that occur with aging from those that occur with the role shift. To study the physiological changes in worker tissues, including the HPGs, in association with the role shift, it would be useful to manipulate the honeybee colony population by preparing single-cohort colonies in which workers of almost the same age perform different tasks. Here we describe a detailed protocol for preparing single-cohort colonies for this analysis. Six to eight days after single-cohort colony preparation, precocious foragers that perform foraging tasks earlier than usual appear in the colony. Representative results indicated role-associated changes in HPG gene expression, suggesting role-associated HPG function. In addition to manipulating the colony population, analysis of the endocrine system is important for investigating role-associated physiology. Here, we also describe a detailed protocol for treating workers with 20-hydroxyecdysone (20E), an active form of ecdysone, and methoprene, a juvenile hormone analogue. The survival rate of treated bees was sufficient to examine gene expression in the HPGs. Gene expression changes were observed in response to 20E- and/or methoprene-treatment, suggesting that hormone treatments induce physiological changes of the HPGs. The protocol for hormone treatment described here is appropriate for examining hormonal effects on worker physiology.
Introduction
Den europeiske honningbie, Apis mellifera, er en eusocial insekt med et organisert samfunn 1. Worker honningbier (arbeidskraft kaste) er engasjert i ulike oppgaver for å opprettholde koloni aktivitet, og disse oppgavene endres i henhold til arbeidstake honningbie alder etter eklosjonshormon, som er referert til som aldersrelatert arbeidsdeling 2-4. Unge arbeidstakere (<13 dager gamle) tar seg av stamfisk i bikuben ved å skille royal gelé (sykepleier bier), mens eldre arbeidstakere (> 15 dager gammel) samle nektar og pollen utenfor bikuben (nitter) 2-4. Fysiologi av arbeiderne endringer i forbindelse med denne rollen skift. For eksempel funksjonen til hypopharyngeal kjertler (HPGs), sammen eksokrine kjertler som ligger i hodet, endringer i forbindelse med rollen skifte fra sykehjem til beite 2,5. Sykepleier bee HPGs hovedsakelig syntetisere store kongelige gel proteiner, som er viktige komponenter i bee melk. På den annen side, nitter HPGs hovedsakeligsyntetisere karbohydrat-metaboliserende enzymer, slik som α-glukosidase III, for å behandle nektar til honning ved omdannelse av sukrose til glukose og fruktose. Våre tidligere undersøkelser avslørte at ekspresjonen av mrjp2, som koder for et stort Royal Jelly protein, og Hbg3, som koder for α-glukosidase III, forandringer i løpet av den rollen skift 6-9.
For å avgjøre om de fysiologiske endringer i arbeider vev, inkludert HPGs, er assosiert med rollen skift eller med en alder av arbeiderne, ville det være nyttig å manipulere befolkningen sammensetningen av en bie koloni, som for eksempel å forberede single-kohorten kolonier der arbeidstakerne på nesten samme alder utføre forskjellige oppgaver 10,11. Robinson et al. (1989) beskrives en fremgangsmåte for å etablere en enkelt-kohort koloni 10. Single-cohort kolonier i første omgang omfatte en dronning og 0-2 dag gamle arbeidere. Flere dager etter å etablere kolonier, arbeidere av almost på samme alder anta forskjellige oppgaver. Noen arbeidere utføre sykepleieroppgaver som i typiske kolonier, mens andre arbeidstakere utfører foraging oppgaver tidligere enn vanlig, og blir derfor kalt veslevoksen nitter. Genuttrykk sammenligninger mellom sykepleier bier og veslevoksen nitter vil gi nyttig informasjon om rollen assosierte fysiologi arbeidstaker vev 12-16. Her beskriver vi en detaljert protokoll for å forberede enkelt kohortstudier kolonier for analyse av rolle- og / eller alder-assosiert fysiologi HPGs 16. Vi har også kort beskrive hvordan man skal undersøke genekspresjon av mrjp2 og Hbg3 ved kvantitativ revers transkripsjon-polymerasekjedereaksjon (RT-PCR) for å evaluere HPG fysiologi.
I tillegg til analyse av arbeideren fysiologi i enkelt-kohort kolonier, er undersøkelse av det endokrine system viktig for å analysere de regulatoriske mekanismer rolle-assosierte arbeider fysiologi. Juvenilt hormon (JH), som er known som "status quo" hormon i insektlarver, akselererer skifte i rollen fra sykepleier til beite i arbeideren honningbier 11. Videre er ekdyson, som er kjent som molting hormon under metamorfose, kan være involvert i rollen skift som gener som koder for ekdyson signalmolekyler er uttrykt i soppen legemene, et høyere senter av arbeideren hjernen 17-19. Derfor har vi også beskrive detaljert protokoll som brukes i vår tidligere studie 16 for å behandle arbeidere med 20E, som er en aktiv form for ekdyson, og Methoprene, en JH-analog, for analyse av effekten av det endokrine systemet på HPG fysiologi (ekspresjon av mrjp2 og Hbg3).
Protocol
Representative Results
Discussion
Utarbeidelse av single-kohort kolonier
Her beskrev vi protokollen som brukes i vår forrige undersøkelse 16 for å forberede enkelt kohortstudier kolonier for analyse av HPG fysiologi knyttet til skift i rollen som arbeidende biene. Sykepleier bier og veslevoksen nitter som tilfredsstilte kriteriene som er beskrevet i prosedyrer 1,6-1,7 og figur 2 ble observert i enkelt-kohort kolonier (tabell 1). Fotografiene i figur 2 vil være…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a Grant-in-Aid for Scientific Research (B) and a Grant-in Aid for Scientific Research on Innovative Areas ‘Systems Molecular Ethology’ from the Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology (MEXT) of Japan. T.U. was the recipient of a Grant-Aid from the Japan Society for the Promotion of Science for Young Scientists.
Materials
| UNIPOSCA | Mitsubishi pencil | PC-5M | Marker pen for the application of marks to bees |
| 20-hydroxyecdysone | Sigma Aldrich | H5142 | |
| Methoprene | Sigma Aldrich | 33375 | |
| Breeding case insect | IRIS OHYAMA | CP-SS | |
| Electromotion mixier | ISO | 23M-R25 | homogenization of tissue |
| TRIZol Reagent | Invitrogen | 15596-026 | the reagent for total RNA extraction |
| DNase I | Takara | 2270A | |
| PrimeScript RT reagent kit | Takara | RR037A | the reagent for reverse transcription |
| SYBR Premix ExTaq II | Takara | RR820A | the reagent for real-time PCR |
| LightCycle 1.2 Instrument | Roche | 12011468001 | the instrument for real-time PCR |
| LightCycle Capillaries (20μl) | Roche | 4929292001 | the material for real-time PCR |
References
- Wilson, E. O. . The insect societies. , (1971).
- Winston, M. L. . The biology of the honey bee. , (1987).
- Lindauer, M. Ein Beitrag zur Frage der Arbeitsteilung im Bienenstaat. Zeitschrift für vergleichende Physiologie. 34 (4), 299-345 (1952).
- Sakagami, S. Untersuchungen uber die Arbeitsteilung in einen Zwergvolk der Honigbienen. Beitrage zur Biologie des Bienenvolkes, Apis mellifera L. I. Jap J Zool. 11, 117-185 (1953).
- Kubo, T., et al. Change in the expression of hypopharyngeal-gland proteins of the worker honeybees (Apis mellifera L.) with age and/or role. J Biochem. 119 (2), 291-295 (1996).
- Ohashi, K., Natori, S., Kubo, T. Change in the mode of gene expression of the hypopharyngeal gland cells with an age-dependent role change of the worker honeybee Apis mellifera L. Eur J Biochem. 249 (3), 797-802 (1997).
- Ohashi, K., Natori, S., Kubo, T. Expression of amylase and glucose oxidase in the hypopharyngeal gland with an age-dependent role change of the worker honeybee (Apis mellifera L). Eur J Biochem. 265 (1), 127-133 (1999).
- Ohashi, K., Sawata, M., Takeuchi, H., Natori, S., Kubo, T. Molecular cloning of cDNA and analysis of expression of the gene for alpha-glucosidase from the hypopharyngeal gland of the honeybee Apis mellifera L. Biochem Biophys Res Commun. 221 (2), 380-385 (1996).
- Ueno, T., Nakaoka, T., Takeuchi, H., Kubo, T. Differential gene expression in the hypopharyngeal glands of worker honeybees (Apis mellifera L.) associated with an age-dependent role change. Zoolog Sci. 26 (8), 557-563 (2009).
- Robinson, G. E., Page, R. E., Strambi, C., Strambi, A. Hormonal and genetic control of behavioral integration in honey bee colonies. Science. 246 (4926), 109-112 (1989).
- Sullivan, J. P., Fahrbach, S. E., Robinson, G. E. Juvenile hormone paces behavioral development in the adult worker honey bee. Horm Behav. 37 (1), 1-14 (2000).
- Ben-Shahar, Y., Robichon, A., Sokolowski, M. B., Robinson, G. E. Influence of gene action across different time scales on behavior. Science. 296 (5568), 741-744 (2002).
- Lehman, H. K., et al. Division of labor in the honey bee (Apis mellifera): the role of tyramine beta-hydroxylase. J Exp Biol. 209 (Pt 14), 2774-2784 (2006).
- Mutti, N. S., Wang, Y., Kaftanoglu, O., Amdam, G. V. Honey bee PTEN–description, developmental knockdown, and tissue-specific expression of splice-variants correlated with alternative social phenotypes). PLoS One. 6 (7), e22195 (2011).
- Whitfield, C. W., Cziko, A. M., Robinson, G. E. Gene expression profiles in the brain predict behavior in individual honey bees. Science. 302 (5643), 296-299 (2003).
- Ueno, T., Takeuchi, H., Kawasaki, K., Kubo, T. Changes in the Gene Expression Profiles of the Hypopharyngeal Gland of Worker Honeybees in Association with Worker Behavior and Hormonal Factors. PLoS One. 10 (6), e0130206 (2015).
- Paul, R. K., Takeuchi, H., Matsuo, Y., Kubo, T. Gene expression of ecdysteroid-regulated gene E74 of the honeybee in ovary and brain. Insect Mol Biol. 14 (1), 9-15 (2005).
- Takeuchi, H., et al. Identification of a novel gene, Mblk-1, that encodes a putative transcription factor expressed preferentially in the large-type Kenyon cells of the honeybee brain. Insect Mol Biol. 10 (5), 487-494 (2001).
- Takeuchi, H., Paul, R. K., Matsuzaka, E., Kubo, T. EcR-A expression in the brain and ovary of the honeybee (Apis mellifera L). Zoolog Sci. 24 (6), 596-603 (2007).
- Yamane, T., Miyatake, T. Reduced female mating receptivity and activation of oviposition in two Callosobruchus species due to injection of biogenic amines. Journal of Insect Physiology. 56 (3), 271-276 (2010).
- Ben-Shahar, Y., Leung, H. T., Pak, W. L., Sokolowski, M. B., Robinson, G. E. cGMP-dependent changes in phototaxis: a possible role for the foraging gene in honey bee division of labor. J Exp Biol. 206 (Pt 14), 2507-2515 (2003).
- Danforth, B. N., Ji, S. Elongation factor-1 alpha occurs as two copies in bees: implications for phylogenetic analysis of EF-1 alpha sequences in insects. Mol Biol Evol. 15 (3), 225-235 (1998).
- Pandey, A., Bloch, G. Juvenile hormone and ecdysteroids as major regulators of brain and behavior in bees. Current Opinion in Insect Science. 12, 26-37 (2015).
