Cruciale uitdagingen voor het onderzoeksgebied diabetes zijn de moleculaire mechanismen die eilandje β-cellen replicatie en op werkwijzen voor het stimuleren van β-celregeneratie ontwikkelen begrijpen. Hierin een high-gehalte screening methode voor het identificeren en evalueren van de β-cel-replicatie bevorderende activiteit van kleine moleculen wordt gepresenteerd.
Loss of insulin-producing β-cells is a central feature of diabetes. While a variety of potential replacement therapies are being explored, expansion of endogenous insulin-producing pancreatic islet β-cells remains an attractive strategy. β-cells have limited spontaneous regenerative activity; consequently, a crucial research effort is to develop a precise understanding of the molecular pathways that restrain β-cell growth and to identify drugs capable of overcoming these restraints. Herein an automated high-content image-based primary-cell screening method to identify β-cell replication-promoting small molecules is presented. Several, limitations of prior methodologies are surmounted. First, use of primary islet cells rather than an immortalized cell-line maximizes retention of in vivo growth restraints. Second, use of mixed-composition islet-cell cultures rather than a β-cell-line allows identification of both lineage-restricted and general growth stimulators. Third, the technique makes practical the use of primary islets, a limiting resource, through use of a 384-well format. Fourth, detrimental experimental variability associated with erratic islet culture quality is overcome through optimization of isolation, dispersion, plating and culture parameters. Fifth, the difficulties of accurately and consistently measuring the low basal replication rate of islet endocrine-cells are surmounted with optimized immunostaining parameters, automated data acquisition and data analysis; automation simultaneously enhances throughput and limits experimenter bias. Notable limitations of this assay are the use of dispersed islet cultures which disrupts islet architecture, the use of rodent rather than human islets and the inherent limitations of throughput and cost associated with the use of primary cells. Importantly, the strategy is easily adapted for human islet replication studies. This assay is well suited for investigating the mitogenic effect of substances on β-cells and the molecular mechanisms that regulate β-cell growth.
Diabetes omvat een verzameling van aandoeningen delen de gemeenschappelijke eindpunt van verstoorde glucose homeostase. Hoewel de pathogene mechanismen van diabetes subtypen worden onderscheiden, delen ze het gevolg van verminderde β-celmassa, bijvoorbeeld, verlies van insulineproductie capaciteit 1,2. Momenteel diabetes behandelingsstrategieën vertrouwen op chronische toediening van exogeen insuline, farmacologische stimulering van insulineproductie of verbetering van de insulinegevoeligheid, en zelden, de transplantatie van pancreaseilandjes of hele alvleesklier 3,4. Helaas, het succes van deze strategieën is van korte duur en / of niet voldoende herhalen de functie van endogene productie van insuline. Ondanks het nut van het ontwikkelen van een werkwijze voor β-celregeneratie te stimuleren, bestaat een dergelijke benadering. Bijgevolg is een belangrijk onderzoek naar diabetes doel is om methoden te ontwikkelen om nieuwe β-cellen te genereren of om endogene β-cell mass 5 uit te breiden </sup>. Hoewel β-celregeneratie uit hernieuwbare bronnen zoals embryonale stamcellen is het bevorderen, veiligheid en efficiëntie betreft maakt het nastreven van alternatieve strategieën, met inbegrip van de uitbreiding van rijpe β-cellen, een prioriteit 6,7. Belangrijk is dat de belangrijkste bron van nieuwe β-cellen in vivo bestaande β-cellen in plaats van gespecialiseerde progenitorcellen 8,9. Hoewel β-cellen blijken beperkte replicatie capaciteit, een kleine toename van β-celmassa hebben (~ 30%) kan voldoende zijn om glucose homeostase te herstellen in vele diabetici. Verder in situ farmacologische stimulering van β-celmassa is een potentieel goedkope en schaalbaar behandelingsstrategie. Hierin a high content werkwijze voor het identificeren en karakteriseren van kleine moleculen die de groei β-cellen stimuleren gepresenteerd.
Verscheidene in vitro experimentele werkwijzen kunnen worden gebruikt om genproducten en / of moleculen tha identificerent bevorderen primaire β-cel-replicatie. Vroege inspanningen voor het meten van β-cel-replicatie inductie gebruikt foetale knaagdier alvleesklieren cultuur of intacte geïsoleerde eilandje culturen te meten [3 H] thymidine, BrdU incorporatie of mitotische instanties binnen de aldehyde-thionine of insuline gebeitst bevolking in reactie op de specifieke behandeling voorwaarden 10, 11. Deze in vitro benaderingen en dicht varianten daarvan hebben een aantal beperkingen. Prominente deficiënties omvatten (1) het gebruik van foetale cellen die in tegenstelling tot rijpe β-cellen vertonen een hoge basale β-cel replicatiesnelheid en zijn groei gereguleerd een onderscheidende wijze 12; (2) de persoonlijke aard van de experimentator-afhankelijke berechting van β-cel-replicatie gebeurtenissen; (3) de arbeids- en tijdrovende karakter van de experimentator-afhankelijke tellen van β-cel-replicatie gebeurtenissen vertraagt experimentele throughput; (4) het gebruik van nucleaire inbouw / vlek / verschijning aan replicatie zelfs te identificerents en een niet-overlappende cytoplasmatische vlek β-cellen te identificeren leidt tot onterechte opname van nabij non-β-cel replicatiegebeurtenissen aan P-cellen.
Recenter rijpe primaire β-cellen werden gebruikt om het effect van transgene overexpressie alsmede genproduct of samengestelde behandeling op β-celdeling 13-16 beoordelen. Echter, deze studies ook ingeroepen subjectief tellen van replicatie gebeurtenissen, cytoplasma staining- of niet-specifieke methoden voor β-cell identificatie en / of arbeidsintensieve stappen die throughput te beperken, bijvoorbeeld afzonderlijke dia-en beplating van cellen of intacte eilandje paraffine inbedding en 17 verwerking. Met name, een beeld-gebaseerde humane β-celdeling screening methode, vergelijkbaar met de hierin gepresenteerde, is gepubliceerd 18; echter succesvol gebruik van deze assay niet aangetoond en het gebruik van menselijke eilandjes voor primaire screening niet ruim worden fealijk.
Een alternatieve strategie voor het identificeren van replicatie-bevorderende stoffen naar groei inductie van β-cellijnen te beoordelen. Initiële inspanningen gebruikt getransformeerde β-cellijnen zoals MIN6 cellen of INS 832/13-cellen 14,19-21. Echter, deze cellijnen demonstreren ongebreidelde groei en dragen weinig gelijkenis met goed gedifferentieerd β-cellen 22. Bijgevolg groei-inductie capaciteit is minimaal, onduidelijke relevantie en soms moeilijk te recapituleren. Een verbeterde strategie cellijn screening maakt gebruik van "reversibel getransformeerde" cellen die groei aangehouden in de afwezigheid van tetracycline (doxycycline) -afhankelijke SV40 T antigen expressie 23,24 zijn. Het is echter onduidelijk of deze cellen terugkeren naar een "normale" β-cel-achtige toestand na verwijdering doxycycline. Helaas, gebruik van deze cellen heeft opgeleverd algemene groeibevorderende stoffen die niet op onmiddellijk nut hebben24. Kortom, het gebruik van cellijnen groeiregulatie van een celtype weergave minimale spontane replicatie -activiteit kan beperkte toepasbaarheid hebben.
De β-cel-replicatie screening platform hierin gepresenteerd maakt gebruik van volwassen primaire rat β-cellen te behouden in vivo groei regelgeving voor zover mogelijk, eilandje-celkweken van gemengde cel-type samenstelling om identificatie van-lijn beperkt groeibevorderende activiteiten mogelijk te maken, multi -goed formatteren om de doorvoer en geautomatiseerde analyse te maximaliseren om vertekening te elimineren en de doorvoer te vergemakkelijken. Succesvol gebruik van dit platform is de identificatie van een aantal verbindingen die β-celdeling 25,26 bevorderen ingeschakeld. Daarnaast is de test is gebruikt voor de structuur-activiteit relatie studies en chemische epistasie experimenten om mechanistische inzichten in de moleculaire regulatie van β-cel-replicatie bieden. De gepresenteerde platform is met succes aangepast for lentivirale RNAi-based onderzoek naar β-celdeling trajecten 25. Beperkingen van de test omvatten geblokkeerde schaalbaarheid (gebruik van primaire cellen), gebruik van knaagdier plaats menselijke eilandjes-cellen (hoewel de test kan worden aangepast voor menselijk eilandje studies), kosten in verband met antilichamen gebaseerde beeldvorming en primaire eilandje gebruik, het gebruik van verspreide eilandjes (verstoord eilandje architectuur) om geautomatiseerde image Acquisition en de afhankelijkheid van de beschikbaarheid van een geautomatiseerde microscoop met het verwerven en analyseren vermogen vergemakkelijken. Hoewel een gemakkelijke in vivo screening methode voor het identificeren van genproducten of verbindingen die β-cel regeneratie in situ te stimuleren zou ideaal zijn, zoals een platform is nog niet beschikbaar 27. Bijgevolg is de beschreven platform is geschikt voor onderzoeker geïnteresseerd in het onderzoeken van de meeste aspecten van β-cel-replicatie.
Experimentele methoden voor het bestuderen van de moleculaire pathways dat de groei van β-cel en regeneratie onder controle zijn belangrijke hulpmiddelen voor diabetes onderzoekers. Hierin, een rat-eilandje-based screening platform voor het identificeren en karakteriseren van kleine moleculen stimulatoren van β-cel-replicatie wordt gepresenteerd.
Terwijl de meeste aspecten van dit protocol gemakkelijk worden uitgevoerd door ervaren onderzoekers, een paar stappen vereisen bijzondere technie…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by NIDDK grants DK098143 and DK101530 from the NIH (JPA), Stanford’s Spectrum Child Health Research Institute (CHRI) and SPARK (UL1 TR001085, JPA).
250g male Male Sprague Dawly Rat | Charles River | Stain # 400 | |
12 cm teeth tisuue forceps | Fine Science Tools | 11021-12 | |
11.5 cm fine scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | |
14.5 cm surgical scissors | Fine Science Tools | 14001-14 | |
16 cm curved forceps | Fine Science Tools | 11003-16 | |
12 cm curved hepostat | Fine Science Tools | 13011-12 | |
12 cm scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
Tissue sieve-30 mesh | Bellco Glass | 1985-85000 | |
Cizyme RI, 375,000 CDA units | VitaCyte | 005-1030 | |
Hanks' Balanced Salt solution (Ca++ and Mg++) | Gibco | 24020-117 | |
Ketamine HCl (200 mg/20 ml) | JHP Pharmaceuticals | NDC# 42023-113-10 | to make anesthetic cocktail |
Xylazine (5 g/50 ml) | LLOYD | NADA# 139-236 | to make anesthetic cocktail |
Histopaque 1077 | Sigma | H-1077 | to make histopaque 1100 |
Histopaque 1119 | Sigma | H-1119 | to make histopaque 1100 |
Newborn Calf Serum 500 ml | Hyclone | SH30118.03 | |
Hanks' Balanced Salt solution | Hyclone | SH30268.01 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Low Glucose | Hyclone | SH30021.01 | |
Functionality/Viability Solution | Mediatech | 99-768-CV | |
RPMI1640 media | Hyclone | SH30096.01 | to make conditioned medium |
804G rat bladder carcinoma cell-line | Available upon request | to make conditioned medium | |
Fetal Bovine Serum, Qualified | Gibco | 26160 | |
GlutaMax-I | Gibco | 35050-061 | |
Penicillin (5,000 IU/ml/Strptomycin (5 mg/ml) | MP Biomedicals | 1670049 | |
Formamide 500 mL | Fisher BioReagents | BP227-500 | |
Antigen Unmasking Solution 250 mL (PH 6.0) | Vector Laboratories | H-3300 | to make 0.15 M Sodium Sitrate solution |
Dextrose, Anhydrous | EMD Chemicals | DX0145-1 | to make 1 M glucose solution |
Nomal Donkey Serum (Powder) | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
Triton X-100 | Sigma | T8787-100ML | |
Mouse anti-human Ki67 antibody | BD Biosciences | 556003 | |
Goat anti-human PDX-1 antibody | R&D Systems | AF2419 | |
Polyclonal Guinea Pig anti-insulin antibody | Dako | 2016-08 | |
Polyclonal Rabbit anti-glucagon antibody | Dako | 2014-06 | |
Polyclonal Rabbit anti-somatostatin antibody | Dako | 2011-08 | |
Polyclonal chicken anti-vimentin antibody | abcam | ab24525 | |
Biotin-SP-conjugated, Donkey Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 715-065-150 | |
StreptAvidin, Alex Flour 488 conjugated | Invitrogen | S32354 | |
Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Goat IgG | Jackson ImmunoResearch | 705-025-147 | |
Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Guinea Pig IgG | Jackson ImmunoResearch | 706-025-148 | |
Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 711-025-152 | |
Cy 5-conjugated Donkey Anti-Guinea Pig IgG | Jackson ImmunoResearch | 706-175-148 | |
Cy 5-conjugated Donkey Anti-Goat IgG | Jackson ImmunoResearch | 705-175-147 | |
Cy 5-conjugated Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 711-175-152 | |
Cy 5-conjugated Donkey Anti-Chicken IgG | Jackson ImmunoResearch | 703-175-155 | |
DAPI | Millipore | S7113 | |
Disposable Reagent Reservoir 25 mL | Sorenson BioScience | 39900 | |
384 well, black/clear, tissue culture treated plate | BD Falcon | 353962 | |
96 well, black/clear, tissue culture treated plate | Costar | 3603 | |
Multi-channel pipettor | Costar | 4880 | |
12-channel vaccume aspirator | Drummond | 3-000-096 | |
Cell Scraper | Falcon | 353085 | |
Isotemp Water Bath Model 2223 | Fisher Scientific | ||
High-content screening instrument: ArrayScan VTI | Thermo Scientific |