Summary

Microfluïdische Buffer Exchange voor Interference-free Micro / nanodeeltjes Cel engineering

Published: July 10, 2016
doi:

Summary

Dit protocol beschrijft het gebruik van een inertiale-microfluidics gebaseerde buffer wisselkoersstrategie micro / nanodeeltjes gemanipuleerde cellen te zuiveren efficiënte uitputting van ongebonden deeltjes.

Abstract

Techniek cellen met actieve bestanddeel-loaded micro / nanodeeltjes (NP) wordt een steeds populaire methode om native therapeutische eigenschappen te verbeteren, in staat bio beeldvorming en controle cel fenotype. Een kritische nog onvoldoende gericht probleem is het grote aantal deeltjes die gebonden na labeling cel die niet gemakkelijk kan worden verwijderd met gebruikelijke centrifugatie blijven. Dit leidt tot een toename van bio imaging achtergrondruis en kan transformerende effecten op aangrenzende niet-doelwitcellen geven. In dit protocol, presenteren we een inertie-microfluidics gebaseerde buffer uitwisseling strategie genoemd als Dean Flow fractionering (DFF) naar gelabelde cellen uit vrije NP's in een high throughput wijze efficiënt te scheiden. De ontwikkelde spiraal microdevice vergemakkelijkt collecteren (> 90% celherstel) van gezuiverde cellen (THP-1 en MSC's) gesuspendeerd in nieuw bufferoplossing, terwijl het bereiken van> 95% afname van ongebonden fluorescerende kleurstof of kleurstof-geladen NP (silica of PLGA). Deze enkele-stap-afmeting gebaseerd cell zuiveringsstrategie maakt hoge verwerkingssnelheid cel (10 6 cellen / min) en is zeer bruikbaar voor grote celvolume zuivering van micro / nanodeeltjes gemanipuleerde cellen storingsvrije klinische toepassing te bereiken.

Introduction

Engineering-cellen door middel beladen micro / nanodeeltjes (NP) is een eenvoudige genomische integratie-vrij en veelzijdige methode Bio-imaging vermogen verbeteren en versterken / aanvullen zijn natieve therapeutische eigenschappen regeneratieve geneeskunde. 1-3 cellulaire veranderingen worden bereikt door het merken van de plasmamembraan of cytoplasma met een sterke concentratie van de agent geladen NP's aan de bindingsplaatsen te verzadigen. Echter, een belangrijk nadeel van deze werkwijze is de grote hoeveelheid ongebonden deeltjes achterblijft in oplossing na cel keurmerkprocessen, die mogelijk nauwkeurige identificatie van deeltjes gemanipuleerde cellen kunnen verwarren of compliceren therapeutische resultaten. 4,5 Bovendien blootstelling aan NPs met transformerende middelen (groeifactoren, corticosteroïden, enz.) bij te hoge concentratie kan cytotoxiciteit en verkeerd gerichte blootstelling kan onbedoelde gevolgen op non-target cellen te induceren. Zelfs deeltjesvormige dragers omvattende of "biocompatibel" stoffen [bijvoorbeeld poly (melkzuur co-glycolzuur), PLGA] kan aanzetten potente immune cel responsen onder bepaalde omstandigheden ook. 6 Dit vooral gevaarlijk bij personen met een aangetast immuunsysteem (bijvoorbeeld reumatoïde artritis) die mogelijk vertragingen systemische klaring nanodeeltjes. 7 Aldus efficiënte verwijdering van vrije deeltjes vóór de invoering van deeltjes gemanipuleerde cellen is van groot belang voor toxiciteitsprofiel minimum te beperken en verkeerd blootstelling aan stof geladen deeltjes in vivo.

Conventionele gradiënt centrifugatie wordt vaak gebruikt om gemanipuleerde cellen te scheiden van vrije deeltjes maar omslachtig en gebruikt in batch mode. Bovendien schuifspanning ervaren door cellen bij hoge snelheid centrifugatie en de bestanddelen van de dichtheidsgradiënt medium kan celintegriteit en / of invloed celgedrag beschadigen. 8 Microfluidics is een aantrekkelijk alternatief met sevrale scheiding technologieën, waaronder deterministische laterale verplaatsing (DLD) 9, dieletrophoresis 10,11 en acoustophoresis 12 ontwikkeld voor kleine deeltjes scheiding en buffer uitwisseling toepassingen. Echter, deze methoden lijden aan lage omzet (1-10 pl · min 1) en zijn gevoelig voor verstopping problemen. Actieve scheidingen zoals dielectrophoresis-gebaseerde werkwijzen vereisen ook verschillen in intrinsieke diëlektroforetische celfenotypen of extra cel labeling stappen om scheiding te bereiken. Een veelbelovende benadering omvat inertie microfluïdische – de zijdelingse migratie van deeltjes of cellen in stroomlijnt richten op verschillende posities vanwege overheersende opwaartse krachten (F l) hoog Reynoldsgetal (Re) 13 Door de hoge stromingsomstandigheden en superieure maat resolutie. Het is vaak geëxploiteerd voor-afmeting gebaseerd celscheiding 14,15 en buffer uitwisseling toepassingen. 16-18 However, prestaties bufferuitwisseling blijft slecht met ~10-30% verontreiniging oplossing de afgescheiden cellen meestal dicht bij de grens tussen oorspronkelijke en nieuwe bufferoplossingen blijven. 16-18 Belangrijker is dat de grootteverdeling van doelcellen heeft vergelijkbare bereiken zijn nauwkeurige focussering en inertiale scheiding van de oorspronkelijke bufferoplossing die een probleem stelt met name bij de verwerking van heterogene afmetingen celtypes zoals mesenchymale stamcellen (MSCs). 19

We hebben eerder ontwikkelde een nieuwe inertie microfluidics celsortering techniek genaamd Dean Flow fractionering (DFF) voor het isoleren van circulerende tumorcellen (CTC's) 20 en bacteriën 21 uit vol bloed met behulp van een 2-inlaat, 2-outlet spiraal microkanaal apparaat. In deze video protocol, zullen we het proces van etikettering THP-1 (humane acute monocytische leukemie cellijn) surséance monocytische cellen (~ 15 pm) en MSC (10-30 pm) met calceïne-l beschrijvenoaded NP, gevolgd door fabricage en werking van de spiraalvormige DFF microdevice efficiënte terugwinning van gemerkte cellen en verwijdering van ongebonden NPs. 22 Deze stap zuiveringsstrategie maakt continue terugwinning van gelabelde suspensie en hechtende cellen gesuspendeerd in verse buffer oplossing zonder centrifugeren. Bovendien kan het tot verwerken tot 10 miljoen cellen · ml -1, een celdichtheid vatbaar regeneratieve geneeskunde toepassingen.

Protocol

1. nanodeeltjes (NP) Labeling van mesenchymale stamcellen en monocyten Cultuur mesenchymale stamcellen (MSCs) in Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en antibiotica ≥80% confluentie voorafgaand aan etikettering. Evenzo cultuur THP-1-cellen (ATCC) in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium aangevuld met 10% FBS tot een dichtheid van ~ 10 6 cellen / ml. Load silica NP (~ 500 pm) met calceïne kleurstof-oplossing (200…

Representative Results

Na het labelen van de cellen met bio-imaging agens geladen NP nachts, worden de gelabelde cellen (met vrije deeltjes) geoogst en gezuiverd door DFF spiraalvormige microdevice gratis NP verwijderen in een enkele stap proces (Figuur 1A). De 2-inlaat, 2-outlet spiraal microkanalenplaat is ontworpen door engineering software en microfabricated gebruik van SU-8. De gestructureerde siliciumwafel wordt vervolgens gebruikt als een matrijs voor PDMS replica vormen met behulp van …

Discussion

De DFF cel zuiveringstechnologie hierin beschreven maakt een snelle en voortdurende scheiding van gelabelde cellen in een high throughput manier. Deze scheiding benadering is ideaal voor grote monstervolume of hoge celconcentratie monster verwerking, en beter dan conventionele een membraan filtratie die gevoelig zijn voor verstopping na langdurig gebruik. Evenzo affiniteit gebaseerde magnetische scheiding vereist extra cel labeling stappen die omslachtig en duur zijn. De gezuiverde cellen is aangetoond dat het etiket ag…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Kind gift of THP-1 cells from Dr. Mark Chong and assistance in microfabrication from Dr. Yuejun Kang and Dr. Nishanth V. Menon (School of Chemical and Biomedical Engineering, Nanyang Technological University) were greatly acknowledged. This project was funded by NTU-Northwestern Institute of Nanomedicine (Nanyang Technological University). H.W.H. was supported by Lee Kong Chian School of Medicine (LKCMedicine) postdoctoral fellowship.

Materials

Cell lines & Media
Mesenchymal Stem Cells (MSCs) Lonza PT-2501
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Lonza 12-614F
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 10270-106
THP-1 monocyte cells (THP-1) ATCC TIB-202
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 media Lonza 12-702F
Name Company Catalog Number Comments/Description
Reagents & Materials
0.01% poly-L-lysine (PLL) Sigma-Aldrich P8920
3 mL Syringe BD 302113 Syringe 3ml Luer-Lock
60 ml Syringe BD 309653 Syringe 60ml Luer-Lock
Bovine Serum Albumin (BSA) Biowest P6154-100GR
Calcein, AM (CAM) Life Technologies C1430
Calcein Sigma-Aldrich C0875
Isopropanol Fisher Chemical #P/7507/17 HPLC Grade 2.5 L
Phosphate-Buffered Saline (PBS) Lonza 17-516Q/12
Plain Microscope Slides Fisher Scientific FIS#12-550D 75 X 25 X 1 mm
Polydimethylsiloxane (PDMS) Dow Corning SYLGARD® 184
Scotch tape 3M 21200702044 18mm x 25m
Silica NPs (∼200 μm) Sigma-Aldrich 748161 Pore size 4 nm
Syringe Tip JEC Technology 7018302 23GA .013 X .25
Trypsin-EDTA (0.25%) Life Technologies 25200-056
Tygon Tubing Spectra-Teknik 06419-01 .02X.06" 100
Name Company Catalog Number Comments/Description
Equipment
Biopsy punch Harris Uni-Core 69036-15 1.50 mm
Dessicator Scienceware 111/4 IN OD
High-speed Camera Phantom  V9.1
Inverted phase-contrast microscope  Nikon Eclipse Ti
Plasma cleaner Harrick Plasma PDC-002
Syringe Pump Chemyx CX Fusion 200

References

  1. Wiraja, C., et al. Aptamer technology for tracking cells’ status & function. Mol. Cell. Ther. 2, 33 (2014).
  2. Yeo, D. C., Wiraja, C., Mantalaris, A., Xu, C. Nanosensors for Regenerative Medicine. J. Biomed. Nanotech. 10, 2722-2746 (2014).
  3. Naumova, A. V., Modo, M., Moore, A., Murry, C. E., Frank, J. A. Clinical imaging in regenerative medicine. Nat. Biotechnol. 32, 804-818 (2014).
  4. Soenen, S. J., et al. Cellular toxicity of inorganic nanoparticles: Common aspects and guidelines for improved nanotoxicity evaluation. Nano Today. 6, 446-465 (2011).
  5. Donaldson, K., Poland, C. A. Nanotoxicity: challenging the myth of nano-specific toxicity. Curr. Opin. Biotechnol. 24, 724-734 (2013).
  6. Veiseh, O., et al. Size- and shape-dependent foreign body immune response to materials implanted in rodents and non-human primates. Nat. Mater. 14, 643-651 (2015).
  7. Jones, S. W., et al. Nanoparticle clearance is governed by Th1/Th2 immunity and strain background. J. Clin. Invest. 123, 3061-3073 (2013).
  8. Marchi, L. F., Sesti-Costa, R., Chedraoui-Silva, S., Mantovani, B. Comparison of four methods for the isolation of murine blood neutrophils with respect to the release of reactive oxygen and nitrogen species and the expression of immunological receptors. Comp. Clin. Pathol. 23, 1469-1476 (2014).
  9. Morton, K. J., et al. Hydrodynamic metamaterials: Microfabricated arrays to steer, refract, and focus streams of biomaterials. Proc. Natl. Acad. of Sci USA. 105, 7434-7438 (2008).
  10. Hu, X., et al. Marker-specific sorting of rare cells using dielectrophoresis. Proc. Natl. Acad. of Sci USA. 102, 15757-15761 (2005).
  11. Cummings, E. B. Streaming dielectrophoresis for continuous-flow microfluidic devices. IEEE Eng. Med. Biol. Mag. 22, 75-84 (2003).
  12. Augustsson, P., Persson, J., Ekstrom, S., Ohlin, M., Laurell, T. Decomplexing biofluids using microchip based acoustophoresis. Lab Chip. 9, 810-818 (2009).
  13. Di Carlo, D., Irimia, D., Tompkins, R. G., Toner, M. Continuous inertial focusing, ordering, and separation of particles in microchannels. Proc. Natl. Acad. of Sci USA. 104, 18892-18897 (2007).
  14. Hur, S. C., Henderson-MacLennan, N. K., McCabe, E. R. B., Di Carlo, D. Deformability-based cell classification and enrichment using inertial microfluidics. Lab Chip. 11, 912-920 (2011).
  15. Mach, A. J., Di Carlo, D. Continuous scalable blood filtration device using inertial microfluidics. Biotechnol. Bioengin. 107, 302-311 (2010).
  16. Gossett, D. R., et al. Inertial manipulation and transfer of microparticles across laminar fluid streams. Small. 8, 2757-2764 (2012).
  17. Amini, H., et al. Engineering fluid flow using sequenced microstructures. Nat. Commun. 4, 1826 (2013).
  18. Sollier, E., et al. Inertial microfluidic programming of microparticle-laden flows for solution transfer around cells and particles. Microfluid. Nanofluid. 19, 53-65 (2015).
  19. Lee, W. C., et al. Multivariate biophysical markers predictive of mesenchymal stromal cell multipotency. Proc. Natl. Acad. of Sci USA. 111, E4409-E4418 (2014).
  20. Hou, H. W., et al. Isolation and retrieval of circulating tumor cells using centrifugal forces. Sci. Rep. 3, 1259 (2013).
  21. Hou, H. W., Bhattacharyya, R. P., Hung, D. T., Han, J. Direct detection and drug-resistance profiling of bacteremias using inertial microfluidics. Lab Chip. 15, 2297-2307 (2015).
  22. Yeo, D. C., et al. Interference-free Micro/nanoparticle Cell Engineering by Use of High-Throughput Microfluidic Separation. ACS Appl. Mater. Inter. 7, 20855-20864 (2015).
  23. Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft Lithography. Angew. Chem. Int. Edit. 37, 550-575 (1998).
  24. Lee, W. C., et al. High-throughput cell cycle synchronization using inertial forces in spiral microchannels. Lab Chip. 11, 1359-1367 (2011).
  25. Kuntaegowdanahalli, S. S., Bhagat, A. A., Kumar, G., Papautsky, I. Inertial microfluidics for continuous particle separation in spiral microchannels. Lab Chip. 9, 2973-2980 (2009).

Play Video

Cite This Article
Tay, H. M., Yeo, D. C., Wiraja, C., Xu, C., Hou, H. W. Microfluidic Buffer Exchange for Interference-free Micro/Nanoparticle Cell Engineering. J. Vis. Exp. (113), e54327, doi:10.3791/54327 (2016).

View Video