We adapted a permeable microporous membrane insert to mimic the tumor microenvironment (TME). The model consists of a mixed cell culture, allows simplified generation of highly enriched individual cell populations without using fluorescent tagging or cell sorting, and permits studying intercellular communication within the TME under normal or stress conditions.
Att förstå de tidiga hetero samspelet mellan cancerceller och den omgivande godartade stroma är viktigt att belysa de händelser som ledde till stromal aktivering och etablering av tumören mikro (TME). Flera in vitro och in vivo-modeller av TME har utvecklats; men i allmänhet är dessa modeller inte lätt tillåter isolering av enskilda cellpopulationer, under icke-störande förhållanden, för vidare studier. För att kringgå denna svårighet, har vi använt ett in vitro-TME modell med användning av en celltillväxtsubstrat bestående av ett permeabelt mikroporöst membran insert som medger enkel generering av höggradigt anrikade cellpopulationer odlas intimt, men separat, på vardera sidan av insatsen membran för utökad co -kultur gånger. Genom användning av denna modell, vi kan generera berikat cancer-associerade fibroblaster (CAF) populationer från normala diploida humana fibroblaster eftersamodling (120 h) med mycket metastatiska humana bröstkarcinomceller, utan användning av fluorescerande märkning och / eller cellsortering. Dessutom, genom att modulera porstorlek av insatsen, kan vi kontrollera för läget för kommunikationen mellan (t.ex. gap-junction kommunikation, utsöndrade faktorer) mellan de två heterocellpopulationer, som medger undersökning av mekanismerna bakom utvecklingen av TME även betydelsen av gap-junction permeabilitet. Denna modell fungerar som ett värdefullt verktyg för att öka vår förståelse av de inledande händelser som leder till cancer-stroma initiering, den tidiga utvecklingen av TME och modulerande effekten av stroma på svaren från cancerceller till terapeutiska medel.
Tumören mikro (TME) är ett mycket komplext system bestående av cancerceller som samexistera och utvecklas tillsammans med värd stroma. Detta stromal komponent består typiskt av fibroblaster, myofibroblaster, endotelceller, olika immun komponenter, samt en extracellulärmatrix en. En betydande beståndsdel, ofta majoriteten av stroma, aktiveras fibroblaster, ofta kallad cancerassocierade fibroblaster eller karcinom-associerade fibroblaster (CAF) 2,3. Till skillnad från normala, icke-aktiverade fibroblaster, CAFS bidra till tumör initiering, progression, angiogenes, invasion, metastas, och återkommande 4-11 i en mängd olika karcinom, inklusive bröst, prostata, lunga, pankreas, hud, kolon, matstrupe, och äggstock 5,6,12-17. Men den exakta naturen av bidraget från CAFS hela cancer patogenes förblir dåligt definierad. Dessutom har kliniska bevis visat ett prognostiskt värde av CAFS, Korrelera sin närvaro till höggradig maligniteter, terapisvikt, och övergripande dålig prognos 10,18,19.
Tydligt, öka vår förståelse av de inledande händelser i CAF utveckling, liksom de inter kommunikation som förmedlar sin roll inom TME, kan ge spännande nya terapeutiska mål och förbättrade strategier som skulle kunna förbättra behandlingsresultat. Mot detta mål, flera in vivo och in vitro-modeller har utvecklats. Medan in vivo metoder är mer reflekterande av patienternas TME, de har begränsningar, bland annat den enorma komplexitet och heterogenitet både inom och mellan tumörer. Dessutom tumörprover från försökspersoner ofta representerar högt utvecklade TME och inte tillåter en förståelse för TME initierande händelser. Experimentella djurstudier har vissa fördelar, men generalisering av djurdata till människor bör göras med försiktighet på grund av skillnader i physiology mellan människa och djur, såsom gnagare (t ex, tiol kemi 20, ämnesomsättning 21, tolerans att betona 22, etc.). Vidare, till skillnad från den mänskliga befolkningen, som är genetiskt heterogen till sin natur, laboratoriedjur vanligtvis föds till homogenitet. Dessutom är det ofta svårt att undersöka transienta fysiologiska variationer och cellfenotyp förändringar, liksom att kontrollera för specifika experimentella parametrar som använder djur som gnagare. Således, in vitro 2- och 3-dimensionella (2D och 3D) vävnadsodlingsmodeller ofta utnyttjas för att främja grundläggande förståelse för TME utveckling. Trots sin brist på en rättvisande bild av komplexiteten i in vivo-system, dessa modeller erbjuder fördelar som kraftigt underlättar mekanistiska undersökningar. In vitro-modeller möjliggör en enklare, fokuserad och kostnadseffektiv analys av TME, varvid statistiskt signifikant data som kan genereras iceller fria från systemvariationer som uppstår i djur.
Det finns flera varianter av in vitro-system. De två vanligaste TME in vitro-modeller består av blandade enkelskikt eller sfäroida cellkulturer. Båda odlingsmetoder är fördelaktiga för grundläggande studier av intercellulära interaktioner (t.ex. normala celler med tumörceller) och för analys av olika TME specifika förändringar cell fenotyp (t.ex. uppkomsten av cancerassocierade fibroblaster från normala fibroblaster). Dessutom sfäroiderna kan skapa en mer reflekterande vävnadsliknande struktur av TME, och kan vara representativa för tumör heterogenitet 23. Men sfäroider producerar ofta mycket varierande syrespännings gradienter över lager, vilket kan komplicera experimentella slutsatser 24. Tyvärr är båda modellerna ytterst begränsade i sin förmåga att isolera rena cellpopulationer för ytterligare karakterisering och studie efter samarbetekultur. Att göra så skulle kräva åtminstone en celltyp att vara fluorescerande-taggade eller märkta med ett identifierande maker, och sedan utsätta den blandade sam-kultur till omfattande bearbetning och cellsortering för att separera cellpopulationer. Medan en cellsorterare är i stånd att isolera en ganska ren cellpopulation, måste man vara medveten om cellulär stress och eventuella mikrobiella kontamineringsrisker 25.
För att underlätta förståelsen av intercellulär kommunikation, har stora ansträngningar ägnats åt att utveckla och optimera in vitro-system som nära efterliknar in vivo miljö, medan den tillåter en förenklad metod. Ett sådant verktyg är det genomsläppliga mikro insatsen, en membransubstrat som först utvecklades 1953 26 och därefter anpassas för olika tillämpningar och studier (t.ex. cell polaritet 27 endocytos 28 läkemedelstransport 29, vävnadsmodellering 30, FERTsering 31, kringstående effekten 32,33, etc.). Detta system gör det möjligt att tillväxten av celler med in vivo-liknande anatomisk och funktionell differentiering, liksom uttryck av många in vivo markörer 34,35 som inte observeras när de odlas på ett ogenomträngligt plasten. Dessutom extremt tunna porösa membran (10 ^ m tjock) tillåter snabb diffusion av molekyler och jämviktstider, som simulerar in vivo miljö och tillåter oberoende cellulär funktion på både de apikala och basolaterala cell domäner. En ytterligare fördel med insatsens användbarhet som ett TME system är dess fysikalisk separation av två heterotypiska cellpopulationer som odlats på vardera sidan av membranet i samma miljöförhållanden, under upprätthållande av olika former av intercellulär kommunikation genom membranporerna. Men fysiskt separerade, är de två cellpopulationer metaboliskt kopplad via utsöndrade element och, såsom debeskrivs här, också genom gap-Junktional kanaler. Dessutom, genom att upprätthålla skären vid in vivo partiell syrespänning (PO 2), reducerar modellen komplikationerna av syre- och kemiska gradienter som observerats i andra system. Snarare ökar förståelsen för naturliga mekanismer som styr TME. Särskilt kan de två cellpopulationer enkelt isoleras med hög renhet, utan fluorescerande märkning och / eller cellsortering efter längre perioder av samodling.
Här beskriver vi en in vitro-TME-protokollet består av human bröstkarcinomceller och humana fibroblaster odlas, respektive, på ömse sidor om ett permeabelt mikroporöst membran insatsen, men ändå i en kontinuerlig dubbelriktad kommunikation genom membranporerna. Vi visar att genom att använda membran med olika porstorlekar, bidraget från en viss typ av kommunikationen mellan (t.ex. utsöndrade faktorer kontra gap junctions) till utvecklingav TME kan undersökas.
Protokollet som beskrivs här är en enkel, anpassningsbar in vitro förfarande (figur 1) som utnyttjar ett genomträngligt mikroporöst membran insatsen generera höganrikat individuella cellpopulationer från en samodling av hetero celler. Betecknande nog är modellen lämpar sig för att undersöka olika typer av intercellulär kommunikation. De kritiska stegen inkluderar att välja den lämpliga porstorlek insatsen för specifik experimentell intresse (s), sådd den första cellpopulationen…
The authors have nothing to disclose.
This research was supported by grants from the New Jersey Commission on Cancer Research (Pre-Doctoral Fellowship DFHS13PPCO17), the National Institutes of Health (CA049062), and the National Aeronautics and Space Administration (NNX15AD62G).
For Cell Culture | |||
AG01522 (i.e., AG1522) human diploid fibroblast | Coriell | 107661 | Passage 8-13 |
MDA-MB-231-luc-D3H1 breast adenocarcinoma cell line | PerkinElmer | 119261 | Parental line: ATCC (#HTB-26) |
MDA-MB-231/GFP breast adenocarcinoma cell line | Cell Biolabs | AKR-201 | |
Eagle's minimal essential medium (MEM) | Corning Cellgro | 15-010-CV | |
Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified | Sigma | F6178-500mL | |
Corning Glutagro Supplement (200mM L-alanyl-L-glutamine) | Corning Cellgro | 25-015-Cl | |
Penicillin Streptomycin Solution, 100X | Corning Cellgro | 30-002-Cl | |
Transwell Insert (i.e., permeable microporous membrane insert) (0.4 μm pore) | Costar | 3450 | |
Transwell Insert (i.e., permeable microporous membrane insert) (1 μm pore) | Greiner bio-one | 657610 | |
Transwell Insert (i.e., permeable microporous membrane insert) (3 μm pore) | Costar | 3452 | |
6-well Culture Plate | Greiner Bio-One Cellstar | 657160-01 | |
75 cm2 cell culture flask | CellStar | 658 170 | |
Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1X | Corning Cellgro | 21-040-CV | without calcium & magnesium |
0.25% (vol/vol) Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1X | Corning Cellgro | 25-053-Cl | |
15 mL Centrifuge Tube | CellTreat | 229411 | |
35 x 10 mm Cell Culture Dish | Greiner bio-one | 627 160 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
For Immunofluorescent Microscopy | |||
Mouse anti-Caveolin 1 | BD Transduction Laboratories | 610406 | In situ Immunofluorescence – 1:5000 |
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher Scientific | A-11029 | In situ Immunofluorescence – 1:2000 |
Bovine Serum Albumin – Fraction V | Rockland | BSA-50 | Immunoglobulin and protease free |
16% (wt/vol) Formaldehyde Solution | ThermoFisher Scientific | 28908 | Dilute to 4% with 1X PBS |
Premium Cover Glass (22×22 mm No.1) | Fisher | 12548B | |
Triton X-100 | Sigma | T8787-50ML | |
SlowFade Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | S36938 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
For Flow Cytometric Analysis | |||
Calcein, AM | Molecular Probes | C3100MP | |
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14025-076 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
For Western Blot Analysis | |||
Mouse anti-Caveolin 1 | BD Transduction Laboratories | 610406 | Western Blot – 1:10000 |
Tween-20 | BioRad | 170-6531 | |
Nitrocellulose Membrane (0.2 μm) | BioRad | 162-0112 | |
Western Lightning Plus-ECL | PerkinElmer | NEL104001EA | |
BioRad DC Protein Assay | BioRad | 500-0116 | |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | BioRad | 161-0302 | |
Sodium deoxycholate monohydrate (DOC) | Sigma | D5670 | |
IGEPAL CA-630 (NP40) | Sigma | I8896 | |
30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1 | BioRad | 161-0158 |