Micropatterning और 3 डी microvessels के विधानसभा
Summary
यह पांडुलिपि microvessels कि endothelium के शारीरिक गुणों पुनरावृत्ति इंजीनियर को एक इंजेक्शन मोल्डिंग विधि प्रस्तुत करता है। microfluidic आधारित प्रक्रिया में इस तरह के प्रवाह, सेलुलर संरचना, ज्यामिति, और जैव रासायनिक ढ़ाल के रूप में tailorable शर्तों के साथ पेटेंट 3 डी संवहनी नेटवर्क बनाता है। निर्माण की प्रक्रिया और संभावित अनुप्रयोगों के उदाहरण वर्णित हैं।
Abstract
इन विट्रो प्लेटफार्मों में अध्ययन करने के लिए endothelial कोशिकाओं और नाड़ी जीव विज्ञान मोटे तौर पर 2 डी endothelial सेल संस्कृति के लिए सीमित कर रहे हैं, बहुलक या कांच आधारित substrates, और हाइड्रोजेल आधारित ट्यूब गठन assays के साथ कक्षों प्रवाह। ये assays, जबकि जानकारीपूर्ण, लुमेन ज्यामिति, उचित बाह्य मैट्रिक्स, और बहु-कोशिकीय निकटता, जो नाड़ी समारोह नियमन करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते पुनरावृत्ति नहीं है। यह पांडुलिपि 100 माइक्रोन के आदेश पर व्यास के साथ इंजीनियर वाहिकाओं उत्पन्न करने के लिए एक इंजेक्शन मोल्डिंग विधि का वर्णन है। Microvessels एक देशी प्रकार मैं हाइड्रोजेल कोलेजन के भीतर एम्बेडेड एक microfluidic चैनल में endothelial कोशिकाओं बोने द्वारा गढ़े हैं। कोलेजन मैट्रिक्स गठन चैनल से पहले के भीतर parenchymal कोशिकाओं को शामिल करके, विशिष्ट ऊतक microenvironments मॉडलिंग की है और अध्ययन किया जा सकता है। hydrodynamic गुण और मीडिया रचना के अतिरिक्त modulations वांछित microenvironment के भीतर जटिल नाड़ी समारोह के नियंत्रण के लिए अनुमति देते हैं।इस मंच परिवाहकीय सेल भर्ती, खून-endothelium बातचीत, प्रवाह प्रतिक्रिया, और ऊतक microvascular बातचीत के अध्ययन के लिए अनुमति देता है। इंजीनियर microvessels एक संवहनी आला के व्यक्तिगत घटकों से प्रभाव को अलग करने की क्षमता प्रदान करते हैं और ठीक दोनों स्वास्थ्य और रोग में नाड़ी जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए अपने रासायनिक, यांत्रिक, और जैविक गुणों नियंत्रित करते हैं।
Introduction
प्रत्येक अंग में microvasculature ऊतक microenvironment को परिभाषित है, ऊतक homeostasis को बनाए रखने और सूजन, पारगम्यता, घनास्त्रता, और फाइब्रिनोलयन 1,2 विनियमित मदद करता है। 5 – माईक्रवैस्कुलर endothelium, विशेष रूप से, रक्त प्रवाह और आसपास के ऊतकों और इसलिए बीच इंटरफेस ऐसे hydrodynamic बलों और घूम साइटोकिन्स और हार्मोन 3 के रूप में उत्तेजनाओं के जवाब में संवहनी और अंग समारोह नियमन करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। endothelium, रक्त के बीच विस्तृत बातचीत को समझने, और आसपास के ऊतक microenvironment संवहनी जीव विज्ञान और रोग प्रगति के अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण है। हालांकि, इन मुलाकातों के अध्ययन में प्रगति के द्वारा इन विट्रो उपकरण है कि इन विवो microvascular संरचना में पुनरावृत्ति नहीं है और 6.7 से काम में सीमित रुकावट किया गया है। नतीजतन, क्षेत्र और चिकित्सीय उन्नति महंगा है और समय पर भारी भरोसा हैलेने वाली पशु मॉडल है कि अक्सर मनुष्य 8 में सफलता के लिए अनुवाद करने के लिए असफल – 10। जबकि इन विवो मॉडल रोग तंत्र और नाड़ी कार्यों के अध्ययन में अमूल्य हैं, वे जटिल होते हैं और अक्सर biophysical संकेतों व्यक्तिगत सेलुलर, जैव रासायनिक के सटीक नियंत्रण, और की कमी है।
पूरे शरीर में Vasculature अनुकूलित छिड़काव और पोषक तत्व परिवहन एक साथ 11 उपलब्ध कराने, विशाल केशिका बेड के साथ संयोजन के रूप में एक परिपक्व सौपानिक संरचना के पास। प्रारंभ में, एक आदिम जाल जो प्रारंभिक विकास 12,13 के दौरान एक पदानुक्रम branched नेटवर्क से reorganizes के रूप में वाहिका रूपों। हालांकि इन प्रक्रियाओं में शामिल संकेतों से कई अच्छी तरह से समझ रहे हैं 14 – 16 है, यह मायावी बनी हुई है कि कैसे इस तरह के संवहनी patterning चुना गया है 15। बदले में, इन विट्रो में इस प्रक्रिया recapitulating इंजीनियर को संगठित संवहनी नेटवर्क मधुमक्खी हैn मुश्किल है। कई मौजूदा इन विट्रो प्लेटफार्मों वाहिका मॉडल करने के लिए, इस तरह के दो आयामी endothelial सेल संस्कृतियों के रूप में, इस तरह के बहु-कोशिकीय निकटता, तीन आयामी ल्यूमिनल ज्यामिति, प्रवाह, और बाह्य मैट्रिक्स के रूप में महत्वपूर्ण विशेषताओं की कमी है। ट्यूब 3 डी हाइड्रोजेल में गठन assays (कोलेजन या आतंच) 17 – 19 या आक्रमण assays 20,21 अन्य संवहनी 17,22 या ऊतक प्रकार की कोशिकाओं 23 के साथ 3 डी और उनकी बातचीत में endothelial समारोह का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। हालांकि, इकट्ठे इन assays में lumens इंटरकनेक्टिविटी, रक्तसंचारप्रकरण प्रवाह, और उचित छिड़काव की कमी है। इसके अलावा, इन ट्यूब गठन assays के 24 में संवहनी प्रतिगमन के लिए प्रवृत्ति लंबे समय तक संस्कृति और परिपक्वता जो कार्यात्मक अध्ययन है कि प्रदर्शन किया जा सकता है की डिग्री की सीमा से बचाता है। इस प्रकार, वहाँ एक तेजी से बढ़ते इंजीनियर को microvascular नेटवर्क है कि उचित मॉडल कर सकते हैं एन के इन विट्रो प्लेटफार्मों की जरूरत हैविशेषताओं dothelial और लंबी अवधि संस्कृति में सक्षम हैं।
संवहनी इंजीनियरिंग तकनीक की एक किस्म चिकित्सा अनुप्रयोगों को बदलने के लिए या रोग के साथ रोगियों में बाईपास प्रभावित जहाजों के लिए पिछले कुछ वर्षों में उभरा है। बड़े व्यास वाहिकाओं ऐसे पॉलीथीन terephthalate (पीईटी), और polytetrafluoroethylene (ePTFE) के रूप में सिंथेटिक सामग्री से बनाया दीर्घकालिक प्रत्यक्षता (औसत 95% प्रत्यक्षता पर 5 साल), 25 के साथ काफी चिकित्सीय सफलता मिली है। हालांकि छोटे व्यास सिंथेटिक ग्राफ्ट (<6 मिमी) आम तौर पर इस तरह के intimal हाइपरप्लासिया और thrombopoiesis 26 के रूप में जटिलताओं का सामना – 28, ऊतक छोटे व्यास जैविक सामग्री के साथ किया ग्राफ्ट इंजीनियर महत्वपूर्ण प्रगति 29,30 बना दिया है। इस तरह की प्रगति के बावजूद, microscale पर इंजीनियर वाहिकाओं एक चुनौती बनी हुई है। पर्याप्त रूप से microvasculature मॉडल के लिए, यह SUF साथ जटिल नेटवर्क पैटर्न उत्पन्न करने के लिए आवश्यक हैficient यांत्रिक शक्ति प्रत्यक्षता और एक मैट्रिक्स संरचना है कि parenchymal कोशिकाओं और सेलुलर remodeling के लिए दोनों पोषक तत्व पारगमन के लिए अनुमति देता है के साथ बनाए रखने के लिए।
34 – इस प्रोटोकॉल एक उपन्यास कृत्रिम perfusable पोत नेटवर्क है कि एक ट्यून करने योग्य और चलाया microenvironment 31 के साथ सेटिंग विवो में एक देशी mimics प्रस्तुत करता है। वर्णित विधि 100 माइक्रोन के आदेश पर व्यास के साथ इंजीनियर microvessels उत्पन्न करता है। इंजीनियर microvessels एक microfluidic चैनल है कि मुलायम प्रकार मैं हाइड्रोजेल कोलेजन के भीतर एम्बेडेड है के माध्यम से endothelial कोशिकाओं perfusing द्वारा गढ़े हैं। इस प्रणाली की क्षमता, खुले luminal संरचना के साथ नमूनों नेटवर्क उत्पन्न दोहराने बहु सेलुलर बातचीत बाह्य मैट्रिक्स रचना मिलाना, और physiologically प्रासंगिक रक्तसंचारप्रकरण बलों लागू करने के लिए है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इंजीनियर microvessels इन विट्रो मॉडल जहां इस तरह ल्यूमिनल ज्यामिति, hydrodynamic बलों, और बहु सेलुलर बातचीत के रूप में शारीरिक विशेषताओं वर्तमान और ट्यून करने योग्य हैं। मंच के इस प्रकार में है कि यह मॉडल और संदर्भ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों स्टेम सेल और पुनर्योजी चिकित्सा के साथ ही वाशिंगटन विश्वविद्यालय में वाशिंगटन Nanofabrication सुविधा के लिए लिन और माइक Garvey इमेजिंग प्रयोगशाला संस्थान में स्वीकार करना चाहते हैं। उन्होंने यह भी स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान की वित्तीय सहायता को स्वीकार करते अनुदान DP2DK102258 (yz करने के लिए), और प्रशिक्षण अनुदान T32EB001650 और T32HL007312 (मार्च को) (एसएसके और मार्च के लिए)।
Materials
| Wafer Fabrication | |||
| AutoGlow Plasma System | AutoGlow | ||
| Headway Spin Coater | Headway Research, Inc | PWM32 Spin Coater | |
| ABM Contact Aligner | AB-M | ||
| Alpha Step Profilometer | Tencor | Alpha Step 200 | |
| SU-8 Developer | Microchem | Y020100 | |
| SU-8 Resist | Microchem | SU-8 2000 | |
| 8" silicon wafer | Wafer World Inc. | ||
| Tabletop Micro Pattern Generator | Heidelberg Instruments | μPG 101 | For generation of photomask |
| Hot plate | VWR | 97042-646 | |
| Ispropyl alcohol | Avantor Performance Materials | 9088 | |
| Petri dishes (120 x 120 mm, square) | Sigma-Aldrich | Z617679 | |
| Trichloro(3,3,3-trifluoropropyl)silane | Sigma-Aldrich | MKBG3805V | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer base and curing agent | Dow Corning | Sylgard 184 | Mixed at 10:1 (w/w) |
| Vacuum desiccator | Sigma-Aldrich | Z119024-1EA | |
| Oven | VWR | 9120976 | |
| Device Fabrication and Culture | |||
| poly(methyl methacrylate) (PMMA) | Plexiglas | ||
| Corona Treater | Electro-Technic Products, Inc. | BD-20 | Handheld device for plasma treatment of PMMA devices and PDMS molds |
| Soldering Iron | Weller | WTCPS | |
| Stainless Steel Truss Head Slotted Machine Screw | McMaster-Carr | 91785A096 | |
| Stainless steel dowel pins | McMaster-Carr | 93600A060 | |
| Tweezers | Miltex | 24-572 | Any similar tweezers may be used |
| Spatula (Micro Spoon) | Electron Microscopy Services | 62410-01 | |
| Screw driver | Any flat head screwdriver may be used, autoclaved | ||
| Glass coverslips (22 x 22 mm) | Fisher Scientific | 12-542B | |
| Bleach | Clorox | 4460030966 | |
| Petri dishes (150 X 25mm) | Corning | 430599 | |
| Petri dishes (100 X 20 mm) | Corning | 2909 | |
| Cotton, cut into 1 cm x 3 cm pieces | Autoclaved | ||
| Polyethyleneimine (PEI) | Sigma-Aldrich | P3143 | Dilute to 1% in cell culture grade water |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G6257 | Dilute to 0.1% in cell culture grade water |
| Sterile H2O | Autoclaved DI H2O | ||
| Type I collagen, dissolved in 0.1% acetic acid | Isolated from rat tails as described in Rajan et. al. 2006 (ref #37) | ||
| 1 mL syringe | BD | 309659 | |
| 10 mL syringe | BD | 309604 | |
| 15 mL conical tubes | Corning | 352097 | |
| 30 mL conical tubes | Corning | 352098 | |
| M199 10X Media | Life Technologies | 11825-015 | |
| 1N NaOH (sterile) | Sigma-Aldrich | 415413 | Dilute to 1N in cell culture grade water |
| HUVECs | Lonza | ||
| Endothelial growth media | Lonza | CC-3124 | |
| Trypsin | Corning | 25-052-CI | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermofisher Scientific | 10082147 | |
| Dextran from Leuconostoc spp. (70kDa) | Sigma-Aldrich | 31390 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-031-CV | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific Co. | 3200 | |
| Gel loading tips | VWR | 37001-152 | |
| 18G Blunt Fill Needle | BD | 305180 | |
| 20G Stainless Steel Dispensing Needle | McMaster-Carr | 75165A123 | |
| Tygon 1/32” ID, 3/32" OD Silicon Tubing | Cole-Parmer | EW-95702-00 | |
| 1/16" Tube-to-tube Coupling | McMaster-Carr | 5116K165 | |
| 90° Elbow Connectors, Tube-to-Tube | McMaster-Carr | 5121K901 | |
| Luer Lock Coupling (Female, 1/16" ID) | McMaster-Carr | 51525K211 | |
| Plastic Forceps, with Jaw Grips | Electron Microscopy Services | 72971 | |
| Dual Syringe Pump | Harvard Apparatus | 70-4505 | |
| 5 mL Polystyrene Round-bottom tube | Fisher Scientific | 14-959-2A | |
| Device Analysis | |||
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A8806-5G | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-9284 | |
| Rabbit anti-hCD31 | Abcam | ab32457 | 1:25 working dilution |
| FITC conjugated anti-von Willebrand Factor antibody | Abcam | ab8822 | 1:100 working dilution |
| Goat anti-rabbit 568 secondary antibody | Thermofisher Scientific | A-11011 | 1:100 working dilution |
| Hoescht | Thermofisher Scientific | H1399 | Resuspended in DMSO |
| Sodium cacodylate | Sigma-Aldrich | C0250 | To make 0.2M cacodylate buffer |
| Ethanol | VWR International | BDH1164-4LP | |
| 40kDa FITC-conjugated Dextran | Sigma-Aldrich | FD40S | |
| Additional Culture Reagents | |||
| CHIR-99021 | Selleck Chem | S2924 | Small molecule GSK-3 inhibitor |
| Human recombinant VEGF | Peprotech | 100-20 | |
| Human recombinant bFGF | Peprotech | AF-100-18B | |
References
- Rubanyi, G. M. The role of endothelium in cardiovascular homeostasis and diseases. J. Cardiovasc. Pharmacol. 22, 37-44 (1993).
- van Hinsbergh, V. W. The endothelium: vascular control of haemostasis. Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. 95 (2), 198-201 (2001).
- Chiu, J. -. J., Chien, S. Effects of Disturbed Flow on Vascular Endothelium: Pathophysiological Basis and Clinical Perspectives. Physiol. Rev. 91, 327-387 (2011).
- Qi, Y., Jiang, J., et al. PDGF-BB and TGB-b1 on cross-talk between endothelial and smooth muscle cells in vascular remodeling induced by low shear stress. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 1908-1913 (2011).
- Sozzani, S., Del Prete, A., Bonecchi, R., Locati, M. Chemokines as effector and target molecules in vascular biology. Cardiovasc. Res. 107 (3), 364-372 (2015).
- Huh, D., Hamilton, G. A., Ingber, D. E. From 3D cell culture to organs-on-chips. Trends Cell Biol. 21 (12), 745-754 (2011).
- Staton, C. a., Reed, M. W. R., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. Int. J. Exp. Pathol. 90, 195-221 (2009).
- Greek, R., Menache, A. Systematic Reviews of Animal Models: Methodology versus Epistemology. Int. J. Med. Sci. 10, 206-221 (2013).
- van der Worp, H. B., Howells, D. W., et al. Can Animal Models of Disease Reliably Inform Human Studies. PLoS Med. 7 (3), e1000245 (2010).
- Leong, X. -. F., Ng, C. -. Y., Jaarin, K. Animal Models in Cardiovascular Research: Hypertension and Atherosclerosis. Biomed Res. Int. 2015, 528757 (2015).
- Pries, A. R., Secomb, T. W. Making Microvascular Networks Work: Angiogenesis, Remodeling, and Pruning. Physiology. 29, 446-455 (2014).
- D’Amore, P. Mechanisms Of Angiogenesis. Annu. Rev. Physiol. 49, 453-464 (1987).
- Geudens, I., Gerhardt, H. Coordinating cell behaviour during blood vessel formation. Development. 138, 4569-4583 (2011).
- Ribatti, D., Nico, B., Crivellato, E. The development of the vascular system: a historical overview. Methods Mol. Biol. 1214, 1-14 (2015).
- Ribatti, D., Nico, B., Crivellato, E. Morphological and molecular aspects of physiological vascular morphogenesis. Angiogenesis. 12 (2), 101-111 (2009).
- Bautch, V. L. VEGF-directed blood vessel patterning: From cells to organism. Cold Spring Harb. Perspect. Med. 2 (9), 1-12 (2012).
- Stratman, A. N., Schwindt, A. E., Malotte, K. M., Davis, G. E. Endothelial-derived PDGF-BB and HB-EGF coordinately regulate pericyte recruitment during vasculogenic tube assembly and stabilization. Blood. 116, 4720-4730 (2010).
- Bach, T. L., Barsigian, C., et al. VE-Cadherin mediates endothelial cell capillary tube formation in fibrin and collagen gels. Exp. Cell Res. 238 (238), 324-334 (1998).
- Kubow, K. E., Conrad, S. K., Horwitz, a. R. Matrix microarchitecture and myosin II determine adhesion in 3D matrices. Curr. Biol. 23 (17), 1607-1619 (2013).
- Potapova, I. A., Gaudette, G. R., et al. Mesenchymal Stem Cells Support Migration, Extracellular Matrix Invasion, Proliferation, and Survival of Endothelial Cells In Vitro. Stem Cells. 25 (7), 1761-1768 (2007).
- Bayless, K. J., Davis, G. E. Sphingosine-1-phosphate markedly induces matrix metalloproteinase and integrin-dependent human endothelial cell invasion and lumen formation in three-dimensional collagen and fibrin matrices. Biochem. Biophys. Res. Commun. 312 (4), 903-913 (2003).
- Hellström, M., Gerhardt, H., et al. Lack of pericytes leads to endothelial hyperplasia and abnormal vascular morphogenesis. J. Cell Biol. 152 (3), 543-553 (2001).
- Tulloch, N. L., Muskheli, V., et al. Growth of Engineered Human Myocardium With Mechanical Loading and Vascular Coculture. Circ. Res. 109, 47-59 (2011).
- Davis, G. E., Saunders, W. B. Molecular balance of capillary tube formation versus regression in wound repair: role of matrix metalloproteinases and their inhibitors. J. Investig. dermatology Symp. 11 (1), 44-56 (2006).
- Kannan, R. Y., Salacinski, H. J., Butler, P. E., Hamilton, G., Seifalian, A. M. Current status of prosthetic bypass grafts: a review. J. Biomed. Mater. Res. B. Appl. Biomater. 74, 570-581 (2005).
- Nerem, R. M., Seliktar, D. Vascular Tissue Engineering. Annu. Rev. Biomed. Eng. 3 (1), 225-243 (2001).
- Melchiorri, A. J., Hibino, N., Fisher, J. P. Strategies and techniques to enhance the in situ endothelialization of small-diameter biodegradable polymeric vascular grafts. Tissue Eng. Part B. Rev. 19 (4), 292-307 (2013).
- Abbott, W. M., Callow, A., Moore, W., Rutherford, R., Veith, F., Weinberg, S. Evaluation and performance standards for arterial prostheses. J. Vasc. Surg. 17 (4), 746-756 (1993).
- Niklason, L. E. Functional Arteries Grown in Vitro. Science. 284 (5413), 489-493 (1999).
- Niklason, L., Counter, C. Blood vessels engineered from human cells – Authors’ reply. Lancet. 366 (9489), 892-893 (2005).
- Zheng, Y., Chen, J., et al. In vitro microvessels for the study of angiogenesis and thrombosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 9342-9347 (2012).
- Zheng, Y., Chen, J., Lòpez, J. A. Flow-driven assembly of VWF fibres and webs in in vitro microvessels. Nat. Commun. 6, 7858 (2015).
- Ligresti, G., Nagao, R. J., et al. A Novel Three-Dimensional Human Peritubular Microvascular System. J. Am. Soc. Nephrol. 27, (2015).
- Roberts, M. A., Tran, D., et al. Stromal cells in dense collagen promote cardiomyocyte and microvascular patterning in engineered human heart tissue. Tissue Eng. Part A. , (2016).
- Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nat. Protoc. 5 (3), 491-502 (2010).
- . Alpha-Step 200 Manual. Tencor Instruments. , (1989).
- Rajan, N., Habermehl, J., Coté, M. -. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nat. Protoc. 1 (6), 2753-2758 (2006).
- Baudin, B., Bruneel, A., Bosselut, N., Vaubourdolle, M. A protocol for isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells. Nat. Protoc. 2 (3), 481-485 (2007).
- Leung, A. D., Wong, K. H. K., Tien, J. Plasma expanders stabilize human microvessels in microfluidic scaffolds. J. Biomed. Mater. Res. – Part A. 100 (7), 1815-1822 (2012).
- . Tousimis SAMDRI-780 Critical Point Drying Apparatus. Tousimis Research Corporation. , (1987).
- Palpant, N. J., Pabon, L., et al. Inhibition of β-catenin signaling respecifies anterior-like endothelium into beating human cardiomyocytes. Development. 142 (18), 3198-3209 (2015).
- Gimbrone, M. a., Topper, J. N., Nagel, T., Anderson, K. R., Garcia-Cardena, G. Endothelial Dysfunction, Hemodynamic Forces, and Atherogenesis. Thromb. Haemost. 82, 722-726 (1999).
- Wu, M. H., Ustinova, E., Granger, H. J. Integrin binding to fibronectin and vitronectin maintains the barrier function of isolated porcine coronary venules. J. Physiol. 532 (3), 785-791 (2001).
- Ribatti, D., Nico, B., Vacca, A., Roncali, L., Dammacco, F. Endothelial cell heterogeneity and organ specificity. J. Hematother. Stem Cell Res. 11, 81-90 (2002).
- Shanks, N., Greek, R., Greek, J. Are animal models predictive for humans. Philos. Ethics. Humanit. Med. 4, 2 (2009).
