Summary

Micropatterning और 3 डी microvessels के विधानसभा

Published: September 09, 2016
doi:

Summary

यह पांडुलिपि microvessels कि endothelium के शारीरिक गुणों पुनरावृत्ति इंजीनियर को एक इंजेक्शन मोल्डिंग विधि प्रस्तुत करता है। microfluidic आधारित प्रक्रिया में इस तरह के प्रवाह, सेलुलर संरचना, ज्यामिति, और जैव रासायनिक ढ़ाल के रूप में tailorable शर्तों के साथ पेटेंट 3 डी संवहनी नेटवर्क बनाता है। निर्माण की प्रक्रिया और संभावित अनुप्रयोगों के उदाहरण वर्णित हैं।

Abstract

इन विट्रो प्लेटफार्मों में अध्ययन करने के लिए endothelial कोशिकाओं और नाड़ी जीव विज्ञान मोटे तौर पर 2 डी endothelial सेल संस्कृति के लिए सीमित कर रहे हैं, बहुलक या कांच आधारित substrates, और हाइड्रोजेल आधारित ट्यूब गठन assays के साथ कक्षों प्रवाह। ये assays, जबकि जानकारीपूर्ण, लुमेन ज्यामिति, उचित बाह्य मैट्रिक्स, और बहु-कोशिकीय निकटता, जो नाड़ी समारोह नियमन करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते पुनरावृत्ति नहीं है। यह पांडुलिपि 100 माइक्रोन के आदेश पर व्यास के साथ इंजीनियर वाहिकाओं उत्पन्न करने के लिए एक इंजेक्शन मोल्डिंग विधि का वर्णन है। Microvessels एक देशी प्रकार मैं हाइड्रोजेल कोलेजन के भीतर एम्बेडेड एक microfluidic चैनल में endothelial कोशिकाओं बोने द्वारा गढ़े हैं। कोलेजन मैट्रिक्स गठन चैनल से पहले के भीतर parenchymal कोशिकाओं को शामिल करके, विशिष्ट ऊतक microenvironments मॉडलिंग की है और अध्ययन किया जा सकता है। hydrodynamic गुण और मीडिया रचना के अतिरिक्त modulations वांछित microenvironment के भीतर जटिल नाड़ी समारोह के नियंत्रण के लिए अनुमति देते हैं।इस मंच परिवाहकीय सेल भर्ती, खून-endothelium बातचीत, प्रवाह प्रतिक्रिया, और ऊतक microvascular बातचीत के अध्ययन के लिए अनुमति देता है। इंजीनियर microvessels एक संवहनी आला के व्यक्तिगत घटकों से प्रभाव को अलग करने की क्षमता प्रदान करते हैं और ठीक दोनों स्वास्थ्य और रोग में नाड़ी जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए अपने रासायनिक, यांत्रिक, और जैविक गुणों नियंत्रित करते हैं।

Introduction

प्रत्येक अंग में microvasculature ऊतक microenvironment को परिभाषित है, ऊतक homeostasis को बनाए रखने और सूजन, पारगम्यता, घनास्त्रता, और फाइब्रिनोलयन 1,2 विनियमित मदद करता है। 5 माईक्रवैस्कुलर endothelium, विशेष रूप से, रक्त प्रवाह और आसपास के ऊतकों और इसलिए बीच इंटरफेस ऐसे hydrodynamic बलों और घूम साइटोकिन्स और हार्मोन 3 के रूप में उत्तेजनाओं के जवाब में संवहनी और अंग समारोह नियमन करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। endothelium, रक्त के बीच विस्तृत बातचीत को समझने, और आसपास के ऊतक microenvironment संवहनी जीव विज्ञान और रोग प्रगति के अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण है। हालांकि, इन मुलाकातों के अध्ययन में प्रगति के द्वारा इन विट्रो उपकरण है कि इन विवो microvascular संरचना में पुनरावृत्ति नहीं है और 6.7 से काम में सीमित रुकावट किया गया है। नतीजतन, क्षेत्र और चिकित्सीय उन्नति महंगा है और समय पर भारी भरोसा हैलेने वाली पशु मॉडल है कि अक्सर मनुष्य 8 में सफलता के लिए अनुवाद करने के लिए असफल 10। जबकि इन विवो मॉडल रोग तंत्र और नाड़ी कार्यों के अध्ययन में अमूल्य हैं, वे जटिल होते हैं और अक्सर biophysical संकेतों व्यक्तिगत सेलुलर, जैव रासायनिक के सटीक नियंत्रण, और की कमी है।

पूरे शरीर में Vasculature अनुकूलित छिड़काव और पोषक तत्व परिवहन एक साथ 11 उपलब्ध कराने, विशाल केशिका बेड के साथ संयोजन के रूप में एक परिपक्व सौपानिक संरचना के पास। प्रारंभ में, एक आदिम जाल जो प्रारंभिक विकास 12,13 के दौरान एक पदानुक्रम branched नेटवर्क से reorganizes के रूप में वाहिका रूपों। हालांकि इन प्रक्रियाओं में शामिल संकेतों से कई अच्छी तरह से समझ रहे हैं 14 16 है, यह मायावी बनी हुई है कि कैसे इस तरह के संवहनी patterning चुना गया है 15। बदले में, इन विट्रो में इस प्रक्रिया recapitulating इंजीनियर को संगठित संवहनी नेटवर्क मधुमक्खी हैn मुश्किल है। कई मौजूदा इन विट्रो प्लेटफार्मों वाहिका मॉडल करने के लिए, इस तरह के दो आयामी endothelial सेल संस्कृतियों के रूप में, इस तरह के बहु-कोशिकीय निकटता, तीन आयामी ल्यूमिनल ज्यामिति, प्रवाह, और बाह्य मैट्रिक्स के रूप में महत्वपूर्ण विशेषताओं की कमी है। ट्यूब 3 डी हाइड्रोजेल में गठन assays (कोलेजन या आतंच) 17 19 या आक्रमण assays 20,21 अन्य संवहनी 17,22 या ऊतक प्रकार की कोशिकाओं 23 के साथ 3 डी और उनकी बातचीत में endothelial समारोह का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। हालांकि, इकट्ठे इन assays में lumens इंटरकनेक्टिविटी, रक्तसंचारप्रकरण प्रवाह, और उचित छिड़काव की कमी है। इसके अलावा, इन ट्यूब गठन assays के 24 में संवहनी प्रतिगमन के लिए प्रवृत्ति लंबे समय तक संस्कृति और परिपक्वता जो कार्यात्मक अध्ययन है कि प्रदर्शन किया जा सकता है की डिग्री की सीमा से बचाता है। इस प्रकार, वहाँ एक तेजी से बढ़ते इंजीनियर को microvascular नेटवर्क है कि उचित मॉडल कर सकते हैं एन के इन विट्रो प्लेटफार्मों की जरूरत हैविशेषताओं dothelial और लंबी अवधि संस्कृति में सक्षम हैं।

संवहनी इंजीनियरिंग तकनीक की एक किस्म चिकित्सा अनुप्रयोगों को बदलने के लिए या रोग के साथ रोगियों में बाईपास प्रभावित जहाजों के लिए पिछले कुछ वर्षों में उभरा है। बड़े व्यास वाहिकाओं ऐसे पॉलीथीन terephthalate (पीईटी), और polytetrafluoroethylene (ePTFE) के रूप में सिंथेटिक सामग्री से बनाया दीर्घकालिक प्रत्यक्षता (औसत 95% प्रत्यक्षता पर 5 साल), 25 के साथ काफी चिकित्सीय सफलता मिली है। हालांकि छोटे व्यास सिंथेटिक ग्राफ्ट (<6 मिमी) आम तौर पर इस तरह के intimal हाइपरप्लासिया और thrombopoiesis 26 के रूप में जटिलताओं का सामना 28, ऊतक छोटे व्यास जैविक सामग्री के साथ किया ग्राफ्ट इंजीनियर महत्वपूर्ण प्रगति 29,30 बना दिया है। इस तरह की प्रगति के बावजूद, microscale पर इंजीनियर वाहिकाओं एक चुनौती बनी हुई है। पर्याप्त रूप से microvasculature मॉडल के लिए, यह SUF साथ जटिल नेटवर्क पैटर्न उत्पन्न करने के लिए आवश्यक हैficient यांत्रिक शक्ति प्रत्यक्षता और एक मैट्रिक्स संरचना है कि parenchymal कोशिकाओं और सेलुलर remodeling के लिए दोनों पोषक तत्व पारगमन के लिए अनुमति देता है के साथ बनाए रखने के लिए।

34 इस प्रोटोकॉल एक उपन्यास कृत्रिम perfusable पोत नेटवर्क है कि एक ट्यून करने योग्य और चलाया microenvironment 31 के साथ सेटिंग विवो में एक देशी mimics प्रस्तुत करता है। वर्णित विधि 100 माइक्रोन के आदेश पर व्यास के साथ इंजीनियर microvessels उत्पन्न करता है। इंजीनियर microvessels एक microfluidic चैनल है कि मुलायम प्रकार मैं हाइड्रोजेल कोलेजन के भीतर एम्बेडेड है के माध्यम से endothelial कोशिकाओं perfusing द्वारा गढ़े हैं। इस प्रणाली की क्षमता, खुले luminal संरचना के साथ नमूनों नेटवर्क उत्पन्न दोहराने बहु सेलुलर बातचीत बाह्य मैट्रिक्स रचना मिलाना, और physiologically प्रासंगिक रक्तसंचारप्रकरण बलों लागू करने के लिए है।

Protocol

1. नमूनों polydimethylsiloxane (PDMS) नेटवर्क डिजाइन के साथ की Microfabrication निर्माण मे नेटवर्क डिजाइन की एक नकारात्मक टेम्पलेट बनाने के लिए किसी भी कंप्यूटर एडेड डिजाइन (सीएडी) सॉफ्टवेयर का उपयोग कर एक नेटवर्क प?…

Representative Results

इंजीनियर पोत मंच कार्यात्मक microvasculature एक प्राकृतिक कोलेजन प्रकार मैं मैट्रिक्स के भीतर एम्बेडेड बनाता है और इन विट्रो में, सेलुलर biophysical और जैव रासायनिक पर्यावरण की तंग नियंत्रण के लिए अनु?…

Discussion

इंजीनियर microvessels इन विट्रो मॉडल जहां इस तरह ल्यूमिनल ज्यामिति, hydrodynamic बलों, और बहु सेलुलर बातचीत के रूप में शारीरिक विशेषताओं वर्तमान और ट्यून करने योग्य हैं। मंच के इस प्रकार में है कि यह मॉडल और संदर्भ…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

लेखकों स्टेम सेल और पुनर्योजी चिकित्सा के साथ ही वाशिंगटन विश्वविद्यालय में वाशिंगटन Nanofabrication सुविधा के लिए लिन और माइक Garvey इमेजिंग प्रयोगशाला संस्थान में स्वीकार करना चाहते हैं। उन्होंने यह भी स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान की वित्तीय सहायता को स्वीकार करते अनुदान DP2DK102258 (yz करने के लिए), और प्रशिक्षण अनुदान T32EB001650 और T32HL007312 (मार्च को) (एसएसके और मार्च के लिए)।

Materials

Wafer Fabrication
AutoGlow Plasma System AutoGlow
Headway Spin Coater Headway Research, Inc  PWM32 Spin Coater 
ABM Contact Aligner AB-M
Alpha Step Profilometer Tencor Alpha Step 200
SU-8 Developer Microchem Y020100
SU-8 Resist Microchem SU-8 2000
8" silicon wafer Wafer World Inc.
Tabletop Micro Pattern Generator Heidelberg Instruments μPG 101 For generation of photomask
Hot plate VWR 97042-646
Ispropyl alcohol Avantor Performance Materials 9088
Petri dishes (120 x 120 mm, square) Sigma-Aldrich Z617679
Trichloro(3,3,3-trifluoropropyl)silane Sigma-Aldrich MKBG3805V
Polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer base and curing agent Dow Corning Sylgard 184 Mixed at 10:1 (w/w)
Vacuum desiccator Sigma-Aldrich Z119024-1EA
Oven VWR 9120976
Device Fabrication and Culture
poly(methyl methacrylate) (PMMA) Plexiglas
Corona Treater Electro-Technic Products, Inc. BD-20 Handheld device for plasma treatment of PMMA devices and PDMS molds
Soldering Iron Weller  WTCPS
Stainless Steel Truss Head Slotted Machine Screw McMaster-Carr  91785A096
Stainless steel dowel pins McMaster-Carr  93600A060
Tweezers  Miltex 24-572 Any similar tweezers may be used
Spatula (Micro Spoon) Electron Microscopy Services 62410-01
Screw driver Any flat head screwdriver may be used, autoclaved
Glass coverslips (22 x 22 mm) Fisher Scientific 12-542B
Bleach Clorox 4460030966
Petri dishes (150 X 25mm) Corning 430599
Petri dishes (100 X 20 mm) Corning 2909
Cotton, cut into 1 cm x 3 cm pieces Autoclaved
Polyethyleneimine (PEI) Sigma-Aldrich P3143 Dilute to 1% in cell culture grade water
Glutaraldehyde Sigma-Aldrich G6257 Dilute to 0.1% in cell culture grade water
Sterile H2O Autoclaved DI H2O
Type I collagen, dissolved in 0.1% acetic acid Isolated from rat tails as described in Rajan et. al. 2006 (ref #37)
1 mL syringe BD 309659
10 mL syringe BD 309604
15 mL conical tubes Corning 352097
30 mL conical tubes Corning 352098
M199 10X Media  Life Technologies 11825-015
1N NaOH (sterile) Sigma-Aldrich 415413 Dilute to 1N in cell culture grade water
HUVECs  Lonza
Endothelial growth media Lonza CC-3124
Trypsin Corning 25-052-CI
Fetal bovine serum (FBS) Thermofisher Scientific 10082147
Dextran from Leuconostoc spp. (70kDa) Sigma-Aldrich 31390
Phosphate Buffered Saline (PBS) Corning 21-031-CV
Hemocytometer Hausser Scientific Co. 3200
Gel loading tips VWR 37001-152
18G Blunt Fill Needle BD  305180
20G Stainless Steel Dispensing Needle McMaster-Carr 75165A123
Tygon 1/32” ID, 3/32" OD Silicon Tubing Cole-Parmer EW-95702-00
1/16" Tube-to-tube Coupling McMaster-Carr 5116K165
90° Elbow Connectors, Tube-to-Tube McMaster-Carr 5121K901
Luer Lock Coupling (Female, 1/16" ID) McMaster-Carr 51525K211
Plastic Forceps, with Jaw Grips Electron Microscopy Services 72971
Dual Syringe Pump Harvard Apparatus 70-4505
5 mL Polystyrene Round-bottom tube Fisher Scientific 14-959-2A
Device Analysis
Formaldehyde Sigma-Aldrich F8775
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A8806-5G
Triton X-100 Sigma-Aldrich T-9284
Rabbit anti-hCD31 Abcam ab32457 1:25 working dilution
FITC conjugated anti-von Willebrand Factor antibody Abcam ab8822 1:100 working dilution
Goat anti-rabbit 568 secondary antibody Thermofisher Scientific A-11011 1:100 working dilution
Hoescht Thermofisher Scientific H1399 Resuspended in DMSO
Sodium cacodylate  Sigma-Aldrich C0250 To make 0.2M cacodylate buffer
Ethanol VWR International BDH1164-4LP
40kDa FITC-conjugated Dextran Sigma-Aldrich FD40S 
Additional Culture Reagents 
CHIR-99021 Selleck Chem S2924 Small molecule GSK-3 inhibitor
Human recombinant VEGF Peprotech 100-20
Human recombinant bFGF Peprotech AF-100-18B

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Cite This Article
Roberts, M. A., Kotha, S. S., Phong, K. T., Zheng, Y. Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels. J. Vis. Exp. (115), e54457, doi:10.3791/54457 (2016).

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