Эта рукопись представляет собой метод литья под давлением для инженера-микрососудов, что перепросматривать физиологические свойства эндотелия. Процесс Микрожидкостных на основе создает патент 3D сети сосудов с адаптивности условиями, такими, как поток, клеточный состав, геометрии и биохимических градиентов. Процесс изготовления и примеры возможных применений описаны.
В пробирке платформ для изучения эндотелиальные клетки и сосудистой биологии в основном ограничиваются 2D – эндотелиальной клеточной культуре, проточных камер с полимером или на основе стеклянных подложек, а также анализов образования трубки гидрогеля на основе. Эти анализы, в то время как информативным, не резюмировать люменов геометрию, правильное внеклеточный матрикс и многоклеточные близость, которые играют ключевую роль в модуляции сосудистой функции. Эта рукопись описывает метод литья под давлением для создания Engineered сосуды диаметром порядка 100 мкм. Микрососуды изготовлены затравкой эндотелиальные клетки в микрожидкостных канал встроенного в родной типа I коллагена гидрогель. Объединив паренхиматозные клетки в коллагеновой матрице предварительного направлять образование, специфические микросреды ткани могут быть смоделированы и изучены. Дополнительные модуляциями гидродинамических свойств и состава средств массовой информации позволяют управлять сложной сосудистой функции в пределах желаемого микросреды.Данная платформа позволяет для изучения набора периваскулярного клеток, крови-эндотелий взаимодействий, ответ потока и тканевой микрососудистой взаимодействий. Engineered микрососудов дают возможность изолировать влияние от отдельных компонентов сосудистой ниши и точно контролировать свои химические, механические и биологические свойства для изучения сосудистой биологии как в здоровье и болезни.
Микрососудов в каждом органе помогает определить микросреду ткани, поддержания гомеостаза тканей и регулируют воспаление, проницаемость, тромбоз и фибринолиза 1,2. Микрососудистой эндотелий, в частности, является интерфейсом между кровотоком и окружающей ткани и , следовательно , играет критическую роль в модуляции сосудистой и функции органов в ответ на стимулы , такие как гидродинамические силы и циркулирующих цитокинов и гормонов 3 – 5. Понимание подробные взаимодействия между эндотелий, кровь, и окружающая микросреда ткани имеет важное значение для изучения сосудистой биологии и прогрессирования заболевания. Однако прогресс в изучении этих взаимодействий тормозились ограничены в пробирке инструментов , которые не Резюмируя в естественных условиях структуры микрососудов и функционируют 6,7. В результате, поле и терапевтическое продвижение уже в значительной степени опирался на дорогостоящий и Time-потребляющих животных моделей , которые часто не в состоянии перевести к успеху у людей 8 – 10. В то время как модели в естественных условиях незаменимы при изучении механизмов болезни и сосудистых функций, они являются сложными и зачастую не имеют точный контроль индивидуального клеточного, биохимических и биофизических киев.
Сосудистую систему по всему телу обладает зрелой иерархическую структуру в сочетании с экспансивной капиллярных кровати, обеспечивая оптимизированную перфузию и переноса питательных веществ одновременно 11. Первоначально сосудистую формы как примитивный сплетении , который реорганизует к иерархически разветвленной сети во время раннего развития 12,13. Хотя многие из сигналов , участвующих в этих процессах хорошо изучены 14 – 16, он остается неуловимым , как такое сосудистая структурирование определяется 15. В свою очередь, обобщал этот процесс в пробирке инженер организованных сосудистых сетей пчелп трудно. Многие из существующих платформ в пробирке для моделирования сосудистой сети , такие как двухмерных культурах эндотелиальных клеток, отсутствие важных характеристик , таких как многоклеточной близость, трехмерной геометрии просвету, потока, и внеклеточного матрикса. Анализы труб формирования в 3D гидрогелей (коллаген или фибрина) 17 – 19 или инвазии анализы 20,21 были использованы для изучения эндотелиальной функции в 3D и их взаимодействия с другими сосудистыми 17,22 или клеток ткани типов 23. Тем не менее, собранные просветы в этих анализах не хватает взаимосвязанности, гемодинамического потока и соответствующую перфузию. Кроме того, склонность к сосудистой регрессии в этих анализах образования 24 трубки предотвращает долгосрочную культуру и созреванию , которая ограничивает степень функциональных исследований , которые могут быть выполнены. Таким образом, существует необходимость в расцветающий инженер платформ в пробирке микрососудистых сетей , которые могут надлежащим образом моделировать анdothelial характеристики и способны долгосрочной культуре.
Разнообразие сосудистых инженерии появились на протяжении многих лет для медицинских применений для замены или выносной пораженных сосудов у пациентов с сосудистыми заболеваниями. Сосуды большого диаметра , изготовленные из синтетических материалов , таких как полиэтилентерефталат (ПЭТ) и политетрафторэтилена (ПТФЭ) имели значительный терапевтический успех на долгий срок ( в среднем проходимости 95% проходимость более 5 лет) 25. Несмотря на небольшой диаметр синтетических трансплантатов (<6 мм) , как правило , сталкиваются с осложнениями , такие как гиперплазии интимы и тромбопоэза 26 – 28, тканевой инженерии трансплантатов малого диаметра , изготовленные с биологическим материалом достигли значительного прогресса 29,30. Несмотря на успехи такого рода, сконструированные сосуды на микроуровне остались вызов друг другу. Для того, чтобы адекватно смоделировать микрососудов, необходимо создавать сложные сетевые модели с Sufфициент механическую прочность для поддержания проходимость и с композицией матрицы, что позволяет как питательных веществ для проникновения паренхимных клеток и клеточного ремоделирования.
Этот протокол представляет собой новую искусственную perfusable сеть сосудов , которая имитирует уроженца в естественных условиях установки с настраиваемым и управляемым микросреды 31 – 34. Описанный метод генерирует Engineered микрососуды с диаметром порядка 100 мкм. Engineered микрососудов изготавливаются перфузируя эндотелиальные клетки через микрожидком канал, который встроен в мягкого типа I коллагена гидрогель. Эта система имеет способность генерировать узорных сетей с открытой структурой просвету, тиражировать многоклеточных взаимодействий, модулировать внеклеточного матрикса состава, и применять соответствующие физиологически гемодинамические силы.
Engineered микрососудов являются моделью в пробирке , где физиологические характеристики , такие как геометрия просвету, гидродинамические силы и многоклеточных взаимодействий присутствуют и перестраиваемой. Этот тип платформы является мощным в том , что она дает возможность моделир…
The authors have nothing to disclose.
Авторы хотели бы отметить Линн и Майк Гарви визуализации лаборатории в Институте стволовых клеток и регенеративной медицины, а также Вашингтон Nanofabrication фонда в Университете штата Вашингтон. Они также признают финансовую поддержку Национального института здравоохранения предоставляет DP2DK102258 (к YZ), а также обучение предоставляет T32EB001650 (к ССК и САХ) и T32HL007312 (к САХ).
Wafer Fabrication | |||
AutoGlow Plasma System | AutoGlow | ||
Headway Spin Coater | Headway Research, Inc | PWM32 Spin Coater | |
ABM Contact Aligner | AB-M | ||
Alpha Step Profilometer | Tencor | Alpha Step 200 | |
SU-8 Developer | Microchem | Y020100 | |
SU-8 Resist | Microchem | SU-8 2000 | |
8" silicon wafer | Wafer World Inc. | ||
Tabletop Micro Pattern Generator | Heidelberg Instruments | μPG 101 | For generation of photomask |
Hot plate | VWR | 97042-646 | |
Ispropyl alcohol | Avantor Performance Materials | 9088 | |
Petri dishes (120 x 120 mm, square) | Sigma-Aldrich | Z617679 | |
Trichloro(3,3,3-trifluoropropyl)silane | Sigma-Aldrich | MKBG3805V | |
Polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer base and curing agent | Dow Corning | Sylgard 184 | Mixed at 10:1 (w/w) |
Vacuum desiccator | Sigma-Aldrich | Z119024-1EA | |
Oven | VWR | 9120976 | |
Device Fabrication and Culture | |||
poly(methyl methacrylate) (PMMA) | Plexiglas | ||
Corona Treater | Electro-Technic Products, Inc. | BD-20 | Handheld device for plasma treatment of PMMA devices and PDMS molds |
Soldering Iron | Weller | WTCPS | |
Stainless Steel Truss Head Slotted Machine Screw | McMaster-Carr | 91785A096 | |
Stainless steel dowel pins | McMaster-Carr | 93600A060 | |
Tweezers | Miltex | 24-572 | Any similar tweezers may be used |
Spatula (Micro Spoon) | Electron Microscopy Services | 62410-01 | |
Screw driver | Any flat head screwdriver may be used, autoclaved | ||
Glass coverslips (22 x 22 mm) | Fisher Scientific | 12-542B | |
Bleach | Clorox | 4460030966 | |
Petri dishes (150 X 25mm) | Corning | 430599 | |
Petri dishes (100 X 20 mm) | Corning | 2909 | |
Cotton, cut into 1 cm x 3 cm pieces | Autoclaved | ||
Polyethyleneimine (PEI) | Sigma-Aldrich | P3143 | Dilute to 1% in cell culture grade water |
Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G6257 | Dilute to 0.1% in cell culture grade water |
Sterile H2O | Autoclaved DI H2O | ||
Type I collagen, dissolved in 0.1% acetic acid | Isolated from rat tails as described in Rajan et. al. 2006 (ref #37) | ||
1 mL syringe | BD | 309659 | |
10 mL syringe | BD | 309604 | |
15 mL conical tubes | Corning | 352097 | |
30 mL conical tubes | Corning | 352098 | |
M199 10X Media | Life Technologies | 11825-015 | |
1N NaOH (sterile) | Sigma-Aldrich | 415413 | Dilute to 1N in cell culture grade water |
HUVECs | Lonza | ||
Endothelial growth media | Lonza | CC-3124 | |
Trypsin | Corning | 25-052-CI | |
Fetal bovine serum (FBS) | Thermofisher Scientific | 10082147 | |
Dextran from Leuconostoc spp. (70kDa) | Sigma-Aldrich | 31390 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-031-CV | |
Hemocytometer | Hausser Scientific Co. | 3200 | |
Gel loading tips | VWR | 37001-152 | |
18G Blunt Fill Needle | BD | 305180 | |
20G Stainless Steel Dispensing Needle | McMaster-Carr | 75165A123 | |
Tygon 1/32” ID, 3/32" OD Silicon Tubing | Cole-Parmer | EW-95702-00 | |
1/16" Tube-to-tube Coupling | McMaster-Carr | 5116K165 | |
90° Elbow Connectors, Tube-to-Tube | McMaster-Carr | 5121K901 | |
Luer Lock Coupling (Female, 1/16" ID) | McMaster-Carr | 51525K211 | |
Plastic Forceps, with Jaw Grips | Electron Microscopy Services | 72971 | |
Dual Syringe Pump | Harvard Apparatus | 70-4505 | |
5 mL Polystyrene Round-bottom tube | Fisher Scientific | 14-959-2A | |
Device Analysis | |||
Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A8806-5G | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-9284 | |
Rabbit anti-hCD31 | Abcam | ab32457 | 1:25 working dilution |
FITC conjugated anti-von Willebrand Factor antibody | Abcam | ab8822 | 1:100 working dilution |
Goat anti-rabbit 568 secondary antibody | Thermofisher Scientific | A-11011 | 1:100 working dilution |
Hoescht | Thermofisher Scientific | H1399 | Resuspended in DMSO |
Sodium cacodylate | Sigma-Aldrich | C0250 | To make 0.2M cacodylate buffer |
Ethanol | VWR International | BDH1164-4LP | |
40kDa FITC-conjugated Dextran | Sigma-Aldrich | FD40S | |
Additional Culture Reagents | |||
CHIR-99021 | Selleck Chem | S2924 | Small molecule GSK-3 inhibitor |
Human recombinant VEGF | Peprotech | 100-20 | |
Human recombinant bFGF | Peprotech | AF-100-18B |