כתב יד זה מציג שיטת הזרקה להנדס microvessels כי לשחזר מאפיינים פיסיולוגיים של האנדותל. תהליך microfluidic המבוסס יוצר רשתות כלי דם 3D פטנט עם תנאי tailorable, כגון זרימה, רכב הסלולר, גיאומטריה, והדרגות ביוכימיים. תהליך ייצור ודוגמאות של יישומים פוטנציאליים מתוארים.
בשנת פלטפורמות במבחנה ללמוד בתאי האנדותל וביולוגיה וסקולרית מוגבלים במידה רבה לתרבות תא האנדותל 2D, לזרום תאים עם פולימר או מצעים מלוחים וזכוכית, מבחני היווצרות צינור מבוסס הידרוג'ל. מבחנים אלו, תוך אינפורמטיבי, לא לשחזר גיאומטרית לומן, מטריקס ראויה, קרבה רבה תאית, אשר ממלאת תפקידים מרכזיים ויסות תפקוד כלי דם. כתב יד זה מתאר שיטת הזרקה לייצר כלי Engineered בקטרים בסדר גודל של 100 מיקרומטר. Microvessels מיוצרים על ידי זריעת לתאי אנדותל ערוץ microfluidic מוטבע בתוך סוג יליד שאני קולגן הידרוג'ל. על ידי שילוב תאי parenchymal בתוך המטריצה קולגן לפני לתעל היווצרות, microenvironments רקמות הספציפי יכול להיות מודל ולומד. מודולציות נוסף של הרכב נכסים ומדיה הידרודינמית לאפשר בקרה של תפקוד כלי הדם מורכב במיקרו-סביבה של הרצוי.פלטפורמה זו מאפשרת לחקר גיוס תא perivascular, אינטראקציות האנדותל דם, תגובת זרימה, ואינטראקציות-כלי דם לרקמות. microvessels המהונדס מציע את היכולת לבודד את השפעת מרכיבים בודדים של נישת כלי דם ולשלוט הכימיים שלה בדיוק, מכאניות, ואת תכונות ביולוגיות ללמוד ביולוגיה וסקולרית בשתי בריאות ומחלות.
על נימי הדם הזעירים בכל איבר עוזר להגדיר את microenvironment רקמות, לשמור על הומאוסטזיס רקמות לווסת דלקת, חדירות, פקקת, ו פירוק פיברין 1,2. האנדותל כלי הדם, בפרט, הוא ממשק בין זרימת הדם ואת הרקמה שמסביב ועל כן היא משחקת תפקיד קריטי בויסות וסקולרית ותפקוד איברים בתגובה לגירויים כגון כוחות הידרודינמית במחזור ציטוקינים והורמונים 3 – 5. הבנת יחסי הגומלין המפורט בין האנדותל, הדם, ואת המיקרו-סביבת הרקמה הסובבת חשובה לחקר ביולוגיה של כלי דם ואת התקדמות מחלה. עם זאת, התקדמות בחקר אינטראקציות אלה התעכבה בשל מוגבלות כלים במבחנה שאינו לשחזר במבנה כלי דם vivo ולתפקד 6,7. כתוצאה מכך, השדה והקידום טיפולי הסתמכו בכבדות על יקר הזמן-רב במודלים של בעלי חיים כי לעיתים קרובות אינם מצליחים לתרגם להצלחה בבני אדם 8 – 10. בעוד מודלים in vivo הם לא יסולא בפז בחקר מנגנוני המחלה ופונקציות וסקולרית, הם מורכבים ולעיתים קרובות חסרי שליטה מדויקת של הסלולר, ביוכימיים הפרט, רמזים biophysical.
כלי דם בכל הגוף הוא בעל מבנה היררכי בוגר בשיתוף עם מיטות נימי מרחיבה, מתן זלוף אופטימיזציה תחבורה מזין 11 בו זמנית. בתחילה, טפסים בכלי דם כמו מקלעת פרימיטיבית אשר מארגנת מחדש לרשת מסועפת באופן היררכי במהלך ההתפתחות מוקדמת 12,13. למרות שרבים מן האותות מעורבים בתהליכים אלה מובנים היטב 14 – 16, הוא נשאר חמקמק איך כגון דפוסים של כלי דם נקבעו 15. בתורו, משחזר את התהליך הזה במבחנה להנדס רשתות כלי דם מאורגנות יש דבוריםn קשה. פלטפורמות רבות הקיימות במבחנת מודל בכלי דם, כגון שתי תרבויות תא האנדותל ממדיות, חסרות מאפיינים חשובים כגון קרבה רבה תאית, שלוש גיאומטריה לומינל ממדי, זרימה, ואת מטריקס. מבחני היווצרות צינור ב הידרוג 3D (קולגן או הפיברין) 17 – 19 או הפלישה מבחני 20,21 שימשו ללמוד את תפקוד האנדותל ב -3 D ויחסי הגומלין שלהם עם 17,22 או תא רקמה וסקולרית אחרים סוגי 23. עם זאת, התאסף לומן מבחנים אלה חסרים גומלין, זרימת המודינמי, ו זלוף המתאים. יתר על כן, הנטייה לרגרסיה וסקולרית מבחני היווצרות צינור אלה 24 מונעת תרבות לטווח ארוכה והתבגרות המגבילה את מידת מחקרים פונקציונליים שניתן לבצע. לפיכך, יש צורך המתפתח להנדס במבחנת פלטפורמות של רשתות כלי דם שיכול מודל כראוי endothelial מאפיינים ומסוגלים התרבות לטווח ארוך.
מגוון של טכניקות הנדסה וסקולרית צמח במשך השנים ליישומים רפואיים להחליף או כלי מושפע מעקפים בחולים עם מחלת כלי דם. כלי בקוטר גדול מחומרים סינתטיים כגון terephthalate פוליאתילן (PET), ו polytetrafluoroethylene (ePTFE) נחלו הצלחה טיפולית ניכר עם patency לטווח ארוך (patency 95% בממוצע על פני 5 שנים) 25. למרות שתלי סינתטי קטן בקוטר (<6 מ"מ) בדרך כלל להתמודד עם סיבוכים כגון היפרפלזיה intimal ואת thrombopoiesis 26 – 28, רקמות מהונדסות שתלי בקוטר קטן עשה עם חומר ביולוגי יש התקדמות משמעותית 29,30. למרות התקדמות מסוג זה, כלי מהונדסים על microscale נותרו אתגר. כדי לעצב את microvasculature כראוי, יש צורך ליצור דפוסי רשת מורכבים עם הסוףחוזק מכני ficient כדי לשמור patency ועם רכב מטריקס המאפשר כאחד חלחול מזין עבור תאי parenchymal שיפוץ הסלולר.
פרוטוקול זה מציג רשת כלי perfusable מלאכותית רומן מחקה יליד in vivo הגדרה עם microenvironment מתכונן לשליטה 31 – 34. השיטה המתוארת יוצרת microvessels Engineered בקטרים בסדר גודל של 100 מיקרומטר. microvessels המהונדס מיוצר על ידי מרוסס תאי אנדותל דרך ערוץ microfluidic שמוטבע בתוך הסוג רך אני קולגן הידרוג'ל. מערכת זו יש את היכולת ליצור רשתות בדוגמת עם מבנה לומינל פתוח, לשכפל אינטראקציות רבות תאיות, לווסת רכב תאי מטריקס, ולהחיל כוחות המודינמי רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית.
Microvessels המהונדס מהווה מודל במבחנה שבה מאפיינים פיסיולוגיים כגון גיאומטריה לומינל, כוחות הידרודינמית, ואינטראקציות רבות תאיות קיימים מתכונן. סוג של פלטפורמה זו היא בעלת עוצמה בכך שהיא מציעה את היכולת לבנות מודל ללמוד את ההתנהגות אנדותל במגוון הקשרים בהם התנאים ?…
The authors have nothing to disclose.
המחברים מבקשים להודות לין ומייק גארווי הדמיה מעבדה במכון תאי גזע ורפואה רגנרטיבית וכן מתקן Nanofabrication וושינגטון באוניברסיטת וושינגטון. הם גם מכירים את התמיכה הכספית של המכון הלאומי לבריאות מעניקה DP2DK102258 (כדי YZ), והכשרה מעניקה T32EB001650 (כדי SSK ו MAR) ו T32HL007312 (כדי MAR).
Wafer Fabrication | |||
AutoGlow Plasma System | AutoGlow | ||
Headway Spin Coater | Headway Research, Inc | PWM32 Spin Coater | |
ABM Contact Aligner | AB-M | ||
Alpha Step Profilometer | Tencor | Alpha Step 200 | |
SU-8 Developer | Microchem | Y020100 | |
SU-8 Resist | Microchem | SU-8 2000 | |
8" silicon wafer | Wafer World Inc. | ||
Tabletop Micro Pattern Generator | Heidelberg Instruments | μPG 101 | For generation of photomask |
Hot plate | VWR | 97042-646 | |
Ispropyl alcohol | Avantor Performance Materials | 9088 | |
Petri dishes (120 x 120 mm, square) | Sigma-Aldrich | Z617679 | |
Trichloro(3,3,3-trifluoropropyl)silane | Sigma-Aldrich | MKBG3805V | |
Polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer base and curing agent | Dow Corning | Sylgard 184 | Mixed at 10:1 (w/w) |
Vacuum desiccator | Sigma-Aldrich | Z119024-1EA | |
Oven | VWR | 9120976 | |
Device Fabrication and Culture | |||
poly(methyl methacrylate) (PMMA) | Plexiglas | ||
Corona Treater | Electro-Technic Products, Inc. | BD-20 | Handheld device for plasma treatment of PMMA devices and PDMS molds |
Soldering Iron | Weller | WTCPS | |
Stainless Steel Truss Head Slotted Machine Screw | McMaster-Carr | 91785A096 | |
Stainless steel dowel pins | McMaster-Carr | 93600A060 | |
Tweezers | Miltex | 24-572 | Any similar tweezers may be used |
Spatula (Micro Spoon) | Electron Microscopy Services | 62410-01 | |
Screw driver | Any flat head screwdriver may be used, autoclaved | ||
Glass coverslips (22 x 22 mm) | Fisher Scientific | 12-542B | |
Bleach | Clorox | 4460030966 | |
Petri dishes (150 X 25mm) | Corning | 430599 | |
Petri dishes (100 X 20 mm) | Corning | 2909 | |
Cotton, cut into 1 cm x 3 cm pieces | Autoclaved | ||
Polyethyleneimine (PEI) | Sigma-Aldrich | P3143 | Dilute to 1% in cell culture grade water |
Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G6257 | Dilute to 0.1% in cell culture grade water |
Sterile H2O | Autoclaved DI H2O | ||
Type I collagen, dissolved in 0.1% acetic acid | Isolated from rat tails as described in Rajan et. al. 2006 (ref #37) | ||
1 mL syringe | BD | 309659 | |
10 mL syringe | BD | 309604 | |
15 mL conical tubes | Corning | 352097 | |
30 mL conical tubes | Corning | 352098 | |
M199 10X Media | Life Technologies | 11825-015 | |
1N NaOH (sterile) | Sigma-Aldrich | 415413 | Dilute to 1N in cell culture grade water |
HUVECs | Lonza | ||
Endothelial growth media | Lonza | CC-3124 | |
Trypsin | Corning | 25-052-CI | |
Fetal bovine serum (FBS) | Thermofisher Scientific | 10082147 | |
Dextran from Leuconostoc spp. (70kDa) | Sigma-Aldrich | 31390 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-031-CV | |
Hemocytometer | Hausser Scientific Co. | 3200 | |
Gel loading tips | VWR | 37001-152 | |
18G Blunt Fill Needle | BD | 305180 | |
20G Stainless Steel Dispensing Needle | McMaster-Carr | 75165A123 | |
Tygon 1/32” ID, 3/32" OD Silicon Tubing | Cole-Parmer | EW-95702-00 | |
1/16" Tube-to-tube Coupling | McMaster-Carr | 5116K165 | |
90° Elbow Connectors, Tube-to-Tube | McMaster-Carr | 5121K901 | |
Luer Lock Coupling (Female, 1/16" ID) | McMaster-Carr | 51525K211 | |
Plastic Forceps, with Jaw Grips | Electron Microscopy Services | 72971 | |
Dual Syringe Pump | Harvard Apparatus | 70-4505 | |
5 mL Polystyrene Round-bottom tube | Fisher Scientific | 14-959-2A | |
Device Analysis | |||
Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A8806-5G | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-9284 | |
Rabbit anti-hCD31 | Abcam | ab32457 | 1:25 working dilution |
FITC conjugated anti-von Willebrand Factor antibody | Abcam | ab8822 | 1:100 working dilution |
Goat anti-rabbit 568 secondary antibody | Thermofisher Scientific | A-11011 | 1:100 working dilution |
Hoescht | Thermofisher Scientific | H1399 | Resuspended in DMSO |
Sodium cacodylate | Sigma-Aldrich | C0250 | To make 0.2M cacodylate buffer |
Ethanol | VWR International | BDH1164-4LP | |
40kDa FITC-conjugated Dextran | Sigma-Aldrich | FD40S | |
Additional Culture Reagents | |||
CHIR-99021 | Selleck Chem | S2924 | Small molecule GSK-3 inhibitor |
Human recombinant VEGF | Peprotech | 100-20 | |
Human recombinant bFGF | Peprotech | AF-100-18B |