Micropatterning och montering av 3D mikrokärl
Summary
Detta manuskript presenterar en formsprutnings metod för att konstruera mikrokärl som rekapitulera fysiologiska egenskaper endotel. Den mikroflödesbaserad process skapar patent 3D vaskulära nätverk med tailorable förhållanden, såsom flöde, cellulära sammansättning, geometri, och biokemiska gradienter. Tillverkningsprocessen och exempel på möjliga tillämpningar beskrivs.
Abstract
In vitro plattformar för att studera endotelceller och kärlbiologi är i stort sett begränsade till 2D endotelceller kultur, flödeskammare med polymer eller glasbaserade substrat, och hydrogel-baserade rör bildningsanalyser. Dessa analyser, medan informativ, inte rekapitulera lumen geometri, ordentlig extracellulära matrisen och flercelliga närhet, som spelar nyckelroller i att modulera vaskulär funktion. Detta manuskript beskriver en formsprutningsmetod för att generera Engineered fartyg med diametrar av storleksordningen 100 ^ m. Mikrokärl tillverkas genom ympning endotelceller i en mikroflödessystem kanal inbäddad i en infödd typ I-kollagen hydrogel. Genom att införliva parenkymceller i kollagenmatrisen före kanalbildning, kan specifika vävnadsmikromiljöer modelleras och studeras. Ytterligare moduleringar av hydrodynamiska egenskaper och media sammansättning möjliggör styrning av komplexa kärlfunktionen inom det önskade mikromiljö.Denna plattform gör det möjligt för studier av perivaskulär cell rekrytering, blod endotel interaktioner, flöde svar och vävnads mikrovaskulära interaktioner. Engineered mikrokärl erbjuder möjligheten att isolera påverkan från enskilda komponenter i en kärl nisch och exakt kontrollera kemiska, mekaniska och biologiska egenskaper för att studera vaskulär biologi i både hälsa och sjukdom.
Introduction
Mikrovaskulaturen i varje organ hjälper till att definiera den vävnadsmikromiljö, underhålla vävnadshomeostas och reglera inflammation, permeabilitet, trombos och fibrinolys 1,2. Mikrokärlendotel, i synnerhet, är gränssnittet mellan blodflödet och den omgivande vävnaden och spelar därför en viktig roll i att modulera vaskulär och organfunktion som svar på stimuli såsom hydrodynamiska krafter och cirkulerande cytokiner och hormoner 3 – 5. Att förstå de detaljerade interaktioner mellan endotelet, blod, och den omgivande vävnaden mikro är viktig för att studera vaskulär biologi och sjukdomsprogression. Däremot har framsteg i att studera dessa interaktioner hindrats av begränsade in vitro verktyg som inte rekapitulera in vivo mikrovaskulära struktur och funktion 6,7. Som ett resultat har området och terapeutisk avancemang relied tungt på kostsamma och tids-krävande djurmodeller som ofta misslyckas med att översätta till framgång i människor 8 – 10. Medan in vivo-modeller är ovärderliga för studier av sjukdomsmekanismer och vaskulära funktioner, de är komplexa och ofta saknar exakt kontroll av enskilda cellulära, biokemiska och biofysiska signaler.
Kärl hela kroppen har en mogen hierarkisk struktur i samband med expansiva kapillärbäddar, vilket ger optimerad perfusion och näringstransport samtidigt 11. Inledningsvis kärlformer som en primitiv plexus som omorganiserar till ett hierarkiskt förgrenad nätverk under tidig utveckling 12,13. Även om många av de som är inblandade i dessa processer signaler väl förstått 14-16, är det fortfarande svårfångade hur en sådan vaskulär mönstring bestäms 15. I sin tur, rekapitulera denna process in vitro för att konstruera organiserade vaskulära nätverk har been svåra. Många befintliga in vitro-plattformar för att modellera vaskulatur, såsom tvådimensionella endoteliala cellkulturer, saknar viktiga egenskaper såsom flercelliga närhet, tredimensionellt luminal geometri, flöde, och extracellulära matrisen. Tube bildningsanalyser i 3D hydrogeler (kollagen eller fibrin) 17 – 19 eller invasionsanalyser 20,21 har använts för att studera endotelfunktion i 3D och deras interaktioner med andra vaskulära 17,22 eller vävnadscelltyper 23. Men monterade lumen i dessa analyser saknar sammankoppling, hemodynamiska flöde och lämpliga perfusion. Vidare benägenheten för vaskulär regression i dessa rörbildning analyser 24 förhindrar långtidsodling och mognad vilket begränsar graden av funktionella studier som kan utföras. Det finns således en växande behov av att konstruera in vitro plattformar mikrovaskulära nätverk som på lämpligt sätt kan modellera svdothelial egenskaper och är i stånd att långtidsodling.
En mängd av vaskulära modifieringstekniker har vuxit fram under årens lopp för medicinska tillämpningar för att ersätta eller bypass påverkas fartyg hos patienter med kärlsjukdom. Fartyg med stor diameter tillverkade av syntetiska material såsom polyetylentereftalat (PET), och polytetrafluoretylen (ePTFE) har haft betydande terapeutisk framgång med långtidsöppenhet (genomsnitt 95% öppenhet över 5 år) 25. Även liten diameter syntetiska transplantat (<6 mm) vanligtvis möter komplikationer såsom intimal hyperplasi och thrombopoiesis 26-28, vävnadstekniska transplantat med liten diameter som gjorts med biologiskt material har gjort betydande framsteg 29,30. Trots framsteg av detta slag har konstruerade fartyg på mikro förblev en utmaning. Att adekvat modellera mikrovaskulaturen, är det nödvändigt att generera komplexa nätverksmönster med suflig mekanisk styrka för att bibehålla öppenhet och med en matriskomposition som gör det möjligt för både närings permeation för parenkymala celler och cellulära ombyggnad.
Detta protokoll presenterar en ny konstgjord perfusable fartyg nätverk som härmar en infödd in vivo miljö med en avstämbar och kontrollerbar mikro 31-34. Den beskrivna metoden genererar Engineered mikrokärl med diametrar i storleksordningen 100 nm. Engineered mikrokärl tillverkas genom perfusion endotelceller genom en mikroflödessystem kanal som är inbäddad i mjuk typ I-kollagen hydrogel. Detta system har kapacitet att generera mönstrade nätverk med öppen luminal struktur, replikera flera cellulära interaktioner, modulera extracellulär matriskomposition, och tillämpa fysiologiskt relevanta hemodynamiska krafter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Engineered mikrokärl är ett in vitro-modell där fysiologiska egenskaper såsom luminal geometri, hydrodynamiska krafter, och multi-cellulära interaktioner är närvarande och avstämbar. Denna typ av plattform är kraftfull i att det ger möjlighet att modellera och studera endothelial beteende i en mängd olika sammanhang där in vitro odlingsbetingelser i kan matchas med den för mikro i fråga. Till exempel, de mekanismer som driver endotelceller processer, såsom angiogenes, är kända…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka för det Lynn och Mike Garvey Imaging Laboratory vid Institutet för Stem Cell och regenerativ medicin samt Washington Nanoteknik Facility vid University of Washington. De erkänner också ekonomiskt stöd från National Institute of Health ger DP2DK102258 (till YZ) och utbildningsbidrag T32EB001650 (till SSK och MAR) och T32HL007312 (MAR).
Materials
| Wafer Fabrication | |||
| AutoGlow Plasma System | AutoGlow | ||
| Headway Spin Coater | Headway Research, Inc | PWM32 Spin Coater | |
| ABM Contact Aligner | AB-M | ||
| Alpha Step Profilometer | Tencor | Alpha Step 200 | |
| SU-8 Developer | Microchem | Y020100 | |
| SU-8 Resist | Microchem | SU-8 2000 | |
| 8" silicon wafer | Wafer World Inc. | ||
| Tabletop Micro Pattern Generator | Heidelberg Instruments | μPG 101 | For generation of photomask |
| Hot plate | VWR | 97042-646 | |
| Ispropyl alcohol | Avantor Performance Materials | 9088 | |
| Petri dishes (120 x 120 mm, square) | Sigma-Aldrich | Z617679 | |
| Trichloro(3,3,3-trifluoropropyl)silane | Sigma-Aldrich | MKBG3805V | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer base and curing agent | Dow Corning | Sylgard 184 | Mixed at 10:1 (w/w) |
| Vacuum desiccator | Sigma-Aldrich | Z119024-1EA | |
| Oven | VWR | 9120976 | |
| Device Fabrication and Culture | |||
| poly(methyl methacrylate) (PMMA) | Plexiglas | ||
| Corona Treater | Electro-Technic Products, Inc. | BD-20 | Handheld device for plasma treatment of PMMA devices and PDMS molds |
| Soldering Iron | Weller | WTCPS | |
| Stainless Steel Truss Head Slotted Machine Screw | McMaster-Carr | 91785A096 | |
| Stainless steel dowel pins | McMaster-Carr | 93600A060 | |
| Tweezers | Miltex | 24-572 | Any similar tweezers may be used |
| Spatula (Micro Spoon) | Electron Microscopy Services | 62410-01 | |
| Screw driver | Any flat head screwdriver may be used, autoclaved | ||
| Glass coverslips (22 x 22 mm) | Fisher Scientific | 12-542B | |
| Bleach | Clorox | 4460030966 | |
| Petri dishes (150 X 25mm) | Corning | 430599 | |
| Petri dishes (100 X 20 mm) | Corning | 2909 | |
| Cotton, cut into 1 cm x 3 cm pieces | Autoclaved | ||
| Polyethyleneimine (PEI) | Sigma-Aldrich | P3143 | Dilute to 1% in cell culture grade water |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G6257 | Dilute to 0.1% in cell culture grade water |
| Sterile H2O | Autoclaved DI H2O | ||
| Type I collagen, dissolved in 0.1% acetic acid | Isolated from rat tails as described in Rajan et. al. 2006 (ref #37) | ||
| 1 mL syringe | BD | 309659 | |
| 10 mL syringe | BD | 309604 | |
| 15 mL conical tubes | Corning | 352097 | |
| 30 mL conical tubes | Corning | 352098 | |
| M199 10X Media | Life Technologies | 11825-015 | |
| 1N NaOH (sterile) | Sigma-Aldrich | 415413 | Dilute to 1N in cell culture grade water |
| HUVECs | Lonza | ||
| Endothelial growth media | Lonza | CC-3124 | |
| Trypsin | Corning | 25-052-CI | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermofisher Scientific | 10082147 | |
| Dextran from Leuconostoc spp. (70kDa) | Sigma-Aldrich | 31390 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-031-CV | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific Co. | 3200 | |
| Gel loading tips | VWR | 37001-152 | |
| 18G Blunt Fill Needle | BD | 305180 | |
| 20G Stainless Steel Dispensing Needle | McMaster-Carr | 75165A123 | |
| Tygon 1/32” ID, 3/32" OD Silicon Tubing | Cole-Parmer | EW-95702-00 | |
| 1/16" Tube-to-tube Coupling | McMaster-Carr | 5116K165 | |
| 90° Elbow Connectors, Tube-to-Tube | McMaster-Carr | 5121K901 | |
| Luer Lock Coupling (Female, 1/16" ID) | McMaster-Carr | 51525K211 | |
| Plastic Forceps, with Jaw Grips | Electron Microscopy Services | 72971 | |
| Dual Syringe Pump | Harvard Apparatus | 70-4505 | |
| 5 mL Polystyrene Round-bottom tube | Fisher Scientific | 14-959-2A | |
| Device Analysis | |||
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A8806-5G | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-9284 | |
| Rabbit anti-hCD31 | Abcam | ab32457 | 1:25 working dilution |
| FITC conjugated anti-von Willebrand Factor antibody | Abcam | ab8822 | 1:100 working dilution |
| Goat anti-rabbit 568 secondary antibody | Thermofisher Scientific | A-11011 | 1:100 working dilution |
| Hoescht | Thermofisher Scientific | H1399 | Resuspended in DMSO |
| Sodium cacodylate | Sigma-Aldrich | C0250 | To make 0.2M cacodylate buffer |
| Ethanol | VWR International | BDH1164-4LP | |
| 40kDa FITC-conjugated Dextran | Sigma-Aldrich | FD40S | |
| Additional Culture Reagents | |||
| CHIR-99021 | Selleck Chem | S2924 | Small molecule GSK-3 inhibitor |
| Human recombinant VEGF | Peprotech | 100-20 | |
| Human recombinant bFGF | Peprotech | AF-100-18B | |
References
- Rubanyi, G. M. The role of endothelium in cardiovascular homeostasis and diseases. J. Cardiovasc. Pharmacol. 22, 37-44 (1993).
- van Hinsbergh, V. W. The endothelium: vascular control of haemostasis. Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. 95 (2), 198-201 (2001).
- Chiu, J. -. J., Chien, S. Effects of Disturbed Flow on Vascular Endothelium: Pathophysiological Basis and Clinical Perspectives. Physiol. Rev. 91, 327-387 (2011).
- Qi, Y., Jiang, J., et al. PDGF-BB and TGB-b1 on cross-talk between endothelial and smooth muscle cells in vascular remodeling induced by low shear stress. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 1908-1913 (2011).
- Sozzani, S., Del Prete, A., Bonecchi, R., Locati, M. Chemokines as effector and target molecules in vascular biology. Cardiovasc. Res. 107 (3), 364-372 (2015).
- Huh, D., Hamilton, G. A., Ingber, D. E. From 3D cell culture to organs-on-chips. Trends Cell Biol. 21 (12), 745-754 (2011).
- Staton, C. a., Reed, M. W. R., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. Int. J. Exp. Pathol. 90, 195-221 (2009).
- Greek, R., Menache, A. Systematic Reviews of Animal Models: Methodology versus Epistemology. Int. J. Med. Sci. 10, 206-221 (2013).
- van der Worp, H. B., Howells, D. W., et al. Can Animal Models of Disease Reliably Inform Human Studies. PLoS Med. 7 (3), e1000245 (2010).
- Leong, X. -. F., Ng, C. -. Y., Jaarin, K. Animal Models in Cardiovascular Research: Hypertension and Atherosclerosis. Biomed Res. Int. 2015, 528757 (2015).
- Pries, A. R., Secomb, T. W. Making Microvascular Networks Work: Angiogenesis, Remodeling, and Pruning. Physiology. 29, 446-455 (2014).
- D’Amore, P. Mechanisms Of Angiogenesis. Annu. Rev. Physiol. 49, 453-464 (1987).
- Geudens, I., Gerhardt, H. Coordinating cell behaviour during blood vessel formation. Development. 138, 4569-4583 (2011).
- Ribatti, D., Nico, B., Crivellato, E. The development of the vascular system: a historical overview. Methods Mol. Biol. 1214, 1-14 (2015).
- Ribatti, D., Nico, B., Crivellato, E. Morphological and molecular aspects of physiological vascular morphogenesis. Angiogenesis. 12 (2), 101-111 (2009).
- Bautch, V. L. VEGF-directed blood vessel patterning: From cells to organism. Cold Spring Harb. Perspect. Med. 2 (9), 1-12 (2012).
- Stratman, A. N., Schwindt, A. E., Malotte, K. M., Davis, G. E. Endothelial-derived PDGF-BB and HB-EGF coordinately regulate pericyte recruitment during vasculogenic tube assembly and stabilization. Blood. 116, 4720-4730 (2010).
- Bach, T. L., Barsigian, C., et al. VE-Cadherin mediates endothelial cell capillary tube formation in fibrin and collagen gels. Exp. Cell Res. 238 (238), 324-334 (1998).
- Kubow, K. E., Conrad, S. K., Horwitz, a. R. Matrix microarchitecture and myosin II determine adhesion in 3D matrices. Curr. Biol. 23 (17), 1607-1619 (2013).
- Potapova, I. A., Gaudette, G. R., et al. Mesenchymal Stem Cells Support Migration, Extracellular Matrix Invasion, Proliferation, and Survival of Endothelial Cells In Vitro. Stem Cells. 25 (7), 1761-1768 (2007).
- Bayless, K. J., Davis, G. E. Sphingosine-1-phosphate markedly induces matrix metalloproteinase and integrin-dependent human endothelial cell invasion and lumen formation in three-dimensional collagen and fibrin matrices. Biochem. Biophys. Res. Commun. 312 (4), 903-913 (2003).
- Hellström, M., Gerhardt, H., et al. Lack of pericytes leads to endothelial hyperplasia and abnormal vascular morphogenesis. J. Cell Biol. 152 (3), 543-553 (2001).
- Tulloch, N. L., Muskheli, V., et al. Growth of Engineered Human Myocardium With Mechanical Loading and Vascular Coculture. Circ. Res. 109, 47-59 (2011).
- Davis, G. E., Saunders, W. B. Molecular balance of capillary tube formation versus regression in wound repair: role of matrix metalloproteinases and their inhibitors. J. Investig. dermatology Symp. 11 (1), 44-56 (2006).
- Kannan, R. Y., Salacinski, H. J., Butler, P. E., Hamilton, G., Seifalian, A. M. Current status of prosthetic bypass grafts: a review. J. Biomed. Mater. Res. B. Appl. Biomater. 74, 570-581 (2005).
- Nerem, R. M., Seliktar, D. Vascular Tissue Engineering. Annu. Rev. Biomed. Eng. 3 (1), 225-243 (2001).
- Melchiorri, A. J., Hibino, N., Fisher, J. P. Strategies and techniques to enhance the in situ endothelialization of small-diameter biodegradable polymeric vascular grafts. Tissue Eng. Part B. Rev. 19 (4), 292-307 (2013).
- Abbott, W. M., Callow, A., Moore, W., Rutherford, R., Veith, F., Weinberg, S. Evaluation and performance standards for arterial prostheses. J. Vasc. Surg. 17 (4), 746-756 (1993).
- Niklason, L. E. Functional Arteries Grown in Vitro. Science. 284 (5413), 489-493 (1999).
- Niklason, L., Counter, C. Blood vessels engineered from human cells – Authors’ reply. Lancet. 366 (9489), 892-893 (2005).
- Zheng, Y., Chen, J., et al. In vitro microvessels for the study of angiogenesis and thrombosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 9342-9347 (2012).
- Zheng, Y., Chen, J., Lòpez, J. A. Flow-driven assembly of VWF fibres and webs in in vitro microvessels. Nat. Commun. 6, 7858 (2015).
- Ligresti, G., Nagao, R. J., et al. A Novel Three-Dimensional Human Peritubular Microvascular System. J. Am. Soc. Nephrol. 27, (2015).
- Roberts, M. A., Tran, D., et al. Stromal cells in dense collagen promote cardiomyocyte and microvascular patterning in engineered human heart tissue. Tissue Eng. Part A. , (2016).
- Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nat. Protoc. 5 (3), 491-502 (2010).
- . Alpha-Step 200 Manual. Tencor Instruments. , (1989).
- Rajan, N., Habermehl, J., Coté, M. -. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nat. Protoc. 1 (6), 2753-2758 (2006).
- Baudin, B., Bruneel, A., Bosselut, N., Vaubourdolle, M. A protocol for isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells. Nat. Protoc. 2 (3), 481-485 (2007).
- Leung, A. D., Wong, K. H. K., Tien, J. Plasma expanders stabilize human microvessels in microfluidic scaffolds. J. Biomed. Mater. Res. – Part A. 100 (7), 1815-1822 (2012).
- . Tousimis SAMDRI-780 Critical Point Drying Apparatus. Tousimis Research Corporation. , (1987).
- Palpant, N. J., Pabon, L., et al. Inhibition of β-catenin signaling respecifies anterior-like endothelium into beating human cardiomyocytes. Development. 142 (18), 3198-3209 (2015).
- Gimbrone, M. a., Topper, J. N., Nagel, T., Anderson, K. R., Garcia-Cardena, G. Endothelial Dysfunction, Hemodynamic Forces, and Atherogenesis. Thromb. Haemost. 82, 722-726 (1999).
- Wu, M. H., Ustinova, E., Granger, H. J. Integrin binding to fibronectin and vitronectin maintains the barrier function of isolated porcine coronary venules. J. Physiol. 532 (3), 785-791 (2001).
- Ribatti, D., Nico, B., Vacca, A., Roncali, L., Dammacco, F. Endothelial cell heterogeneity and organ specificity. J. Hematother. Stem Cell Res. 11, 81-90 (2002).
- Shanks, N., Greek, R., Greek, J. Are animal models predictive for humans. Philos. Ethics. Humanit. Med. 4, 2 (2009).
