Micropatterning e Montagem de microvasos 3D
Summary
Este manuscrito apresenta um método de moldagem por injeção para engenheiro microvasos que recapitulam propriedades fisiológicas de endotélio. O processo baseado em microfluídico cria redes vasculares 3D patente com condições tailorable, tais como fluxo, composição celular, geometria e gradientes bioquímicos. O processo de fabricação e exemplos de aplicações potenciais são descritos.
Abstract
Em plataformas in vitro para estudar as células endoteliais e biologia vascular são largamente limitadas à cultura de células endoteliais 2D, câmaras de fluxo com o polímero ou com base substratos de vidro, e ensaios de formação de tubos à base de hidrogel. Estes ensaios, enquanto informativo, não recapitular geometria luz, matriz extracelular adequada, e proximidade multi-celular, que desempenham um papel-chave na modulação da função vascular. Este manuscrito descreve um método de moldagem por injeção para gerar vasos artificiais, com diâmetros da ordem de 100 mm. Microvasos são fabricados semeando células endoteliais em um canal microfluídico incorporado dentro de um tipo nativo I colágeno hidrogel. Ao incorporar nas células do parênquima dentro da matriz de colagénio antes da formação de canal, microambientes específicos de tecido podem ser modelados e estudados. modulações adicionais de propriedades e meios de comunicação hidrodinâmico composição permitir o controlo da função vascular complexa dentro do microambiente desejado.Essa plataforma permite o estudo de recrutamento perivascular de células, as interacções do sangue do endotélio, a resposta de fluxo, e as interacções de tecidos-microvascular. microvasos Engineered oferecer a capacidade de isolar a influência de componentes individuais de um nicho vascular e controlar com precisão as suas químicas, mecânicas e propriedades biológicas para estudar a biologia vascular na saúde e na doença.
Introduction
A microvasculatura em cada órgão ajuda a definir o microambiente tecido, manter a homeostase do tecido e regular a inflamação, a permeabilidade, a trombose, e fibrinólise 1,2. Endotélio microvascular, em particular, é a interface entre o fluxo de sangue e o tecido circundante e, por conseguinte, desempenha um papel crítico na modulação da função do órgão e vascular em resposta a estímulos, tais como as forças hidrodinâmicas e citoquinas e hormonas circulantes 3 - 5. Compreendendo as interacções específicas entre o endotélio, o sangue, e o microambiente circundante do tecido é importante para o estudo da biologia vascular e a progressão da doença. No entanto, o progresso em estudar essas interações tem sido dificultada pela limitação em ferramentas in vitro que não recapitulam na estrutura microvascular vivo e função 6,7. Como resultado, o campo e avanço terapêutico tem se baseou fortemente em caro e tempo-consumir modelos animais, que muitas vezes não conseguem traduzir para o sucesso em seres humanos 8 – 10. Enquanto modelos in vivo são de valor inestimável no estudo dos mecanismos da doença e funções vasculares, eles são complexos e muitas vezes não têm controle preciso do indivíduo celulares, bioquímicos e biofísicos pistas.
Vasculatura por todo o corpo possui uma estrutura hierárquica madura em conjunto com leitos capilares expansivas, proporcionando perfusão otimizado e transporte de nutrientes simultaneamente 11. Inicialmente, as formas vasculatura como um plexo primitiva, que reorganiza a uma rede hierarquicamente ramificada durante o desenvolvimento precoce 12,13. Embora muitos dos sinais envolvidos nestes processos são bem compreendidos 14-16, permanece elusiva como tal modelação vascular é determinada 15. Por sua vez, recapitulando este processo in vitro para projetar redes vasculares organizados tem a abelhan. Muitas in vitro plataformas difíceis existentes para modelar vasculatura, tais como culturas de células endoteliais duas dimensões, não têm características importantes, tais como a proximidade de multi-celular, três luminal geometria dimensional, fluxo, e a matriz extracelular. Tubo de ensaios de formação em hidrogéis 3D (colágeno ou fibrina) 17 – 19 ou invasão ensaios 20,21 têm sido utilizados para estudar a função endotelial em 3D e suas interações com outros vasculares 17,22 ou de células do tecido tipos 23. No entanto, montados em lúmens estes ensaios não têm interconectividade, fluxo hemodinâmico, e perfusão adequada. Além disso, a propensão para a regressão vascular nestes ensaios de formação de tubo 24 evita a cultura a longo prazo e a maturação o que limita o grau de estudos funcionais que podem ser executadas. Assim, há uma necessidade crescente de engenheiro em plataformas in vitro de redes microvasculares que podem modelar adequadamente enendotelial características e são capazes de cultura a longo prazo.
Uma variedade de técnicas de engenharia vasculares têm surgido ao longo dos anos para aplicações médicas para substituir ou vasos de bypass afetados em pacientes com doença vascular. Vasos de grande diâmetro feitas de materiais sintéticos, tais como tereftalato de polietileno (PET), e politetrafluoroetileno (ePTFE) tiveram sucesso terapêutico considerável com permeabilidade longo prazo (média desobstrução de 95% mais de 5 anos) 25. Apesar de pequeno diâmetro enxertos sintéticos (<6 mm) geralmente enfrentam complicações como a hiperplasia da íntima e trombopoiese 26 – 28, da engenharia de tecidos enxertos de pequeno diâmetro feitos com material biológico fizeram progressos significativos 29,30. Apesar dos avanços desse tipo, vasos de engenharia em microescala mantiveram-se um desafio. Para modelar adequadamente a microcirculação, é necessário para gerar padrões de rede complexos com sufficiente de resistência mecânica para manter a desobstrução, e com uma composição da matriz que permite tanto a permeação de nutrientes para as células parenquimatosas e remodelação celular.
Este protocolo apresenta um romance rede de vasos perfusable artificial que imita um nativo in vivo configuração com um ajustável e controlável microambiente 31-34. O método descrito gera microvasos artificiais, com diâmetros na ordem de 100 um. microvasos engenharia são fabricados por perfusão células endoteliais através de um canal microfluídico que está incorporado dentro do tipo macio I colágeno hidrogel. Este sistema tem a capacidade de gerar redes estampados com estrutura luminal aberta, replicar interações multi-celulares, modular a composição da matriz extracelular, e aplicar forças hemodinâmicas fisiologicamente relevantes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Engineered microvasos são um modelo in vitro onde as características fisiológicas, tais como a geometria do lúmen, as forças hidrodinâmicas, e interacções multi-celulares estão presentes e sintonizável. Este tipo de plataforma é poderosa na medida em que oferece a capacidade para modelar e estudar o comportamento endotelial numa variedade de contextos em que as condições de cultura in vitro podem ser combinados com a do microambiente em questão. Por exemplo, os mecanismos de condução pr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de reconhecer a Lynn e Mike Garvey imagem Laboratório do Instituto de Células Estaminais e Medicina Regenerativa, bem como o Mecanismo de Washington Nanofabricação da Universidade de Washington. Eles também agradecem o apoio financeiro do Instituto Nacional de Saúde concede DP2DK102258 (para YZ) e formação concede T32EB001650 (a SSK e MAR) e T32HL007312 (MAR).
Materials
| Wafer Fabrication | |||
| AutoGlow Plasma System | AutoGlow | ||
| Headway Spin Coater | Headway Research, Inc | PWM32 Spin Coater | |
| ABM Contact Aligner | AB-M | ||
| Alpha Step Profilometer | Tencor | Alpha Step 200 | |
| SU-8 Developer | Microchem | Y020100 | |
| SU-8 Resist | Microchem | SU-8 2000 | |
| 8" silicon wafer | Wafer World Inc. | ||
| Tabletop Micro Pattern Generator | Heidelberg Instruments | μPG 101 | For generation of photomask |
| Hot plate | VWR | 97042-646 | |
| Ispropyl alcohol | Avantor Performance Materials | 9088 | |
| Petri dishes (120 x 120 mm, square) | Sigma-Aldrich | Z617679 | |
| Trichloro(3,3,3-trifluoropropyl)silane | Sigma-Aldrich | MKBG3805V | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer base and curing agent | Dow Corning | Sylgard 184 | Mixed at 10:1 (w/w) |
| Vacuum desiccator | Sigma-Aldrich | Z119024-1EA | |
| Oven | VWR | 9120976 | |
| Device Fabrication and Culture | |||
| poly(methyl methacrylate) (PMMA) | Plexiglas | ||
| Corona Treater | Electro-Technic Products, Inc. | BD-20 | Handheld device for plasma treatment of PMMA devices and PDMS molds |
| Soldering Iron | Weller | WTCPS | |
| Stainless Steel Truss Head Slotted Machine Screw | McMaster-Carr | 91785A096 | |
| Stainless steel dowel pins | McMaster-Carr | 93600A060 | |
| Tweezers | Miltex | 24-572 | Any similar tweezers may be used |
| Spatula (Micro Spoon) | Electron Microscopy Services | 62410-01 | |
| Screw driver | Any flat head screwdriver may be used, autoclaved | ||
| Glass coverslips (22 x 22 mm) | Fisher Scientific | 12-542B | |
| Bleach | Clorox | 4460030966 | |
| Petri dishes (150 X 25mm) | Corning | 430599 | |
| Petri dishes (100 X 20 mm) | Corning | 2909 | |
| Cotton, cut into 1 cm x 3 cm pieces | Autoclaved | ||
| Polyethyleneimine (PEI) | Sigma-Aldrich | P3143 | Dilute to 1% in cell culture grade water |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G6257 | Dilute to 0.1% in cell culture grade water |
| Sterile H2O | Autoclaved DI H2O | ||
| Type I collagen, dissolved in 0.1% acetic acid | Isolated from rat tails as described in Rajan et. al. 2006 (ref #37) | ||
| 1 mL syringe | BD | 309659 | |
| 10 mL syringe | BD | 309604 | |
| 15 mL conical tubes | Corning | 352097 | |
| 30 mL conical tubes | Corning | 352098 | |
| M199 10X Media | Life Technologies | 11825-015 | |
| 1N NaOH (sterile) | Sigma-Aldrich | 415413 | Dilute to 1N in cell culture grade water |
| HUVECs | Lonza | ||
| Endothelial growth media | Lonza | CC-3124 | |
| Trypsin | Corning | 25-052-CI | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermofisher Scientific | 10082147 | |
| Dextran from Leuconostoc spp. (70kDa) | Sigma-Aldrich | 31390 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-031-CV | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific Co. | 3200 | |
| Gel loading tips | VWR | 37001-152 | |
| 18G Blunt Fill Needle | BD | 305180 | |
| 20G Stainless Steel Dispensing Needle | McMaster-Carr | 75165A123 | |
| Tygon 1/32” ID, 3/32" OD Silicon Tubing | Cole-Parmer | EW-95702-00 | |
| 1/16" Tube-to-tube Coupling | McMaster-Carr | 5116K165 | |
| 90° Elbow Connectors, Tube-to-Tube | McMaster-Carr | 5121K901 | |
| Luer Lock Coupling (Female, 1/16" ID) | McMaster-Carr | 51525K211 | |
| Plastic Forceps, with Jaw Grips | Electron Microscopy Services | 72971 | |
| Dual Syringe Pump | Harvard Apparatus | 70-4505 | |
| 5 mL Polystyrene Round-bottom tube | Fisher Scientific | 14-959-2A | |
| Device Analysis | |||
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A8806-5G | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-9284 | |
| Rabbit anti-hCD31 | Abcam | ab32457 | 1:25 working dilution |
| FITC conjugated anti-von Willebrand Factor antibody | Abcam | ab8822 | 1:100 working dilution |
| Goat anti-rabbit 568 secondary antibody | Thermofisher Scientific | A-11011 | 1:100 working dilution |
| Hoescht | Thermofisher Scientific | H1399 | Resuspended in DMSO |
| Sodium cacodylate | Sigma-Aldrich | C0250 | To make 0.2M cacodylate buffer |
| Ethanol | VWR International | BDH1164-4LP | |
| 40kDa FITC-conjugated Dextran | Sigma-Aldrich | FD40S | |
| Additional Culture Reagents | |||
| CHIR-99021 | Selleck Chem | S2924 | Small molecule GSK-3 inhibitor |
| Human recombinant VEGF | Peprotech | 100-20 | |
| Human recombinant bFGF | Peprotech | AF-100-18B | |
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