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Bioengineering

Micropatterning e Montagem de microvasos 3D

doi: 10.3791/54457 Published: September 9, 2016
* These authors contributed equally

Summary

Este manuscrito apresenta um método de moldagem por injeção para engenheiro microvasos que recapitulam propriedades fisiológicas de endotélio. O processo baseado em microfluídico cria redes vasculares 3D patente com condições tailorable, tais como fluxo, composição celular, geometria e gradientes bioquímicos. O processo de fabricação e exemplos de aplicações potenciais são descritos.

Abstract

Em plataformas in vitro para estudar as células endoteliais e biologia vascular são largamente limitadas à cultura de células endoteliais 2D, câmaras de fluxo com o polímero ou com base substratos de vidro, e ensaios de formação de tubos à base de hidrogel. Estes ensaios, enquanto informativo, não recapitular geometria luz, matriz extracelular adequada, e proximidade multi-celular, que desempenham um papel-chave na modulação da função vascular. Este manuscrito descreve um método de moldagem por injeção para gerar vasos artificiais, com diâmetros da ordem de 100 mm. Microvasos são fabricados semeando células endoteliais em um canal microfluídico incorporado dentro de um tipo nativo I colágeno hidrogel. Ao incorporar nas células do parênquima dentro da matriz de colagénio antes da formação de canal, microambientes específicos de tecido podem ser modelados e estudados. modulações adicionais de propriedades e meios de comunicação hidrodinâmico composição permitir o controlo da função vascular complexa dentro do microambiente desejado.Essa plataforma permite o estudo de recrutamento perivascular de células, as interacções do sangue do endotélio, a resposta de fluxo, e as interacções de tecidos-microvascular. microvasos Engineered oferecer a capacidade de isolar a influência de componentes individuais de um nicho vascular e controlar com precisão as suas químicas, mecânicas e propriedades biológicas para estudar a biologia vascular na saúde e na doença.

Introduction

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A microvasculatura em cada órgão ajuda a definir o microambiente tecido, manter a homeostase do tecido e regular a inflamação, a permeabilidade, a trombose, e fibrinólise 1,2. Endotélio microvascular, em particular, é a interface entre o fluxo de sangue e o tecido circundante e, por conseguinte, desempenha um papel crítico na modulação da função do órgão e vascular em resposta a estímulos, tais como as forças hidrodinâmicas e citoquinas e hormonas circulantes 3 ​​- 5. Compreendendo as interacções específicas entre o endotélio, o sangue, e o microambiente circundante do tecido é importante para o estudo da biologia vascular e a progressão da doença. No entanto, o progresso em estudar essas interações tem sido dificultada pela limitação em ferramentas in vitro que não recapitulam na estrutura microvascular vivo e função 6,7. Como resultado, o campo e avanço terapêutico tem se baseou fortemente em caro e tempo-consumir modelos animais, que muitas vezes não conseguem traduzir para o sucesso em seres humanos 8 - 10. Enquanto modelos in vivo são de valor inestimável no estudo dos mecanismos da doença e funções vasculares, eles são complexos e muitas vezes não têm controle preciso do indivíduo celulares, bioquímicos e biofísicos pistas.

Vasculatura por todo o corpo possui uma estrutura hierárquica madura em conjunto com leitos capilares expansivas, proporcionando perfusão otimizado e transporte de nutrientes simultaneamente 11. Inicialmente, as formas vasculatura como um plexo primitiva, que reorganiza a uma rede hierarquicamente ramificada durante o desenvolvimento precoce 12,13. Embora muitos dos sinais envolvidos nestes processos são bem compreendidos 14-16, permanece elusiva como tal modelação vascular é determinada 15. Por sua vez, recapitulando este processo in vitro para projetar redes vasculares organizados tem a abelhan. Muitas in vitro plataformas difíceis existentes para modelar vasculatura, tais como culturas de células endoteliais duas dimensões, não têm características importantes, tais como a proximidade de multi-celular, três luminal geometria dimensional, fluxo, e a matriz extracelular. Tubo de ensaios de formação em hidrogéis 3D (colágeno ou fibrina) 17 - 19 ou invasão ensaios 20,21 têm sido utilizados para estudar a função endotelial em 3D e suas interações com outros vasculares 17,22 ou de células do tecido tipos 23. No entanto, montados em lúmens estes ensaios não têm interconectividade, fluxo hemodinâmico, e perfusão adequada. Além disso, a propensão para a regressão vascular nestes ensaios de formação de tubo 24 evita a cultura a longo prazo e a maturação o que limita o grau de estudos funcionais que podem ser executadas. Assim, há uma necessidade crescente de engenheiro em plataformas in vitro de redes microvasculares que podem modelar adequadamente enendotelial características e são capazes de cultura a longo prazo.

Uma variedade de técnicas de engenharia vasculares têm surgido ao longo dos anos para aplicações médicas para substituir ou vasos de bypass afetados em pacientes com doença vascular. Vasos de grande diâmetro feitas de materiais sintéticos, tais como tereftalato de polietileno (PET), e politetrafluoroetileno (ePTFE) tiveram sucesso terapêutico considerável com permeabilidade longo prazo (média desobstrução de 95% mais de 5 anos) 25. Apesar de pequeno diâmetro enxertos sintéticos (<6 mm) geralmente enfrentam complicações como a hiperplasia da íntima e trombopoiese 26 - 28, da engenharia de tecidos enxertos de pequeno diâmetro feitos com material biológico fizeram progressos significativos 29,30. Apesar dos avanços desse tipo, vasos de engenharia em microescala mantiveram-se um desafio. Para modelar adequadamente a microcirculação, é necessário para gerar padrões de rede complexos com sufficiente de resistência mecânica para manter a desobstrução, e com uma composição da matriz que permite tanto a permeação de nutrientes para as células parenquimatosas e remodelação celular.

Este protocolo apresenta um romance rede de vasos perfusable artificial que imita um nativo in vivo configuração com um ajustável e controlável microambiente 31-34. O método descrito gera microvasos artificiais, com diâmetros na ordem de 100 um. microvasos engenharia são fabricados por perfusão células endoteliais através de um canal microfluídico que está incorporado dentro do tipo macio I colágeno hidrogel. Este sistema tem a capacidade de gerar redes estampados com estrutura luminal aberta, replicar interações multi-celulares, modular a composição da matriz extracelular, e aplicar forças hemodinâmicas fisiologicamente relevantes.

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Protocol

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1. Microfabricação de Patterned polidimetilsiloxano (PDMS) com Network Design

  1. De fabricação de wafer criar um modelo negativo do Projeto de Rede
    1. Criar um padrão de rede usando qualquer software assistida por computador (CAD). Certifique-se de que a dimensão diagonal entre a entrada e saída de acordo com a distância entre a entrada e saída reservatórios nos dispositivos da habitação em etapas futuras (ver 2.1.1).
      Nota: O desenho do padrão em si é personalizado de acordo com os objetivos da pesquisa específicas do usuário (veja a Figura 1, por exemplo, padrões).
    2. Gerar uma máscara do padrão de rede usando a impressão de alta resolução ou encomendar um photomask cromo de um fornecedor comercial. Um protocolo mais detalhado do processo de fotolitografia está disponível noutro local 35.
    3. Limpar um wafer 8 "de silício por 5 min a 100 W com tratamento de plasma de oxigênio.
    4. Despeje fotorresiste negativo o suficiente (SU-82.100 funciona bem) sobre a bolacha de tal modo que a formas resistir a uma dose com o diâmetro de 2,5 cm. Usando um aplicador de spin, girar o wafer a 500 rpm com 100 rpm rampa / seg e manter por 10 s. Em seguida, aumentar para 1.600 rpm com 300 rpm / seg e manter por 30 segundos. Nota: A velocidade e rampa precisam ser otimizados para cada condição de laboratório para produzir uma espessura resistir de 150 mm.
    5. Soft-coza a bolacha a 65 ° C durante 7 min, rampa até 95 ° C, com 360 ° C / h, e manter durante 45 min. Se arrefecer lentamente até à temperatura ambiente na placa quente. Imprimir o padrão de navio para o wafer revestido por exposição à luz UV 365 nm sob uma fotomáscara cromo, com a exposição triplo da recomendação do fabricante (350 mJ / cm 2 para uma SU-8 espessura de cerca de 150 mm).
      Nota: Desde SU-8 é um negativo resistir, as regiões expostas (tudo, exceto o design padrão) vai se tornar insolúvel para o desenvolvedor no passo 1.1.7.
    6. Hard-coza a hóstia exposta a 65° C durante 5 min e em rampa até 95 ° C, com 360 ° C / h e manter durante 25 min, em seguida, permitir que a arrefecer lentamente até à temperatura ambiente na placa quente.
    7. Mergulhe o wafer em SU-8 desenvolvedor para 10 - 15 minutos para lavar não exposta resistir, em seguida, limpe com álcool isopropílico e seco sob um fluxo de nitrogénio comprimido. Inspeccionar o padrão sob um microscópio de luz para garantir o SU-8 resistir é bem ligado à bolacha (veja descamação e bolhas indesejáveis).
    8. Medir a espessura das características padrão utilizando um perfilómetro de acordo com as instruções do fabricante 36. Durante a aquisição de medição, evitar regiões de estrutura que são essenciais para a função da rede (isto é, entrada e condutas de saída) como um perfilómetro de contacto com base poderia comprometer a integridade estrutural das características modelado na bolacha. Como alternativa, use um método sem contato (ou seja, profilometer óptico) para evitar este problema completamente.
  2. Generação de modelado e Plano Moldes para Collagen Molding
    Nota: Pega silanos dentro de uma Cobertura de vapores químicos.
    1. Coloque a bolacha em um exsicador com 100 ul de tricloro (3,3,3-trifluoropropil) silano durante 2 horas a silanizar a superfície.
    2. Transferir wafer silanizada em uma praça de Petri 120 x 120 mm. Pour agente misto e desgaseificado PDMS elastómero e a cura (10: 1 w / w rácio) através da bolacha para atingir 4-6 mm de espessura. Despeje PDMS adicionais em um quadrado Petri prato separado 120 x 120 mm para gerar moldes planas, sem padrões. Cura a 65 ° C durante 2 h.
    3. Retirar do forno e permitir que o PDMS-se arrefecer até à temperatura ambiente. Usando um bisturi corte cuidadosamente uma praça em torno do SU-8 e, lentamente, retire o molde PDMS do wafer. Aparar bordos a 30 mm x 30 mm. Para moldes planas, corte PDMS curado sem um padrão impresso em pedaços quadrados cerca de 40 mm x 40 mm.

2. Dispositivos de habitação

  1. fabrication de superior e inferior da carcaça Pieces
    1. Fabricar recipiente que guarda usando poli (metacrilato de metilo) (PMMA). Para fabricar, encomendar as peças de uma loja de máquina padrão com computador numéricos capacidades de moagem controlado (CNC). Ver Figura 1 para uma representação esquemática das peças superior e inferior.
    2. Design a peça superior da caixa (Figura 1D) para incluir uma 20 milímetros x 20 milímetros bem na parte inferior do dispositivo com uma profundidade de 1 mm, dois orifícios de injecção de colagénio (diâmetro de 4 mm) na parte superior do dispositivo localizado nos cantos do poço quadrado, dois reservatórios de entrada e de saída com um diâmetro de 6 mm, e quatro furos de parafuso (3 mm de diâmetro) nos quatro cantos do dispositivo.
      Nota: furos adicionais podem ser perfurados na periferia da peça para fins de manuseamento.
    3. Projetar a peça carcaça inferior (Figura 1E) para incluir um buraco quadrado no meio (dimensões 15 mm x 15 mm) com uma envolvente de 25 mm x 25 mmprateleira com uma profundidade de 0,25 mm. Broca 4 furos com 4-40 discussão. Garantir que os orifícios dos parafusos na parte inferior e superior peças vão alinhar juntos durante etapas de montagem futuras.

3. microvasos fabricação de dispositivos

  1. Preparação de Materiais
    1. Lavar e esterilizar dois conjuntos de pinças, uma espátula de aço inoxidável, uma chave de fenda plana pequena, parafusos de aço inoxidável, e vários passador pinos de aço inoxidável. Para a fabricação dos navios, também autoclave PDMS moldes micropatterned, PDMS quadrados planos, lamelas de vidro (22 x 22 mm), e pedaços de algodão.
    2. Esterilizar as peças PMMA habitacionais em lixívia por pelo menos 1 hora, depois lave com água autoclavada na capa de cultura de tecido duas vezes, e deixar secar ao ar em placas de cultura de tecidos estéreis (150 mm x 25 mm).
  2. Estéril Polietilenoimina-glutaraldeído (PEI - GA) Revestimento
    1. Tratar poços interiores de peças de PMMA secos esterilizadoscom plasma durante cerca de 1 min. Adicionar 1% de polietilenoimina (PEI) para os poços internos (os 20 mm quadrados bem na parte superior e a prateleira 25 milímetros quadrados) na parte inferior das peças de PMMA durante 10 min. Lavar com H2O estéril e deixar secar no capuz de cultura de tecidos.
      Nota: O tempo necessário para o tratamento com plasma é variável, dependendo do dispositivo utilizado - o PEI devem espalhar-se facilmente que indica uma superfície hidrofílica. Se não, tratamento de plasma adicional pode ser necessário.
    2. Aplicar 0,1% de glutaraldeído (GA) em PEI tratada superfícies das peças de PMMA durante 30 min. Lavar duas vezes com água esterilizada e deixar secar.
      Nota: Em etapas futuras, o colágeno vai aderir à superfície revestida através de crosslinking de colágeno com glutaraldeído. Isto ajuda a proteger o gel no seu lugar dentro do dispositivo durante os passos de montagem e futuras ao longo do período de cultura dispositivo.
  3. Colágeno Gel de Preparação
    1. Fabricar navios que utilizam 0,6% - colágeno 1%soluções. Para tornar a 0,75% de colágeno para a fabricação de navio, misture colágeno tipo I solução-mãe (1,5% - isolado do rato caudas 37) com hidróxido de sódio (NaOH), 10x de mídia Supplement (M199) e meios de cultura celular. Mantenha todas as soluções em gelo.
    2. Determinar o volume de colagénio pela seguinte equação, em que V ƒinal é o volume final de gel requerido (geralmente, 1 ml de colagénio por dispositivo é suficiente), colagénio da V é o volume de colagénio estoque necessário, colagénio estoque C é a concentração colagénio do banco de colagénio e C ƒinal é a concentração desejada do colagénio no recipiente.
      equação 1
    3. Usando uma seringa de 1 ml para transferir o volume apropriado de colagénio de estoque para um novo tubo de 30 mL cónico. Determinar os volumes de NaOH neutralizante (V NaOH), M199 10x suplemento media(V 10 X), e meios de cultura celular (1 V X) da seguinte forma e misturar separadamente num tubo de 15 ml:
      equação 2
    4. Adicionar a mistura de reagentes de neutralização (10 V X, NaOH V, V 1 X) para o colagénio alíquota, e usar uma pequena espátula para misturar suavemente a solução até que um gel homogénea. Evitar a introdução de bolhas por agitação lenta e suavemente.
    5. Para incorporar as células dentro da matriz para a concentração desejada (por exemplo, 0,5 - 20 milhões de células / mL), adicionar as células à solução de colagénio depois de ser misturado com os reagentes de neutralização, e continuar a agitar até que as células são distribuídas homogeneamente.
    6. Quando as células são adicionados, ajustar o volume de meios de cultura de células para acomodar o volume adicional, tal como determinado pela equação seguinte, em que as células V </ sub> é o volume necessário de suspensão de células, a densidade celular ƒinal C é a densidade de células desejada no recipiente, a densidade da suspensão de células C é a densidade de células na solução estoque.
      equação 3
  4. Injeção de colágeno - parte superior
    1. Coloque o molde PDMS micropadronadas em 100 mm x 20 milímetros prato. Plasma limpar o molde PDMS durante 1 min.
    2. Alinhar a peça de PMMA superior no topo do molde de PDMS de modo que os reservatórios quadrados no molde estão directamente sob os reservatórios de entrada e de saída (ver Figura 1D - linhas tracejadas). Coloque as cavilhas de aço inoxidável para a entrada e saída buracos reservatório no topo da peça PMMA para manter o acesso claro a partir dos reservatórios para o padrão.
    3. Usando uma seringa de 1 ml para extrair ~ 0,5-0,6 mL de colagénio. Certifique-se de que não há bolhas permanecem na seringa.
    4. Pressione lightly com uma pinça sobre o alojamento superior para garantir o contato nivelada entre o topo peça e do molde PDMS. Injetar colágeno lentamente através de uma porta de injecção no topo da peça PMMA. Verifique se o colágeno preenche o domínio 20 mm x 20 mm acima do padrão e não vazar.
    5. Feche o prato sem empurrando os pinos de guia e permitir ao gel num incubador 37 ° C durante 30 min.
  5. Injeção de colágeno - parte inferior
    1. Coloque uma lamela de vidro 22 x 22 mm no centro da peça de fundo. Usando uma seringa de 1 ml para dispensar ~ 0,25 ml de colagénio uniformemente sobre a lâmina de vidro. Abaixe o PDMS quadrado plano sobre o colágeno, garantindo o PDMS é plana contra o PMMA e não há bolhas de ar. Deixa-se gel a 37 ° C durante 30 min.
  6. conjunto de dispositivo
    1. Depois de a gelificação, adicionar suficiente PBS em torno do pedaço de PDMS plana na parte inferior para envolver o PDMS (cerca de 1 ml). Use uma pinça para remover qualquer ecolágeno XCESS em torno das bordas, e, lentamente, retire a peça PDMS. Adicionar mais PBS no topo do colagénio para manter a hidratação.
    2. Para preparar a parte superior, use uma pinça para pegar a peça superior PMMA e lançá-lo de forma que o molde PDMS está no topo. Adicionar algumas gotas de PBS para a interface, em seguida, rapidamente e firmemente remover o molde PDMS da peça superior de PMMA.
    3. Remova cuidadosamente cavilhas de aço inoxidável do outro lado da PMMA habitação usando outro par de pinças. Adicionar mais alguns gotas de PBS sobre o colágeno micropadronadas. Virar a peça superior PMMA de forma que o colágeno está voltado para baixo e coloque 4 parafusos nos furos de canto.
    4. Cuidadosamente, coloque a parte superior na parte superior da peça da base, alinhando os parafusos com os furos de canto da parte inferior. Não permitir que as duas peças para deslizar uma contra a outra. Use uma chave de fenda para apertar os parafusos com um toque suave. Não aperte demais.
    5. Aspirar o PBS em torno das superfícies de PMMA e coloque uma pequena piECE de algodão sob uma extremidade do dispositivo. Com uma pipeta, remover qualquer PBS dos reservatórios e substituir com meios de cultura celular. Permitir que o dispositivo gel juntos numa incubadora a 37 ° C durante pelo menos 1 h.
  7. Sementeira celular
    1. Culturas de células humanas endoteliais da veia umbilical (HUVECs) em meio de crescimento endotelial, a 37 ° C (CO 2, O 2) até à confluência 38. Sempre que possível, use entre as passagens 4 e 7.
    2. Tripsinizar as células endoteliais por lavagem do frasco de cultura com 6 ml de PBS e, em seguida, adição de 2 ml de tripsina a 0,05% a 37 ° C para dissociar as células. Deixar as células em tripsina até que a maioria das adesões focais foram destacadas e as células são arredondados para cima (isto normalmente leva cerca de 2-3 minutos). Parar a reacção por adição de tripsina de 4 ml de meio de crescimento endotelial contendo soro fetal de bovino (FBS). Lavar o balão com os meios de comunicação várias vezes para assegurar que as células são separadas do balão e recolhernum tubo cónico.
    3. Contar as células utilizando um hemocitómetro e ressuspender-los a uma densidade de 10 milhões de células por ml. Remova toda a mídia de cultura de células de entrada e saída reservatórios. Utilizando uma ponta de 200 ul de carregamento de gel, adicionar 10 ul de suspensão de células no centro do reservatório de entrada. As células devem começar a fluir para dentro da rede de imediato e o revestimento da rede.
    4. Adicionar 200 ul media igualmente a ambos os reservatórios e deixar células anexar e espalhar dentro da rede por pelo menos 1 hora.
  8. Cultura dispositivo
    1. Cultura o dispositivo com o fluxo impulsionado gravidade através da rede por adição de 200 ul de meio de cultura celular para o reservatório de entrada e de 50 ul para o reservatório de descarga. Com este método de cultura, substituir todos os meios de comunicação 12 h para manter a viabilidade endotelial.
      Nota: Se as condições de cultura de fluxo contínuo são desejáveis ​​(para manter a tensão de cisalhamento constante, recolha de mídia na saída, etc.) a syrbomba de Inge pode ser usado em vez de cultura orientada gravidade.
    2. Permitir que as células endoteliais semeadas pelo menos 24 horas para prender e estabilizar antes de aplicar fluxo contínuo. Antes da configuração de fluxo contínuo, manter os dispositivos com as condições de fluxo dirigido por gravidade.
      NOTA: As condições de mídia para fluxo aplicada diferem de cultura impulsionada gravidade. A adição de um expansor de plasma, tais como dextrano, para a mídia estabiliza os microvasos engenharia e impede o colapso vascular durante a perfusão sustentada 39.
    3. Para tornar a mídia para a configuração de fluxo contínuo, dissolver 3,5% dextrano (70 kDa) em meio de crescimento endotelial para a cultura ideal navio. Utilizando uma técnica asséptica, encha 10 ml seringas com meios de crescimento endotelial com 3,5% de dextrano.
    4. Prepara-se uma placa de cultura estéril de fluxo por fusão furos na parede lateral de uma placa de Petri, utilizando um ferro de soldar.
    5. Encaixe 12 "tubo de silicone (1/32" ID) a um acoplamento de bloqueio Luer (Feminino, 1/16 "ID), e um 1 /16 "a conector tubo-a-tubo com um" segmento de tubo na outra extremidade. Inserir uma "agulha cega 20G (independente a partir do cubo de agulha) para a extremidade livre do 1" quarto segmento. Também se preparar um "segmento 3 do tubo ligado a um 90 ° conector articulação do cotovelo de tubo-a-tubo (para ser montado na entrada da caixa). Nos passos subsequentes, o tubo já não vai ser enfiada através do prato preparado e ligado ao 3 "segmento através da agulha G 20. tubulação de saída deve espelhar tubo de entrada, com uma extremidade livre, em vez de um acoplamento de bloqueio Luer. Autoclave todos os segmentos anteriores ao uso.
    6. Rosca de entrada autoclavados e tubulação de saída através de buracos no prato preparado. Anexar 3 "segmentos a 20 g de agulhas internas. Fixe o acoplamento de bloqueio Luer à seringa cheia de media e perfundir media através do tubo usando a bomba de seringa definida com um caudal elevado. Assegure-se que não há bolhas na tubulação ou conectores, uma vez que estes irão impedir o fluxo para o vaso.
    7. Insira o connector conjunta na entrada da habitação. Definir a bomba de seringa para a taxa de fluxo desejada e começar a perfusão.
      NOTA: Este pode ser ajustado, dependendo da geometria do vaso e das condições experimentais de tensões de cisalhamento aplicadas. Para um canal de 100 um de diâmetro, uma velocidade de fluxo de 3 mL / min funciona bem.
    8. Se desejar, recolher perfusato com tubulação de saída preparado inserido em um estéril 5 ml de poliestireno tubo de fundo redondo contendo 500 mL de mídia.
      Nota: Uma pequena quantidade de material é adicionado ao tubo de recolha para evitar a formação de bolhas que podem bloquear o fluxo.
    9. Dependendo da taxa de fluxo, a seringa pode ter de ser recarregado após 24 a 36 h. Isto é feito através da remoção do conector a partir da entrada do invólucro, a substituição da seringa, e meios permitindo a perfundir a uma taxa de fluxo elevada durante vários minutos. Esta sequência assegura que as bolhas não são introduzidas para a tubagem. Redefinir a bomba para a vazão desejada para a cultura, inserir o conector na entrada da habitação, evoltar para a incubadora.

Análise 4. Dispositivo

  1. Análise permeabilidade
    1. Use de 40 kDa FITC-dextrano para visualizar a permeabilidade do vaso in situ. Colocar o recipiente que guarda a um microscópio confocal e focar no plano navio. Adicionam-se 5 jiM de 40 kDa FITC-dextrano para a entrada e a imagem de uma ampliação de 4X, 25 o tempo de exposição mseg, e em um quadro por segundo durante 10 min.
    2. Analisar a série de imagens com o código de análise para estimar a permeabilidade de dextrano através da parede do recipiente para o colagénio (pM / seg) com base em um modelo publicado por Zheng et. ai. 31.
  2. Análise imunocoloração & Imagem Confocal
    1. Para corrigir navios, perfundir com formaldeído a 3,7% através da entrada durante 20 minutos e lavagem por perfusão PBS três vezes (20 minutos por lavagem). Bloco de ligação não específica do anticorpo com 2% de albumina de soro bovino (BSA) e 0,5% de Triton X-100 PErfused através da rede durante 1 h. Perfundir soluções de anticorpos primários durante a noite a 4 ° C e lava-se três vezes com PBS. Perfundir soluções anticorpo secundário durante 1 - 2 h, e lavar novamente com PBS, do mesmo modo.
    2. Captar imagens de imunof luorescência de microvasos in situ utilizando um microscópio confocal com um passo de Z-1? M. Imagem microvasos com uma ampliação de 4X, 10X ou 20X.
      Nota: Ampliação de 4X irá fornecer informações globais estrutura de rede, enquanto 10X e 20X imagens ampliadas irá fornecer detalhes celulares, tais como alongamento, formação de junção, etc.
    3. Analisar as pilhas de imagens usando ImageJ com as projeções Z (imagem / / Z-projeto Stacks), secções transversais (Imagem / vista Pilhas / Orthogonal) e reconstruções 3D (Imagem / Pilhas / Projeto 3D).
  3. Microscopia Eletrônica de Varredura de imagem
    1. Para a análise de microscopia eletrônica, reparo in situ por perfusão meia-força sol de Karnovskybuição (2% de paraformaldeído / glutaraldeído a 2,5% em tampão de cacodilato 0,2 M) durante a noite. Desmontar o vaso e separar cuidadosamente os dois pedaços. Aparar arestas e mergulhar completamente na solução fixadora por vários dias.
    2. Imergir a porção superior espessura do navio em 25% de glutaraldeído, durante 20 minutos e lavar três vezes com PBS (2 min cada). Desidratar em lavagens de etanol em série de 50%, 70%, 85% (2 min cada) e duas lavagens em etanol a 100% (5 min cada).
    3. Preparar a amostra para análise com uma maior desidratação por secagem ponto crítico seguindo o protocolo do fabricante 40. Por pulverização catódica, revestimento do vaso de ouro-paládio (7 nm) e analisar sob um microscópio eletrônico de varredura, com uma tensão de aceleração de 5 kV, tamanho do ponto 3.

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Representative Results

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O navio-plataforma projetada cria microvasculatura funcional incorporado dentro de um tipo natural de colágeno I matriz e permite um controlo apertado do ambiente celular, biofísicos e bioquímicos in vitro. Para fabricar microvasos modificadas, as células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) são perfundidos através da rede microfluídicos embebidos em colágeno onde se fixam para formar um lúmen de patentes e endotélio confluentes. Como ilustrado na Figura 1A-C, a geometria do recipiente pode ser especificamente concebido para responder a perguntas sobre taxa de fluxo, a tortuosidade, a ramificação e ângulos, entre outros. Modulando o caudal através dos microvasos fornece insights sobre o estresse-resposta ao corte de células endoteliais. Anteriormente, o foco tem sido principalmente fabricação em vasos na gama de 100 um de tamanho, no entanto microvasos até 500 mm ou, em alguns casos, tão pequenas quanto 50 um de diâmetro ter sido successfully feita e culta. Exemplos de desobstrução a longo prazo são mostradas, bem como a sobrevivência de microvasos cultivadas sob fluxo impulsionado gravidade (Figura 2A) e de fluxo contínuo aplicada (Figura 2B). As propriedades in vivo -como de microvasos engenharia pode ser demonstrada de várias maneiras. Várias funções endoteliais pode ser medida utilizando esta plataforma, incluindo a função de barreira (Figura 3A), interacções célula-célula e sinalização (Figura 3B), e remodelação angiogénica (Figura 3C). Um aspecto crítico destes microvasos é a sua capacidade de responder a estímulos inflamatórios de um modo relevante biologicamente. Isto é melhor demonstrado através da sua interacção com o sangue total na Figura 4A-C, onde o endotélio não activado está em repouso (Figura 4B) e endotélio activado induz a formação de trombos (Figura 4C). Através da cultura de células endoteliais de differing origens dentro desta plataforma, é possível compreender a heterogeneidade funcional entre as células endoteliais a partir de diferentes fontes. A Figura 5A-C ilustra um exemplo desta heterogeneidade com dois tipos diferentes de células estaminais humanas derivadas de células endoteliais que quando cultivadas no visor do sistema de microvasos drasticamente diferentes fenótipos 41. Ao ajustar os perfis de fluxo, composição celular, e condições de cultura, microvasos engenharia fornecer uma poderosa ferramenta vitro para estudar a biologia endotelial e microvasculatura na saúde e na doença.

figura 1
Figura 1. Esquema de criar redes e Protocolo MicroChannel Fabrication. A geometria da rede vascular podem ser especificamente projetado para gerar padrões de fluxo diferentes. A. Por exemplo, um projeto ramificado terá diminuído fltaxas ow perto do centro (uma redução de 8 vezes de uma grade 3 x 3), resultando em regiões de tensão de cisalhamento variada sobre o endotélio dentro do mesmo vaso 31. B. Uma grade altamente ramificada segue o mesmo princípio como o desenho anterior, mas com um plexo maiores. Com esta concepção, os efeitos de uma redução de 50 vezes na taxa de fluxo, resultando numa redução da taxa de cisalhamento de 10 a 500 s-1 pode ser observado quando uma queda de pressão de 1000 Pa, é aplicada através da rede 32. C. desenhos mais complexos tal como uma rede tortuosa, com cantos afiados 32 pode ser usado para responder a perguntas sobre a resposta endotelial a interrupções no fluxo laminar, que muitas vezes ocorrem em contextos patológicos 42. Microvasos feitos a partir destes padrões terá um diâmetro de 100 -. 150 um D. Há três passos principais durante o fabrico de microcanais. Em primeiro lugar, a porção superior do gabarito carcaça é colocado no topo da PDMS molde modelado de rede de tal modo que a entrada e a saída estão alinhadas. O colagénio I é então injectado para dentro do espaço fechado através das aberturas de injecção (seta preta). Tipicamente, uma mistura de 0,75% de colagénio I é usado para a fabricação. Bem sucedido fabricação de microvasos pode ser conseguido com colagénio tão baixo quanto 0,6%, no entanto, menos do que 0,6%, tipicamente resulta em resistência mecânica insuficiente e colapso canal. E. Uma fina camada de colagénio é adicionado para a parte inferior na parte superior da lamela, e achatada com outra peça PDMS. F. Após a gelificação a 37 ° C, o PDMS moldes são removidos e os superiores e inferiores gabaritos de habitação são aparafusadas em conjunto para colocar a rede. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
> Figura 2. Microvasos cultivadas com perfis de fluxo controlado. A. HUVECs semeadas em microvasos cultivadas sob fluxo de gravidade e conduzido B. fluxo contínuo aplicado a uma taxa de 3 mL / min. Cultura sob fluxo aplicado é melhor conseguido com a adição de 3,5% de dextrano aos meios de comunicação, que tem sido mostrado para estabilizar microvasos à base de colagénio de microfluidos por exercer pressões físicos dentro do lúmen que melhoram a formação da junção, embora o mecanismo exacto condução deste efeito não é clara 39 . Microvasos foram coradas para o CD31 proteína de junção endotelial ou aglomerado de diferenciação 31 (vermelho) e o factor de von Willebrand (vWF) grânulos (verde). A ', B'. Em ambas as condições, células HUVEC expressa marcadores endoteliais de junções célula-célula e VWF grânulos. A ", B". vistas ortogonais mostram patente e arredondadas lúmens após 6 dias em cultura.arge.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3. Engineered Microvasos para o estudo da função endotelial. A função de barreira endotelial. Pode ser avaliado após a perfusão de FITC (Isotiocianato de Fluoresceína) -conjugated dextrano através das redes (superior) e subsequente medição da sua difusão para o colágeno em massa (em baixo). Usando o código personalizado, vídeos de perfusão podem ser analisados ​​para traçar intensidade de pixels ao longo de uma região de interesse dentro do quadro ao longo do tempo para determinar o coeficiente de permeabilidade K (mM / seg) do FITC-Dextrano. Publicações anteriores realizados pelo laboratório têm demonstrado que a permeabilidade dos vasos por engenharia é comparável à de mamífero ex vivo vasos 31,43. B. interações entre células endoteliais com perivascular células ou de suporte podem ser analisados ​​nesta plataforma, modulando a composição celular da matriz de colagénio. Aqui, um exemplo destas interacções célula-célula pode ser visto quando as células do músculo liso são incorporados dentro do colagénio em torno dos vasos. Após 14 dias em cultura, as células de músculo liso (corados para actina de músculo liso alfa (αSMA) em verde) associado com o endotélio e extensão dos processos ao longo da parede do recipiente e actuar como células perivasculares como pode ser visto nas projecções ortogonais 31. As imagens mostradas no painel A e B são reproduções de uma publicação anterior 31. C. germinação e remodelação angiogénica pode ser avaliada em microvasos modificadas, modificando o meio de cultura para incluir estímulos angiogénicos. Sem estímulos angiogénicos, HUVECs mostrar germinação mínima (à esquerda); com estímulos angiogénicos (1 uM de inibidor de molécula pequena de GSK-3, 20 ng / de factor de crescimento endotelial vascular ml, e 20 ng / mL gro básicos de fibroblastoswth fator), HUVECs prontamente brotar na matriz como visto em cima para baixo projeções e vistas ortogonais (direita). A altura e número é facilmente quantificável com o software ImageJ 41. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4. Interações de sangue do endotélio. Projetado microvasos são de repouso e responder apropriadamente a estímulos inflamatórios. A. Um inalterado, HUVEC navio cultivadas fotografado perto da entrada mostra forte coloração CD31 juncional (vermelho) e uma rodada, lúmen aberto. A '. Orthogonal vista do lúmen é mostrado. B. Quando citrato de sangue total com plaquetas CD41a-rotulados (verde) é perfundido através de um vaso semelhante repouso, ad mínimahesion de plaquetas (verde) para o endotélio é observado. C. Com a exposição a estímulos inflamatórios, tais como de forbol-12-miristato-13-acetato (PMA, 50 ng / mL) aos meios de comunicação, a perfusão de inteiros sangue resulta na formação de grandes trombos (CD41a-rotulado, verde) no interior do canal e adesão de leucócitos (CD45 + marcado, branco) da parede do vaso 31. Imagens vistas aqui são reproduzidas a partir de uma publicação anterior 31. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5
Figura 5. Microvasos gerados com Derivado-CEs. Fontes de células endoteliais adicionais de células germinais humanas pode ser utilizada para gerar microvasos modificadas. No início deste ano, Palpant et. ai. demonstraram que dois subtipos distintos ócélulas derivadas de células de f humanas estaminais embrionárias endoteliais pode ser obtido através da manipulação de sinalização de Wnt / β-catenina durante a diferenciação: células endoteliais hegemônicos (caracterizada pela expressão de hand1 e um elevado potencial hegemônicos) e células endoteliais endocárdicos-like (caracterizada, em parte, pela expressão de NFATc1 e GATA4) 41. A. Quando semeadas e cultivadas na plataforma vaso 3D, ECs hegemônicos sofrer algum surgimento angiogénico. B. no entanto, o ECs-endocárdica como são muito mais angiogénico e migratórias, sugerindo diferenças funcionais, talvez em resposta aos fluxo, entre os dois subtipos de ECs (este trabalho é apresentado em mais pormenor na publicação anterior 41). Ambos os tipos de células expressam proteínas CD31 juncional (vermelho) e alguns VWF (verde). Vistas ortogonais de ambos mostram lumens de patentes. C. A imagem do microscópio eletrônico de varredura da ECs endocárdio-like dentro do vaso mostra um broto angiogênico como vistoa partir do lado luminal. Imagens apresentadas nos painéis A e B são reproduções de Palpant et. al. 41. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

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Engineered microvasos são um modelo in vitro onde as características fisiológicas, tais como a geometria do lúmen, as forças hidrodinâmicas, e interacções multi-celulares estão presentes e sintonizável. Este tipo de plataforma é poderosa na medida em que oferece a capacidade para modelar e estudar o comportamento endotelial numa variedade de contextos em que as condições de cultura in vitro podem ser combinados com a do microambiente em questão. Por exemplo, os mecanismos de condução processos endoteliais, tais como angiogénese, são conhecidos por ocorrer de forma diferente em diferentes órgãos e em diferentes estados patológicos, tais como a saúde e doença 44. Por esta razão, a cultura de células endoteliais planas é insuficiente consistentemente 6 e, como tal, o campo baseou-se fortemente em modelos animais dispendiosos e morosos.

modelos animais, ao mesmo tempo informativo e essencial para o progresso da pesquisa biológica, nem sempre traduzem bem para a clínica.Isto foi em grande parte atribuída a diferenças entre murino e biologia humana, particularmente em relação à sua resposta a estímulos 9,45. Portanto, é essencial para ser capaz de construir modelos in vitro que podem fornecer dados adicionais específicos de humanos para complementar a informação recolhida a partir de modelos animais. Em vitro plataformas têm o potencial para imitar o microambiente de interesse com a capacidade adicional para sintonizar esse ambiente. As principais características de um tal sistema deve incluir estrutura tridimensional e geometria, composição da matriz extracelular (MEC), a proximidade das células do parênquima e interação, o fluxo de sangue, e os estímulos bioquímicos. microvasos modificadas têm a capacidade de incorporar todos estes parâmetros. Isso pode ser feito simultaneamente para criar um modelo abrangente, ou adicionado de uma forma sábia passo para isolar as respostas individuais e interações.

Um aspecto poderoso de microvasos engenharia é a capacidade defluxo de controlar e manipular as forças hidrodinâmicas exercida sobre o endotélio. Como um exemplo, o dispositivo pode ser cultivada sob as condições de fluxo dirigido por gravidade ou com perfusão contínua (Figura 2). A grandeza da tensão de cisalhamento na parede do reservatório pode ser modulado em ambas as condições através de alterações na taxa de fluxo e a geometria do recipiente. A principal diferença entre as duas condições é a distribuição temporal da tensão de corte dentro do recipiente. Em condições de escoamento por gravidade orientada, a tensão de corte não é constante ao longo do tempo. O caudal e a tensão de cisalhamento é mais elevado imediatamente após uma mudança de meio em que o reservatório está cheio de entrada. À medida que os drenos dos meios, a tensão de cisalhamento irá diminuir. Isto leva a uma gama de tensão de corte, ao longo de 12 h. As experiências que requerem um controlo preciso sobre as propriedades hidrodinâmicas (por exemplo, para estudar os efeitos da tensão de cisalhamento sobre o endotélio) deve usar condições de cultura de fluxo contínuo.

Emicrovasos ngineered pode ser ajustado para atender a uma ampla gama de questões com modificações relativamente fácil. Diferentes tipos de células, tanto do parênquima e endotelial, pode ser usado para modelar diferentes sistemas de órgãos. Além disso para o fabrico de microvasos com sementeira de células endoteliais, células epiteliais, em vez pode ser usada para alinhar o canal para os estudos relacionados com a mucosa intestinal, alvéolos pulmonares, túbulo renal, etc. Uma vez que o microambiente é definido pela composição da célula, a solução de nutrientes (ou seja, meios de comunicação, o sangue, factores de crescimento, ou outro fluido biologicamente relevante) que é utilizada para perfundir o dispositivo pode ser alterado para responder a questões complexas sobre a sinalização celular, quiescência, a tensão de cisalhamento , nutrientes, resposta de drogas, e muito mais. Além disso, a geometria do recipiente pode ser concebido especificamente para investigar a resposta endotelial a tensão de corte e tortuosidade. Como um exemplo, uma publicação recente de Zheng et. ai. mostraram que as células endoteliais têm increassecreção ed VWF e montagem de fibra em regiões microvasos com estresse alto cisalhamento e aceleração do fluxo. Especificamente, VWF feixes tipicamente formadas nos cantos e curvas fechadas dentro da rede. A geometria da rede pode também ser concebido para fabricar túbulos multicelulares. Por exemplo, um desenho que contém dois canais paralelos, cada um com a sua própria entrada e a saída pode ser usado para gerar um gradiente de concentração ou de modelar um ambiente túbulo adjacente (por exemplo, vasos linfáticos com microvasos adjacente). As estruturas de grade do tipo de modelos de rede de corrente (mostrados na Figura 1A-C) são vantajosas para a modelação computacional de fluidos e para a integridade estrutural durante a fabricação, mas não são indicativos da estrutura vascular no corpo. Em estudos futuros, padrões de rede mais fisiológicas, tais como aqueles com ramificação hierárquica e cantos arredondados deve ser usado.

Enquanto todas as etapas descritas neste procedimento são importantes, hávários passos críticos que são necessários para o sucesso fabricação de microvasos engenharia. O gel de colagénio deve ser cuidadosamente misturada para alcançar uma solução homogénea, e não é essencial para introduzir bolhas durante este passo. Isto é essencial para a viabilidade celular e a função fisiológica, particularmente para experiências que incluem células parenquimatosas na matriz de colagénio. Se uma mistura uniforme do colagénio é difícil de obter, verificar o pH da solução para garantir que é neutra. Se o problema persistir, é possível que o estoque de colágeno deve ser substituído. Outro passo fundamental é a montagem das peças superior e inferior da habitação - é essencial para não usar força excessiva, pois isso pode fazer com que os canais a entrar em colapso. Várias rodadas de prática pode ser necessário para obter uma sensação de a quantidade de força necessária para aplicar durante a rotação parafusos. Se colapso canal ou esmagamento continua a ocorrer mesmo após a prática, é possível que a rede de PDMS tornou-se deformado devido ao absorption de umidade. Começando com moldes PDMS feitas na hora e vai ajudar a resolver este problema. furos indevidamente rosqueados no dispositivo de fundo também pode causar o colapso do canal. Se os parafusos não são capazes de rodar sem problemas durante a montagem, força extra deve ser aplicada muitas vezes resultando em falha estrutural. O último passo crítico que deve ser ressaltado é a importância da amamentação freqüente, normalmente a cada 12 horas. Isto é essencial para a manutenção do endotélio e impedindo que o dispositivo de secagem para fora. No caso em que semeadas células endoteliais aparecem não saudáveis ​​ou separar a partir da parede do colagénio, possíveis formas para melhorar a saúde do endotélio são para alimentar os navios mais frequentemente, utilizar uma bomba de seringa para aplicar o fluxo contínuo, ou verificar o pH do gel de colagénio para assegurar que ele é a um nível fisiológico.

Actualmente, esta plataforma está limitado a fabricação com a matriz extracelular de rigidez adequada para manter a integridade estrutural do canal durante a montagem. co densallagen igual ou superior a 6 mg / ml é suficiente, mas o colagénio inferior a 6 mg / ml e outras matrizes tais como matriz descelulada de órgãos inteiros são muito fracos. Isto pode ser ultrapassada pela utilização de uma mistura de colagénio com a matriz em questão. microvasos engenharia também são limitados pela sua escala de tamanho. Os navios podem ser fabricados a um limite inferior de cerca de 100 um, mas modificações substanciais teria de ser aplicada para alcançar uma escala menor. Embora microvasos engenharia criar um três lúmen dimensionais, a rede em si é planar. Para criar um plexo vascular verdadeiramente tridimensional, teria de ser aplicada, tal como a criação de uma rede de várias camadas por empilhamento múltiplos vasos engenharia modificações adicionais.

Os resultados representativos apresentados neste método demonstrar como microvasos manipuladas podem ser utilizados para avaliar a função de barreira, a sinalização célula-célula (recrutamento de pericitos e estabilização vascular), a angiogénese, e trombose. Highlights destes estudos são apresentados aqui com apresentações mais detalhadas em publicações anteriores 31,32. Estes estudos mostram como pericitos migrar e revestir o endotélio de microvasos engenharia 31, as plaquetas aderem ao endotélio activado 31, e tensão de cisalhamento de fluidos modula ativação endotelial e secreção VWF e montagem 32. Microvasos manipuladas podem ainda ser usados ​​para construir tecidos vascularizados e sistemas específicos de órgãos, tais como o modelo do rim ou do coração 33 34. A capacidade de se replicar estas interacções do sangue do endotélio fisiológicas e sintonizar o microambiente com respeito a tensão de corte, geometria, ECM, e composição celular irá permitir estudos futuros de doenças vasculares.

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Disclosures

Os autores não têm nada para revelar.

Acknowledgments

Os autores gostariam de reconhecer a Lynn e Mike Garvey imagem Laboratório do Instituto de Células Estaminais e Medicina Regenerativa, bem como o Mecanismo de Washington Nanofabricação da Universidade de Washington. Eles também agradecem o apoio financeiro do Instituto Nacional de Saúde concede DP2DK102258 (para YZ) e formação concede T32EB001650 (a SSK e MAR) e T32HL007312 (MAR).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Wafer Fabrication
AutoGlow Plasma System AutoGlow
Headway Spin Coater Headway Research, Inc  PWM32 Spin Coater 
ABM Contact Aligner AB-M
Alpha Step Profilometer Tencor Alpha Step 200
SU-8 Developer Microchem Y020100
SU-8 Resist Microchem SU-8 2000
8" silicon wafer Wafer World Inc.
Tabletop Micro Pattern Generator Heidelberg Instruments μPG 101 For generation of photomask
Hot plate VWR 97042-646
Ispropyl alcohol Avantor Performance Materials 9088
Petri dishes (120 x 120 mm, square) Sigma-Aldrich Z617679
Trichloro(3,3,3-trifluoropropyl)silane Sigma-Aldrich MKBG3805V
Polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer base and curing agent Dow Corning Sylgard 184 Mixed at 10:1 (w/w)
Vacuum desiccator Sigma-Aldrich Z119024-1EA
Oven VWR 9120976
Device Fabrication and Culture
poly(methyl methacrylate) (PMMA) Plexiglas
Corona Treater Electro-Technic Products, Inc. BD-20 Handheld device for plasma treatment of PMMA devices and PDMS molds
Soldering Iron Weller  WTCPS
Stainless Steel Truss Head Slotted Machine Screw McMaster-Carr  91785A096
Stainless steel dowel pins McMaster-Carr  93600A060
Tweezers  Miltex 24-572 Any similar tweezers may be used
Spatula (Micro Spoon) Electron Microscopy Services 62410-01
Screw driver Any flat head screwdriver may be used, autoclaved
Glass coverslips (22 x 22 mm) Fisher Scientific 12-542B
Bleach Clorox 4460030966
Petri dishes (150 x 25 mm) Corning 430599
Petri dishes (100 x 20 mm) Corning 2909
Cotton, cut into 1 cm x 3 cm pieces Autoclaved
Polyethyleneimine (PEI) Sigma-Aldrich P3143 Dilute to 1% in cell culture grade water
Glutaraldehyde Sigma-Aldrich G6257 Dilute to 0.1% in cell culture grade water
Sterile H2O Autoclaved DI H2O
Type I collagen, dissolved in 0.1% acetic acid Isolated from rat tails as described in Rajan et. al. 2006 (ref #37)
1 ml syringe BD 309659
10 ml syringe BD 309604
15 ml conical tubes Corning 352097
30 ml conical tubes Corning 352098
M199 10x Media  Life Technologies 11825-015
1 N NaOH (sterile) Sigma-Aldrich 415413 Dilute to 1 N in cell culture grade water
HUVECs Lonza
Endothelial growth media Lonza CC-3124
Trypsin Corning 25-052-CI
Fetal bovine serum (FBS) Thermofisher Scientific 10082147
Dextran from Leuconostoc spp. (70 kDa) Sigma-Aldrich 31390
Phosphate Buffered Saline (PBS) Corning 21-031-CV
Hemocytometer Hausser Scientific Co. 3200
Gel loading tips VWR 37001-152
18 G Blunt Fill Needle BD  305180
20 G Stainless Steel Dispensing Needle McMaster-Carr 75165A123
Tygon 1/32” ID, 3/32" OD Silicon Tubing Cole-Parmer EW-95702-00
1/16" Tube-to-tube Coupling McMaster-Carr 5116K165
90° Elbow Connectors, Tube-to-Tube McMaster-Carr 5121K901
Luer Lock Coupling (Female, 1/16" ID) McMaster-Carr 51525K211
Plastic Forceps, with Jaw Grips Electron Microscopy Services 72971
Dual Syringe Pump Harvard Apparatus 70-4505
5 ml Polystyrene Round-bottom tube Fisher Scientific 14-959-2A
Device Analysis
Formaldehyde Sigma-Aldrich F8775
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A8806-5G
Triton X-100 Sigma-Aldrich T-9284
Rabbit anti-hCD31 Abcam ab32457 1:25 working dilution
FITC conjugated anti-von Willebrand Factor antibody Abcam ab8822 1:100 working dilution
Goat anti-rabbit 568 secondary antibody Thermofisher Scientific A-11011 1:100 working dilution
Hoescht Thermofisher Scientific H1399 Resuspended in DMSO
Sodium cacodylate  Sigma-Aldrich C0250 To make 0.2 M cacodylate buffer
Ethanol VWR International BDH1164-4LP
40 kDa FITC-conjugated Dextran Sigma-Aldrich FD40S 
Additional Culture Reagents 
CHIR-99021 Selleck Chem S2924 Small molecule GSK-3 inhibitor
Human recombinant VEGF Peprotech 100-20
Human recombinant bFGF Peprotech AF-100-18B

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Micropatterning e Montagem de microvasos 3D
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Roberts, M. A., Kotha, S. S., Phong, K. T., Zheng, Y. Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels . J. Vis. Exp. (115), e54457, doi:10.3791/54457 (2016).More

Roberts, M. A., Kotha, S. S., Phong, K. T., Zheng, Y. Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels . J. Vis. Exp. (115), e54457, doi:10.3791/54457 (2016).

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