Summary

Micropatterning e Montagem de microvasos 3D

Published: September 09, 2016
doi:

Summary

Este manuscrito apresenta um método de moldagem por injeção para engenheiro microvasos que recapitulam propriedades fisiológicas de endotélio. O processo baseado em microfluídico cria redes vasculares 3D patente com condições tailorable, tais como fluxo, composição celular, geometria e gradientes bioquímicos. O processo de fabricação e exemplos de aplicações potenciais são descritos.

Abstract

Em plataformas in vitro para estudar as células endoteliais e biologia vascular são largamente limitadas à cultura de células endoteliais 2D, câmaras de fluxo com o polímero ou com base substratos de vidro, e ensaios de formação de tubos à base de hidrogel. Estes ensaios, enquanto informativo, não recapitular geometria luz, matriz extracelular adequada, e proximidade multi-celular, que desempenham um papel-chave na modulação da função vascular. Este manuscrito descreve um método de moldagem por injeção para gerar vasos artificiais, com diâmetros da ordem de 100 mm. Microvasos são fabricados semeando células endoteliais em um canal microfluídico incorporado dentro de um tipo nativo I colágeno hidrogel. Ao incorporar nas células do parênquima dentro da matriz de colagénio antes da formação de canal, microambientes específicos de tecido podem ser modelados e estudados. modulações adicionais de propriedades e meios de comunicação hidrodinâmico composição permitir o controlo da função vascular complexa dentro do microambiente desejado.Essa plataforma permite o estudo de recrutamento perivascular de células, as interacções do sangue do endotélio, a resposta de fluxo, e as interacções de tecidos-microvascular. microvasos Engineered oferecer a capacidade de isolar a influência de componentes individuais de um nicho vascular e controlar com precisão as suas químicas, mecânicas e propriedades biológicas para estudar a biologia vascular na saúde e na doença.

Introduction

A microvasculatura em cada órgão ajuda a definir o microambiente tecido, manter a homeostase do tecido e regular a inflamação, a permeabilidade, a trombose, e fibrinólise 1,2. Endotélio microvascular, em particular, é a interface entre o fluxo de sangue e o tecido circundante e, por conseguinte, desempenha um papel crítico na modulação da função do órgão e vascular em resposta a estímulos, tais como as forças hidrodinâmicas e citoquinas e hormonas circulantes 3 ​​- 5. Compreendendo as interacções específicas entre o endotélio, o sangue, e o microambiente circundante do tecido é importante para o estudo da biologia vascular e a progressão da doença. No entanto, o progresso em estudar essas interações tem sido dificultada pela limitação em ferramentas in vitro que não recapitulam na estrutura microvascular vivo e função 6,7. Como resultado, o campo e avanço terapêutico tem se baseou fortemente em caro e tempo-consumir modelos animais, que muitas vezes não conseguem traduzir para o sucesso em seres humanos 8 10. Enquanto modelos in vivo são de valor inestimável no estudo dos mecanismos da doença e funções vasculares, eles são complexos e muitas vezes não têm controle preciso do indivíduo celulares, bioquímicos e biofísicos pistas.

Vasculatura por todo o corpo possui uma estrutura hierárquica madura em conjunto com leitos capilares expansivas, proporcionando perfusão otimizado e transporte de nutrientes simultaneamente 11. Inicialmente, as formas vasculatura como um plexo primitiva, que reorganiza a uma rede hierarquicamente ramificada durante o desenvolvimento precoce 12,13. Embora muitos dos sinais envolvidos nestes processos são bem compreendidos 14-16, permanece elusiva como tal modelação vascular é determinada 15. Por sua vez, recapitulando este processo in vitro para projetar redes vasculares organizados tem a abelhan. Muitas in vitro plataformas difíceis existentes para modelar vasculatura, tais como culturas de células endoteliais duas dimensões, não têm características importantes, tais como a proximidade de multi-celular, três luminal geometria dimensional, fluxo, e a matriz extracelular. Tubo de ensaios de formação em hidrogéis 3D (colágeno ou fibrina) 17 19 ou invasão ensaios 20,21 têm sido utilizados para estudar a função endotelial em 3D e suas interações com outros vasculares 17,22 ou de células do tecido tipos 23. No entanto, montados em lúmens estes ensaios não têm interconectividade, fluxo hemodinâmico, e perfusão adequada. Além disso, a propensão para a regressão vascular nestes ensaios de formação de tubo 24 evita a cultura a longo prazo e a maturação o que limita o grau de estudos funcionais que podem ser executadas. Assim, há uma necessidade crescente de engenheiro em plataformas in vitro de redes microvasculares que podem modelar adequadamente enendotelial características e são capazes de cultura a longo prazo.

Uma variedade de técnicas de engenharia vasculares têm surgido ao longo dos anos para aplicações médicas para substituir ou vasos de bypass afetados em pacientes com doença vascular. Vasos de grande diâmetro feitas de materiais sintéticos, tais como tereftalato de polietileno (PET), e politetrafluoroetileno (ePTFE) tiveram sucesso terapêutico considerável com permeabilidade longo prazo (média desobstrução de 95% mais de 5 anos) 25. Apesar de pequeno diâmetro enxertos sintéticos (<6 mm) geralmente enfrentam complicações como a hiperplasia da íntima e trombopoiese 26 28, da engenharia de tecidos enxertos de pequeno diâmetro feitos com material biológico fizeram progressos significativos 29,30. Apesar dos avanços desse tipo, vasos de engenharia em microescala mantiveram-se um desafio. Para modelar adequadamente a microcirculação, é necessário para gerar padrões de rede complexos com sufficiente de resistência mecânica para manter a desobstrução, e com uma composição da matriz que permite tanto a permeação de nutrientes para as células parenquimatosas e remodelação celular.

Este protocolo apresenta um romance rede de vasos perfusable artificial que imita um nativo in vivo configuração com um ajustável e controlável microambiente 31-34. O método descrito gera microvasos artificiais, com diâmetros na ordem de 100 um. microvasos engenharia são fabricados por perfusão células endoteliais através de um canal microfluídico que está incorporado dentro do tipo macio I colágeno hidrogel. Este sistema tem a capacidade de gerar redes estampados com estrutura luminal aberta, replicar interações multi-celulares, modular a composição da matriz extracelular, e aplicar forças hemodinâmicas fisiologicamente relevantes.

Protocol

1. Microfabricação de Patterned polidimetilsiloxano (PDMS) com Network Design De fabricação de wafer criar um modelo negativo do Projeto de Rede Criar um padrão de rede usando qualquer software assistida por computador (CAD). Certifique-se de que a dimensão diagonal entre a entrada e saída de acordo com a distância entre a entrada e saída reservatórios nos dispositivos da habitação em etapas futuras (ver 2.1.1). Nota: O desenho do padrão em si é personalizado de …

Representative Results

O navio-plataforma projetada cria microvasculatura funcional incorporado dentro de um tipo natural de colágeno I matriz e permite um controlo apertado do ambiente celular, biofísicos e bioquímicos in vitro. Para fabricar microvasos modificadas, as células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) são perfundidos através da rede microfluídicos embebidos em colágeno onde se fixam para formar um lúmen de patentes e endotélio confluentes. Como ilustrado na Figu…

Discussion

Engineered microvasos são um modelo in vitro onde as características fisiológicas, tais como a geometria do lúmen, as forças hidrodinâmicas, e interacções multi-celulares estão presentes e sintonizável. Este tipo de plataforma é poderosa na medida em que oferece a capacidade para modelar e estudar o comportamento endotelial numa variedade de contextos em que as condições de cultura in vitro podem ser combinados com a do microambiente em questão. Por exemplo, os mecanismos de condução pr…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores gostariam de reconhecer a Lynn e Mike Garvey imagem Laboratório do Instituto de Células Estaminais e Medicina Regenerativa, bem como o Mecanismo de Washington Nanofabricação da Universidade de Washington. Eles também agradecem o apoio financeiro do Instituto Nacional de Saúde concede DP2DK102258 (para YZ) e formação concede T32EB001650 (a SSK e MAR) e T32HL007312 (MAR).

Materials

Wafer Fabrication
AutoGlow Plasma System AutoGlow
Headway Spin Coater Headway Research, Inc  PWM32 Spin Coater 
ABM Contact Aligner AB-M
Alpha Step Profilometer Tencor Alpha Step 200
SU-8 Developer Microchem Y020100
SU-8 Resist Microchem SU-8 2000
8" silicon wafer Wafer World Inc.
Tabletop Micro Pattern Generator Heidelberg Instruments μPG 101 For generation of photomask
Hot plate VWR 97042-646
Ispropyl alcohol Avantor Performance Materials 9088
Petri dishes (120 x 120 mm, square) Sigma-Aldrich Z617679
Trichloro(3,3,3-trifluoropropyl)silane Sigma-Aldrich MKBG3805V
Polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer base and curing agent Dow Corning Sylgard 184 Mixed at 10:1 (w/w)
Vacuum desiccator Sigma-Aldrich Z119024-1EA
Oven VWR 9120976
Device Fabrication and Culture
poly(methyl methacrylate) (PMMA) Plexiglas
Corona Treater Electro-Technic Products, Inc. BD-20 Handheld device for plasma treatment of PMMA devices and PDMS molds
Soldering Iron Weller  WTCPS
Stainless Steel Truss Head Slotted Machine Screw McMaster-Carr  91785A096
Stainless steel dowel pins McMaster-Carr  93600A060
Tweezers  Miltex 24-572 Any similar tweezers may be used
Spatula (Micro Spoon) Electron Microscopy Services 62410-01
Screw driver Any flat head screwdriver may be used, autoclaved
Glass coverslips (22 x 22 mm) Fisher Scientific 12-542B
Bleach Clorox 4460030966
Petri dishes (150 X 25mm) Corning 430599
Petri dishes (100 X 20 mm) Corning 2909
Cotton, cut into 1 cm x 3 cm pieces Autoclaved
Polyethyleneimine (PEI) Sigma-Aldrich P3143 Dilute to 1% in cell culture grade water
Glutaraldehyde Sigma-Aldrich G6257 Dilute to 0.1% in cell culture grade water
Sterile H2O Autoclaved DI H2O
Type I collagen, dissolved in 0.1% acetic acid Isolated from rat tails as described in Rajan et. al. 2006 (ref #37)
1 mL syringe BD 309659
10 mL syringe BD 309604
15 mL conical tubes Corning 352097
30 mL conical tubes Corning 352098
M199 10X Media  Life Technologies 11825-015
1N NaOH (sterile) Sigma-Aldrich 415413 Dilute to 1N in cell culture grade water
HUVECs  Lonza
Endothelial growth media Lonza CC-3124
Trypsin Corning 25-052-CI
Fetal bovine serum (FBS) Thermofisher Scientific 10082147
Dextran from Leuconostoc spp. (70kDa) Sigma-Aldrich 31390
Phosphate Buffered Saline (PBS) Corning 21-031-CV
Hemocytometer Hausser Scientific Co. 3200
Gel loading tips VWR 37001-152
18G Blunt Fill Needle BD  305180
20G Stainless Steel Dispensing Needle McMaster-Carr 75165A123
Tygon 1/32” ID, 3/32" OD Silicon Tubing Cole-Parmer EW-95702-00
1/16" Tube-to-tube Coupling McMaster-Carr 5116K165
90° Elbow Connectors, Tube-to-Tube McMaster-Carr 5121K901
Luer Lock Coupling (Female, 1/16" ID) McMaster-Carr 51525K211
Plastic Forceps, with Jaw Grips Electron Microscopy Services 72971
Dual Syringe Pump Harvard Apparatus 70-4505
5 mL Polystyrene Round-bottom tube Fisher Scientific 14-959-2A
Device Analysis
Formaldehyde Sigma-Aldrich F8775
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A8806-5G
Triton X-100 Sigma-Aldrich T-9284
Rabbit anti-hCD31 Abcam ab32457 1:25 working dilution
FITC conjugated anti-von Willebrand Factor antibody Abcam ab8822 1:100 working dilution
Goat anti-rabbit 568 secondary antibody Thermofisher Scientific A-11011 1:100 working dilution
Hoescht Thermofisher Scientific H1399 Resuspended in DMSO
Sodium cacodylate  Sigma-Aldrich C0250 To make 0.2M cacodylate buffer
Ethanol VWR International BDH1164-4LP
40kDa FITC-conjugated Dextran Sigma-Aldrich FD40S 
Additional Culture Reagents 
CHIR-99021 Selleck Chem S2924 Small molecule GSK-3 inhibitor
Human recombinant VEGF Peprotech 100-20
Human recombinant bFGF Peprotech AF-100-18B

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Cite This Article
Roberts, M. A., Kotha, S. S., Phong, K. T., Zheng, Y. Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels. J. Vis. Exp. (115), e54457, doi:10.3791/54457 (2016).

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