Summary
In deze studies geven we nieuwe methodologie voor neonatale muizen cardiale scaffolds voor gebruik in regeneratieve studies.
Introduction
Hartfalen komt vaak voor en dodelijk. Het is een progressieve ziekte die resulteert in verlaagde contractiliteit van het hart, die bloedtoevoer aan organen schaadt en laat de metabolische behoeften van het lichaam onvervulde. Men schat dat 5,7 miljoen Amerikanen hebben hartfalen en het is de voornaamste oorzaak van ziekenhuisopname in de Verenigde Staten 9. De gezamenlijke kosten van de behandeling van patiënten bij hartfalen in de Verenigde Staten meer dan $ 300.000.000.000 dollar per jaar 9-10. De enige definitieve therapie voor eindstadium hartfalen is orthotope harttransplantatie. Elk jaar, wordt geschat dat meer dan 100.000 donorharten zijn nodig voor harttransplantatie procedures in de Verenigde Staten 1-2. Vanwege het beperkte aantal donoren, worden slechts bij benadering 2400 transplantaties jaarlijks uitgevoerd in de VS 2. Het is duidelijk dat dit tekort aan organen moet worden aangepakt als andere strategieën nodig zijn om extra organen voor transplanta producerentie en idealiter zou deze organen autoloog zijn om de complicaties van afstoting en levensduur immuunsuppressie voorkomen.
Zoogdieren volwassen hartspiercellen aantonen dat er een beperkte regeneratieve capaciteit op schade, maar recent bewijs suggereert dat zoogdieren neonatale harten handhaven van een opmerkelijke regeneratieve capaciteit na letsel 5-8. Specifiek, na gedeeltelijke chirurgische resectie, een regeneratieve venster is ontdekt tussen de geboorte en postnatale dag 7. Deze regeneratieve periode wordt gekenmerkt door een gebrek aan fibrotische littekenvorming, vorming van neovascularisatie, afgifte van angiogene factoren uit het epicard en cardiomyocyt proliferatie 5-8 , 11. Deze regeneratieve tijdvenster biedt het potentieel voor het gebruik van het neonatale hart als een nieuwe bron van materiaal voor de ontwikkeling van een biokunstmatige hart.
De extracellulaire matrix is bekend dat belangrijke signalen te verschaffen cardiomyocyt bevorderene proliferatie en groei. Duidelijke verschillen in de beschikbaarheid van moleculen in de neonatale en volwassen matrices 12 en hun vermogen om regeneratie te bevorderen werden onderzocht 13. Volwassen cellen ontdane matrices zijn gebruikt in verscheidene studies een ECM matrix voor cellulaire herbevolking en het genereren van een bioartificiële hart verschaffen. Hoewel deze studies, en nieuwe ontdekkingen in stamcellen technologieën, zijn snel voortschrijdende, verschillende hindernissen moeten nog worden voldaan. Bijvoorbeeld beperkingen bij het behoud natieve structuur van de matrix, cellulaire integratie in de matrix wand, en het vermogen om proliferatie en groei ondersteunen alle grens het succes van deze benadering. Terwijl superieure regeneratieve eigenschappen zijn toegeschreven aan de neonatale hart, zijn de praktische aspecten van het gebruik van een dergelijk weefsel zijn verkenning beperkt.
Gebaseerd op de aangetoonde regeneratieve capaciteit van het neonatale hart, hebben we nieuwe matrices ontwikkeld door de ontwikkeling van eentechniek van decellularisatie voor de P3 muis hart. Het P3 hart werd gekozen voor deze studies aangezien het binnen het raam van cardiale regeneratie voorafbepaalde 6 maar het hart is groot genoeg te oogsten, decellularize en recellularize. Het doel van deze studie is om de haalbaarheid van het creëren van een matrix van een neonatale muis hart te tonen. Onze studies leveren het bewijs voor de haalbaarheid van decellularizing een minuut, neonatale hart met behoud van de structurele en eiwithoudende integriteit van de ECM. We demonstreren ook de mogelijkheid om deze cardiale ECM mCherry expressie cardiomyocyten recellularize en wij hebben deze cardiomyocyten onderzocht op expressie van verschillende merkers cardiale volgende hercellularisatie. Deze technologie zal voor het testen van de superioriteit van een neonatale matrix voor de ontwikkeling van een biokunstmatige hart.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle muizen experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de Amerikaanse Animal Welfare Act en werden aan de Universiteit van Minnesota door de Institutional Animal Care en gebruik Comite goedgekeurd.
1. Werkwijze voor muizenhart Isolation
- Euthanaseren een neonatale muis door onthoofding met een eenmalig gebruik mes.
- Zwabberen de thorax met 70% ethanol.
- Ontleden de huid van de borst door snijden vanaf de borstwand met standaard schaar en trek de huid lateraal met een paar van # 5 tang.
- Perforeren buik net inferieur aan het borstbeen met de schaar door doorsnijden van de buikwand. Grijpen de processus xiphoideus met # 5 tang, trekken het borstbeen rostraal van het lichaam, terwijl het doorknippen van de ribben aan weerszijden van de borst met de schaar. De ribbenkast wordt weerspiegeld superiorly met de tang om het hart te openbaren.
- Botweg ontleden de twee lobben van de thymus door zijdelings trekken met # 5 tang, blootde boog van de aorta, en de cavale en longaderen.
- Doorsnijden de grote slagaders van de aortaboog en de aorta zelf, met de 10 cm voorjaar schaar. Bewaar de aorta tussen de basis van het hart en de brachycefale slagader. Pak de uiteinden van de doorgesneden binnenschepen met # 5 tang om het hart uit te geven, scheidt van de luchtpijp en de slokdarm.
- Doorsnijden de pulmonaire vasculatuur en andere grote aderen, door te snijden tussen de longen en het hart op beide zijden van het hart met de veer 10 cm schaar. De aderen open blijven om de drainage te bieden.
- Verwijder het hart van het mediastinum met de # 5 tang, grijpen de afgehakte uiteinden van de grote schepen. Plaats het hart in een 60 mm kweekschaal met steriele fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) voor katheterisatie.
2. Methode voor Decellularisatie door Langendorff perfusie
- Bereid het kathetersamenstel vooraf. Teken een sectie 4 cmPE 50 buis in een kleine alcohol vlam een kleinere, dunnere katheter creëren. Snijd de uiteinden met een mes de afmetingen voldoen (Ong. 300 urn buitendiameter OD met een flens van ong. 500 pm OD) in figuur 1. Dit zal twee symmetrische katheters aan beide kanten van de trekkracht.
- Richt het afgesneden uiteinde van de slang in de vlam kort een flens smelten op de opening aan het dunne uiteinde.
- Vul de spuit met 12 ml PBS en monteer de katheter door een 3-weg kraan op de spuit. Voeg een 22 G x 1 naald om de kraan en rijden de naald door het septum. Schuif de getekende PE buis catheter op de naald (afb. 1).
- Irrigeren de geassembleerde onderdelen met PBS, die waarborgen dat alle luchtbellen zijn verwijderd.
- Een katheter, bereid zoals hierboven beschreven, in de aorta van het geïsoleerde hart, niet tot voorbij de aortaklep en ligeren met een band van 7-0 hechtdraad. Rest de flens van tHij katheter proximaal ten opzichte van de band, waardoor een goede afdichting en het voorkomen van het hart van komende uit de katheter.
- Houd u aan de catheterisatie onder een vergrootglas, terwijl zachtjes perfuseren het hart met behulp van de spuit met PBS. Zorg ervoor dat er geen lekken in het systeem en het weefsel homogeen blanches als latente bloed wordt verwijderd.
- Plaats het septum in de hals van de inlaat adapter en sluit deze door het vouwen van de zijkanten over het glas.
- Bevestig het reservoir gevuld met 60 ml 1% natriumdodecylsulfaat (SDS) in gedestilleerd water (dH 2 O) via een leiding lang genoeg is om een kolom die 20 mm Hg druk genereerd zoals getoond in Fig produceren. 1. Bereken de druk van de vloeistofkolom hoogte gebaseerd op de verhouding van 1 mm Hg gelijk aan 1,3595 cm H2O
Let op: SDS is een zeer vlokkig poeder met irriterende eigenschappen. Contact moet vermeden. Behandel het poeder met behulp van geschikte beschermende kleding. - Perfuseren het hart met 1% SDS gedurende 14 uur. Het hart wordt doorzichtig in uiterlijk zonder waarneembare resterende weefsel.
- Spoel het systeem tot de plugkraan van de resterende SDS-oplossing en vervangen door 10 ml dH 2 O. Perfuseren het hart met 10 ml 1% Triton X-100 (verdund in gedestilleerd water), gevolgd door 10 ml dH 2 O, gevolgd door 60 ml PBS met 1x penicilline streptomycine (Pen-Strep).
- Bewaar het hart in PBS met 1x Pen-Strep bij 4 ° C. Als de beoogde functie decellularisatie toepassing perfusie dan de katheter in de aorta moet worden gehandhaafd vereist, anders snijd de hechtdraad band en verwijder de katheter.
3. DNA Vaststelling
- Bereid een samenvatting van de ontcelde ECM of control hart met behulp van 200 ug / ml proteïnase K in 50 mM KCI, 2,5 mM MgCl2, 0,45% Tween 20 in 10 mM Tris (pH 8,3).
- Incubeer het weefsel bij 55 ° C onder roeren totdat het weefsel is opgelost,typisch 4-5 uur.
- Kwantificeren het DNA gehalte van het homogenaat met een DNA-bindingstest 4,11.
4. Fixatie en Opdeling van Tissue
- Fix ontceld, recellularized of control P3 harten in 4% paraformaldehyde in PBS gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Was het weefsel in PBS 3x.
- Plaats het weefsel in een oplossing van 7,5% sucrose in 0,1 M fosfaatbuffer bij 4 ° C totdat het zinkt.
- Verander de oplossing van 15% sucrose in 0,1 M fosfaatbuffer bij 4 ° C, opnieuw, totdat het zinkt.
- Warm het weefsel 37 ° C, plaats de helft van het volume gelatineoplossing in 15% sucrose en 0,1 M fosfaatbuffer en gedurende de nacht equilibreren. Concentraties van gelatine stapsgewijs verhoogd tot 1%, 2,5%, 5% en tenslotte 7,5% tweemaal.
- Plaats de monsters in cryomolds met verse 7,5% gelatine. Om de vorm van de ontcelde monsters te herstellen, kan vloeibare gelatine worden doorbloed in de kamers als tHij harten worden gevormd. Freeze door drijvende de cryomolds op vloeibare stikstof. Bewaar bij -80 ° C.
- Snijd (10 micrometer dik) secties met een cryostaat. Breng de schuif nabij het gedeelte oppervlak en ook het hoofdstuk af bewegen van het mes op het oppervlak als gevolg van de lading op het elektrostatisch behandelde objectglaasjes. Droog de objectglaasjes gedurende de nacht en bewaren bij -80 ° C voor latere analyse.
- Verwijder de dia's uit de vriezer, op kamertemperatuur en plaats in een Coplin pot met PBS gedurende 20 minuten bij 37 ° C om de gelatine op te lossen.
- Vlekken op de gesneden delen van Stap 4.7 met hematoxyline en eosine. Plaats de glaasjes in een Coplin pot. Expose de dia gehydrateerd in stap 4,8 tot hematoxyline gedurende 45 seconden, leidingwater gedurende 1,5 min, buffer gedurende 3 min, leidingwater gedurende 1 min, blauwmiddel gedurende 1,5 min, 80% ethanol gedurende 1 minuut, alcoholische Eosine Y 8 sec, 80% ethanol gedurende 1 minuut, 100% ethanol gedurende 1 min 2x, klaringsmiddel (xyleen vervangende) gedurende 1 min 3x, dekglaasje met harsop basis van montage medium. Onderzoek de slides microscopisch.
- Het behoud van ECM eiwitten reactiviteit van het hart ECM, kleuring voor ECM structurele eiwitten zoals collageen IV bevestigen door het plaatsen van de gehydrateerde objectglaasjes in een vochtige kamer en behandel met 10% normaal donkey serum (NDS) in fosfaatgebufferde zoutoplossing met 0,1% Triton -X100 (PBST) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur (RT). Gebruik een voldoende volume om de weefselsecties te dekken.
- Vervang de oplossing met het primaire antilichaam van keuze bij een empirisch bepaalde verdunning in 5% NDS / PBST. Zo werd de collageen IV antilichaam verdund 1: 150. Incubeer overnacht bij 4 ° C.
- Was de dia's met PBST 3x en breng een secundair antilichaam naar keuze geconjugeerd met een fluorescente kleurstof. Verdun het antilichaam volgens een empirisch bepaalde hoeveelheid. Incubeer gedurende 1 uur bij KT. Wassen met PBS 3x.
- Vlekken op de schuiven met een DNA-bindende kleurstof zoals DAPI afwezigheid van celkernen controleren met een DAPI bevattende mounting medium wanneer het deksel glijden de dia's.
- Onderzoek de glaasjes met een fluorescentiemicroscoop bij 50 tot 400X.
5. P1 Neonatale muizen ventriculaire Cardiomyocytes voor hercellularisatie
- Spray elke pup met 70% ethanol en onthoofden met een eenmalig gebruik mes.
- Houd elke pup tussen de duim en wijsvinger, terwijl de thorax wordt gesplitst op de middellijn met steriel schaar om de borstholte bloot te leggen. Druk uitoefenen om het hart vrij uitsteken van de borst, terwijl deze vrij van de grote bloedvaten en de boezems waardoor alleen het ventriculaire weefsel wordt gesneden.
- Plaats elke hart rechtstreeks in een 50 ml buis met 20 ml ijskoude calcium, bicarbonaat vrij Hank's gebufferde zoutoplossing met 20 mM 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethaansulfonzuur (CBFHH) totdat alle harten verzameld.
- Zuig het CBFHH en voeg 10-15 ml vers CBFHH (ijskoud) op de buis. Was het weefsel door zwenken in het weefsel tHij buis meerdere malen.
- Wordt de oplossing die het hart in een 60 mm plastic petrischaal.
- Ontleden eventuele latente atriaal weefsel van de harten onder vergroting op ijs door bijsnijden van het hart met de veer schaar. Hak de ventrikels in homogeen en kleinbedrijf kleine stukjes. Verwijder afgescheiden niet-ventriculair weefsel van de schaal met # 5 tang.
- Pipet zoveel van de CBFHH oplossing die nodig is om het weefsel fragmenten over in een steriel flesje dat een steriele micro roerstaaf bevat.
- Laat het weefsel bezinken naar de bodem van het flesje en verwijder de CBFHH oplossing.
- Vul aan 50 ml van een enzymoplossing 1,75 mg / ml trypsine, 20 ug / ml DNase II in CBFHH. Pipetteer 5 ml van dit enzym-oplossing en voeg deze toe aan een buis met gehakt ventriculaire weefsel en leg ze op een magneetroerder. Roer met een constante snelheid (340 opm) bij kamertemperatuur gedurende 8 min.
LET OP: Het roeren actie moet zacht en toch toestaanvoor de opschorting van de slurry. - Verwijder de flacon uit het roer plaat en laat de slurry te bezinken gedurende 3 minuten. Pipet en gooi de eerste verteren supernatant, omdat het in de eerste plaats bevat het bloed cellen en weefsels puin.
- Pipet een tweede 5 ml van het enzym-oplossing en voeg deze toe aan het verteren ventrikel. Roer gedurende 8 min en laat het bezinken nog eens 3 minuten. Voorafgaand aan het begin van de digesten, bereiden twee 50 ml buisjes (label 1 en 2) elk 12 ml ijskoud foetaal runderserum (FBS). Plaats een 40 um cel zeef boven op elke buis. Pipet dit supernatant door het filter op de buis 1.
- Herhaal het verteringsproces een extra 8 maal, afwisselend de plaatsing van digest supernatant tussen de twee buizen met FBS. Splits de laatste supernatant even tussen de buizen 1 en 2 gelijke volumes in elke buis te garanderen.
LET OP: Elke collectie buis bevatten nu 32,5 ml totaal volume van celsuspensie. - Centrifugeer de buisjes bevattening de supernatant 150 g gedurende 6 minuten bij 4 ° C.
- Terwijl het verzamelen van de vertering monsters, bereid vijf 100 mm weefselkweekplaten met 6 ml medium (Dulbecco's gemodificeerd Eagle's media (DMEM) met 10% FBS, 1x Pen-Strep, 1x L-glutamine) per plaat. Incubeer deze porties bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende 30 minuten aan de media equilibreren.
- Zuig het CBFHH enzymmengsel en resuspendeer de cellen in de 30 ml van de cultuur media hierboven bereide, het combineren van de cellen van beide collectie buizen.
- Terugkeren 6 ml celsuspensie aan elk van de 100 mm platen en incubeer gedurende 45 minuten bij 37 ° C.
- Aan het einde van de incubatie overdracht van de niet-hechtende cellen 5 nieuwe gerechten en opnieuw incubeer gedurende 45 minuten (de fibroblast fractie zal beginnen te houden aan de gerechten kunnen worden gekweekt afzonderlijk indien gewenst).
- Aan het einde van de tweede ronde van pre-plating, laat de media en niet-hechtende cellen uit de schalen en draaien de media bij 150xg gedurende 6 min.
- Trek overtollige media aan de cellen om de geschatte gewenste concentratie (4,0 x 10 5 cellen per construct in 100 ul van perfusaat) brengen. Verwijder een monster voor tellen en levensvatbaarheid of 14 testen.
6. Bioreactor hercellularisatie van P3 Hart Matrix
- Voorbehandelen het geïsoleerde hart matrix met cultuur media (zie stap 5.15) 's nachts voor het toevoegen van de cellen.
- Monteren van de onderdelen van een Langendorff-systeem zoals getoond in Fig. 2. Autoclaaf de glasdelen en ethyleenoxide steriliseren kunststofdelen steriliteit te verzekeren. Verschillende subeenheden van het systeem kan worden gemonteerd in een laminaire stroming kap alvorens op de ondersteuning is aangebracht. Circulerend waterbad en verwarmd water stroomweg is weggelaten voor de duidelijkheid.
- Vul het geassembleerde systeem met 120 ml van weefselkweek media (zie stap 5.15).
- Plaats de katheter hart matrix uit stap 2,14 in een 60 mm cultuur schotel onder een vergrootglas en sluit een 1 ml spuit met 22 G x 1 naald geladen met celsuspensie van stap 5.20 aan de katheter. Zorg ervoor dat deze bijeenkomst is vrij van luchtbellen te voorkomen emboliseren van het hart.
- Voorzichtig perfuseren de 100 pi celsuspensie in het hart matrix via de kransslagaders. Eenmaal voltooid, maak de spuit / naald-combinatie.
LET OP: Een langzame perfusie van ca. 20 ui per minuut nodig is om te voorkomen dat de cellen uit stroomt uit de aderen, doorreizen het hart. - Met een 22g stomp stomp bevestigd aan de Luer fitting aan de onderzijde van de bioreactor hart pot deksel, duw de katheter op de stomp.
- Start de peristaltische pomp en controleer of de stroom door zoals in figuur 2. Flow opbrengst van het reservoir via de pomp door de opvanginrichting de katheter in de aorta in stap 2,5 (rode pad in figuur 2.). Let op de stroom van de cardiale circulatie uit de aders en druppelen van de top, recirculerende de media reservoir.
OPMERKING: De perfusie debiet afhankelijk van individuele factoren zoals de vasculaire weerstand van het construct en de grootte van het hart, maar met een snelheid van 50 tot 100 pl / min is een goed uitgangspunt. Op tussenliggende tijdstippen, kunnen functionele evaluaties worden uitgevoerd. De schaal wordt van de neonatale recellularized hart beperkt de evaluaties, die kunnen worden uitgevoerd, maar we hebben vastgesteld dat optisch gebaseerde systemen kan worden gebruikt om te kwantificeren slaan gedrag zoals ze zijn gebruikt bij volwassen rat hearts. 4 Het construct kan worden geperfundeerd voor uitgebreide tijd (tot 23 uur).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
decellularisatie
Gemiddeld is de tijd decellularisatie P3 van een hart met dit protocol is ongeveer 14 uur. een gemiddelde hart gewicht van 23 mg voor de P3 pasgeborene.
Acellularity
Figuur 3a toont een volledig intacte P3 neonatale hart (hele mount). Figuur 3b toont dezelfde hart volgende cellen ontdoen. De figuren 4a en 4b de hematoxyline en eosine kleuring van intacte en gedecellulariseerde harten tonen, respectievelijk. Let op de afwezigheid van hematoxyline positieve kernen en de vermindering van eosinofiele structuren in de cellen ontdane hart. Bovendien wordt het DNA gehalte van het ontcelde hart significant afgenomen tot 68,08 ± 2,25 ug in het intacte hart (n = 6) tot 4,73 ± 2,27 ug in het ontcelde hart (n = 5).
Collageen Immunoreactiviteit
Het onderhoud van de extracellulaire matrix (ECM) na ontcelling is essentieel voor herbevolking met exogene cellen en de functionaliteit van de matrix. Om de inhoud van de neonatale ECM in intacte en ontcelde ECM evalueren, immuno-kleuring voor collageen IV werd uitgevoerd. Figuur 4c en d tonen dat collageen IV is robuust uitgedrukt in zowel onbeschadigde gedecellulariseerde hart en de lokalisatie van dit eiwit wordt gehandhaafd volgende cel te verwijderen, terwijl DAPI positieve kernen effectief worden verwijderd (figuur 4e-h).
DNA Content
De aanwezigheid van DNA wordt gebruikt als een extra indicatie cellulariteit. In figuur 5 wordt DNA aangetoond worden verlaagd met 93% in neonatale harten volgende detergens gebaseerde ontcelling. Deze mate van reductie DNA is metrapporten in de literatuur met afwasmiddel gebaseerd decellularisatie in andere weefsels 15-16.
hercellularisatie
We hebben immunohistochemie uitgevoerd om de expressie van verschillende cardiomyocyt markers in het recellularized hart te bepalen. Figuur 6 toont cellen die zijn gemigreerd naar de wand van de linker ventrikel (figuur 6A en 6B). Figuur 6C toont de DAPI etikettering van het recellularized hart. Figuur 6D-G illustreert cellen die positief zijn voor respectievelijk NKX 2,5, mCherry, α-actinine en DAPI zijn. Nkx2.5 is bekend dat cardiale voorlopercellen te labelen, terwijl α-actinine is een sarcomeer eiwit dat gedifferentieerde hartspiercellen markeert. (Roze Figuur 6H) We hebben een meerderheid van de cellen die al deze markers te uiten waargenomen, wat aangeeft dat deze cellen blijven cardiomyocyt markers ev uitdrukkenen na 23 dagen van de perfusie.
Figuur 1. Schematische voorstelling van ontcelling hardware. A. 60 cc spuit reservoir voor reinigingsmiddel. B. Kathetersamenstel met irrigatie spuit zo gedetailleerd. C. Detail van de getekende PE buis catheter tip. D. Decellularisatie kamer en septum met afvoer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Schematische weergave van het hart bioreactor. 1. Bevochtiging van carbogen gas (groene lijnen geven de gasstroom). 2. Slangenpomp aandrijving voor media perfusie enzuurstofvoorziening (paarse lijnen vertegenwoordigen media doorstroming oxygenator). 3. Thin muur oxygenator. 4. Sheet oxygenator en media reservoir. 5. Preload kamer en bubble val. 6. hartkamer (rode lijnen geven media doorstroming van en naar het hart). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Whole mount van P3 neonatale muis hart voor (A) en na decellularisatie (B). Dit hart wordt ontceld met behulp van de Langendorff perfusie methode zoals beschreven in methode 2. Merk op dat het hart wordt doorschijnend en iets vergroot volgende perfusie (B) . Scale = 2 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Histologie van inheemse en gedecellulariseerde P3 neonatale muis hart. Cryostaat sectie (10 pm) werden gekleurd met H & E (A, B), collageen IV (C, D, G, H) en DAPI (E, F, G, H ). Samengevoegde afbeeldingen worden weergegeven in G en H. H & E kleuring toont de afwezigheid van celkernen en cytoplasma van cellen ontdane weefsel (B) in vergelijking met de natieve hart (A). Terwijl de Collageen IV inhoud volgende decellularisatie (D), DAPI kleuring (een marker van de kernen) blijft wordt afgeschaft. De gefuseerde beelden tonen de colocalization van collageen IV en DAPI in de naïeve hart (G) en de afwezigheid van deze colocalization in de cellen ontdane hart (H). Deze gegevens geven aan dat cellen geen langer bevolken het collageen matrix van het hart. Schaal = 500 pm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. Evaluatie van DNA gehalte. Controle (n = 6) en ontceld (n = 5) harten geanalyseerd op DNA gehalte in het pico-green methode. Kwantificering uitgedrukt als ug DNA per kern ± standaardafwijking. Asterisk geeft p <0,01 vergeleken met controle. Deze gegevens tonen aan dat decellularisatie vermindert DNA-gehalte aanzienlijk in de P3 neonatale hart. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
oad / 54459 / 54459fig6.jpg "/>
Figuur 6. histologie van P3 hart matrix 23 dagen na hercellularisatie met P1 mCherry uiten van hartspiercellen. Gekleurd met H & E (A, schaal = 250 pm, B, schaal = 50 pm), DAPI (C, schaal = 250 pm), NKX 2.5, mCherry, α-actinine, DAPI, en samengevoegd (D, E, F, G, H, schaal = 50 pm). We hebben de effectieve herbevolking van het collageen matrix met P1 hartspiercellen (AC) aangetoond. Daarnaast zagen we dat m-cherry positieve hartspiercellen te uiten Nkx2.5 en-α actinine 23 dagen na binnenkomst in het collageen matrix. Deze gegevens wijzen erop dat deze cellen behouden hun cardiomyocyt identiteit voor langere tijd. Klik hier om een grotere versie van deze f bekijkenIGUUR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De afhankelijkheid van deze techniek bij herhaalde perfusie van het hart maakt het vermijden van een embolie een essentieel onderdeel van een succesvol resultaat. Vanaf de eerste catheterisatie van het hart in de stappen 2,2-2,6, om de veranderingen van de oplossing tussen Steps 2,8-2,14, zijn er manipulaties dat de invoering van luchtbellen die afbreuk doen aan de stroom van perfusaat in de hartspier kan toestaan. Vanwege de kleine omvang van de neonatale hart, kunnen zelfs minuut bellen in het vaatstelsel een technisch infarct veroorzaken, waardoor waardoor de decellularisatie onvolledig. Bovendien, in de latere wasstappen, kan onvolledige perfusie resulteren in detergent residu dat een negatieve invloed op de biocompatibiliteit. Bovendien, een snelle temperatuurwisseling, zoals bij het verwijderen van de matrix van 4 ° C opslag zoals in stap 2,14, worden benaderd met zorg Daarnaast levert lucht belvorming kan zijn als opgelost gas beweegt uit de oplossing met de verandering in temperatuur. wkip procedure om hercellularisatie extra zorg te worden toegepast bij het bereiden van de spuit met de celsuspensie, om de infusie te waarborgen is luchtbel vrij (stap 6,4).
Het kan nodig zijn om de details van dit protocol manipuleren om andere weefsels tegemoet. Er zijn een aantal decellularisatie protocollen gemeld 4,9,11 die een leidraad zou kunnen bieden. Het einddoel (en) van elke ontcelling protocol moet de handhaving van de ECM eiwitstructuur en verwante biochemie en adequate verwijdering van natieve cellulaire componenten omvatten zoals bijvoorbeeld resterend DNA. In deze instelling, de toepassing van excessieve perfusiedruk leidt tot verstoring van de ECM ultrastructuur, die histologisch kunnen worden gevisualiseerd.
De grootte van de P3 muis hart legt een aantal beperkingen op mobiele administratie ten opzichte van volwassen weefsel. Terwijl volwassen harten vormen een dik genoeg ventriculaire muur die transmurale injectio maaktna eventuele levering cel modaliteit, P3 hart is klein genoeg dat een naald, waarvan de grootte niet een celsuspensie lyseren, heeft aanzienlijke schade aan het hart. Perfusie is een haalbare leveringsstrategie, maar hangt af van cellen van een bepaalde afmeting en vorm om effectief te leveren. Neonatale muizen myocyten werken goed in dit verband. Andere kleine ronde cellen ook aangetoond dat hiervoor 11 dienen. De omvang omvang van deze harten zich verzet tegen het gebruik van conventionele fysiologische functionele analyse zoals druk volume katheters. Andere benaderingen voor video-opname mogelijk te worden beschouwd.
Deze gegevens ondersteunen de haalbaarheid van decellularisatie en hercellularisatie van de neonatale muis hart. Eerdere studies hebben het gebruik van volwassen hart behoeve van decellularisatie / hercellularisatie studies aangetoond. De afkomstig van deze volwassen harten matrices zijn herbevolkt met neonatale hartspiercellen 4 en menselijkegeïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs) 17. Bij de hiPSCs, getoonde herbevolkt harten een afname van pluripotentie markers zoals NANOG, SOX2 en OCT4 en vormde spier-achtige structuren; alle wijzen van rijping. Het extracellulaire signalen van het ECM hebben echter aangetoond dat het een cruciale rol spelen bij de ontwikkeling van cellen, weefsels en organen die ons ertoe om te proberen om matrices van weefsels bekend regeneratievermogen haven genereren. In onze studies, tonen we aan dat recellularized harten nog steeds uit te drukken cardiomyocyt markers, zelfs na langdurige cultuur. Deze gegevens geven aan dat, met behulp van nieuwe matrices, hartspiercellen kunnen worden voor langere tijd zonder verlies van hun identiteit als cardiomyocyten gehandhaafd. Onze gegevens ondersteunen de techniek en de haalbaarheid voor decellularizing neonatale muis hart. De neonatale matrices kunnen potentieel voor het verschaffen van nieuwe constructen voor herbevolking studies en voor de productie van gels die zijn superior regeneratieve capaciteit. Met deze neonatale ECM zijn we nu bezig met de superioriteit van deze scaffolds functionele weefsels met verschillende celtypen, waaronder hiPSCs vormen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Materials for mouse heart isolation | |||
| P1 mouse pups (as shown; B6;D2-Tg(Myh6*-mCherry)2Mik/J) | Jackson Laboratories | 21577 | or equivalent |
| 60 mm Culture dish | BD Falcon | 353004 | or equivalent |
| Phosphate buffered saline pH 7.4 (sterile) | Hyclone | SH30256.01 | or equivalent |
| Single Use Blade | Stanley | 28-510 | or equivalent |
| Standard Scissors | Moria Bonn (Fine Science Tools) | 14381-43 | or equivalent |
| Spring Scissors 10 cm | Fine Science Tools | 15024-10 | or equivalent |
| Vannas Spring Scissors - 3 mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15000-00 | or equivalent |
| #5 Forceps | Dumnot (Fine Science Tools) | 11295-00 | or equivalent |
| 2. Materials for decellularization | |||
| Inlet adaptor | Chemglass | CG-1013 | autoclavable |
| Septum | Chemglass | CG-3022-99 | autoclavable |
| 1/8 in. ID x 3/8 OD C-Flex tubing | Cole-Parmer | EW-06422-10 | autoclavable |
| Male luer to 1/8" hose barb adaptor | McMaster-Carr | 51525K33 | autoclavable |
| Female luer to 1/8" hose barb adaptor | McMaster-Carr | 51525K26 | autoclavable |
| Prolene 7-0 surgical suture | Ethicon | 8648G | or equivalent |
| Ring stand | Fisher Scientific | S47807 | or equivalent |
| Clamp | Fisher Scientific | 05-769-6Q | or equivalent |
| Clamp regular holder | Fisher Scientific | 05-754Q | or equivalent |
| 60 cc syringe barrel | Coviden | 1186000777T | or equivalent |
| Beaker | Kimble | 14000250 | or equivalent |
| 22 G x 1 Syringe Needle | BD | 305155 | or equivalent |
| 12 cc syringe | Coviden | 8881512878 | or equivalent |
| 3-way stop cock | Smith Medical | MX5311L | or equivalent |
| PE50 tubing | BD Clay Adams Intramedic | 427411 | Must be formable by heat. Polyethylene recommended. |
| 1% SDS | Invitrogen | 15525-017 | Ultrapure grade recommended. Make up fresh solution and filter sterilize before use. |
| 1% Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Make up fresh solution from a 10% stock and filter sterilize before use. |
| Sterile dH2O | Hyclone | SH30538.02 | Or MilliQ system purified water. |
| 1x Pen/Strep | Corning CellGro | 30-001-Cl | or equivalent |
| 3. Materials for DNA quantitation | |||
| Proteinase K | Fisher | BP1700 | >30 U/mg activity |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | or equivalent |
| MgCl2·6H2O | Mallinckrodt | 5958-04 | or equivalent |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | or equivalent |
| Tris base/hydrochloride | Sigma-Aldrich | T1503/T5941 | or equivalent |
| Pico-Green dsDNA assay kit | Life Technologies | P7589 | requires fluorimeter to read |
| 4. Method for fixation and sectioning of tissue | |||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | or equivalent |
| Gelatin Type A from porcine skin | Sigma-Aldrich | G2500 | must be 300 bloom or greater |
| 5. Method for tissue histology | |||
| Cryomolds 10 x 10 x 5 mm | Tissue-Tek | 4565 | or equivalent |
| Cryostat | Hacker/Bright | Model OTF | or equivalent |
| Microscope Slides 25 x 75 x 1 mm | Fisher Scientific | 12-550-19 | or equivalent |
| Hematoxylin 560 | Surgipath/Leica Selectech | 3801570 | or equivalent |
| Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | or equivalent |
| Define | Surgipath/Leica Selectech | 3803590 | or equivalent |
| Blue buffer | Surgipath/Leica Selectech | 3802915 | or equivalent |
| Alcoholic Eosin Y 515 | Surgipath/Leica Selectech | 3801615 | or equivalent |
| Formula 83 Xylene substitute | CBG Biotech | CH0104B | or equivalent |
| Permount Mounting Medium | Fisher Chemical | SP15-500 | or equivalent |
| Collagen IV Antibody | Rockland | 600-401-106.1 | or equivalent |
| α-Actinin Antibody | Abcam | AB9465 | or equivalent |
| mCherry Antibody | Abcam | AB205402 | or equivalent |
| NKX2.5 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-8697 | or equivalent |
| Donkey anti-mouse AF488 Antibody | Life Technology | A21202 | or equivalent |
| Donkey anti-chicken AF594 Antibody | Jackson Immunoresearch | 703-585-155 | or equivalent |
| Donkey anti-goat CY5 Antibody | Jackson Immunoresearch | 705-175-147 | or equivalent |
| Fab Fragment Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) AF594 | Jackson Immunoresearch | 111-587-003 | or equivalent |
| Prolong Gold Antifade Mountant with DAPI | ThermoFisher | P36930 | or equivalent |
| 6. Isolation of neonatal ventricular cardiomyocytes using pre-plating | |||
| HBSS (Ca, Mg Free) | Hyclone | SH30031.02 | or equivalent |
| HEPES (1 M) | Corning CellGro | 25-060-Cl | or equivalent |
| Cell Strainer | BD Falcon | 352340 | or equivalent |
| 50 ml tube | BD Falcon | 352070 | or equivalent |
| Primeria 100 mm plates | Corning | 353803 | Primeria surface enhances fibroblast attachment promoting a higher myocyte purity |
| Trypsin | Difco | 215240 | or equivalent |
| DNase II | Sigma-Aldrich | D8764 | or equivalent |
| DMEM (Delbecco's Minimal Essential Media) | Hyclone | SH30022.01 | or equivalent |
| Vitamin B12 | Sigma-Aldrich | V6629 | or equivalent |
| Fibronectin coated plates | BD Bioscience | 354501 | or equivalent |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30910.03 | or equivalent |
| Heart bioreactor glassware | Radnoti Glass Technology | 120101BEZ | Must be sterilizable by autoclaving or gas. |
References
- Yusen, R. D., et al. Registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: Thirty-second official adult lung and heart-lung transplantation report--2015. J Heart Lung Transplant. 34 (10), 1264-1277 (2015).
- Go, A. S., et al. Heart disease and stroke statistics--2014 update: A report from the american heart association. Circulation. 129 (3), e28-e292 (2014).
- Kapelios, C. J., Nanas, J. N., Malliaras, K. Allogeneic cardiosphere-derived cells for myocardial regeneration: current progress and recent results. Future Cardiol. 12 (1), 87-100 (2016).
- Ott, H. C., et al. Perfusion decellularized matrix: Using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat Med. 14 (2), 213-221 (2008).
- Porrello, E. R., Olson, E. O. A neonatal blueprint for cardiac regeneration. Stem Cell Research. 13 (3 Pt B), 556-570 (2014).
- Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).
- Polizzotti, B. D., et al. Neuregulin stimulation of cardiomyocyte regeneration in mice and human myocardium reveals a therapeutic window. Sci Transl Med. 7 (281), 281ra45 (2015).
- Jesty, S. A., et al. c-kit+ precursors support postinfarction myogenesis in the neonatal, but not adult, heart. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (33), 13380-13385 (2012).
- Ambrosy, A. P., et al. The Global Health and Economic Burden of Hospitalizations for Heart Failure: Lessons Learned From Hospitalized Heart Failure Registries. J Am Coll Cardiol. 63 (12), 1123-1133 (2014).
- Roger, V. L., et al. Executive Summary: Heart Disease and Stroke Statistics-2012 Update A Report From the American Heart Association. Circulation. 125 (22), 188-197 (2012).
- Kennedy-Lydon, T., Rosenthal, N. Cardiac regeneration: epicardial mediated repair. Proc R Soc B. 282 (1821), 2147-2172 (2015).
- Williams, C., Sullivan, K., Black, L. D. Partially Digested Adult Cardiac Extracellular Matrix Promotes Cardiomyocyte Proliferation In Vitro. Adv Healthcare Mat. 4 (10), 1545-1554 (2015).
- Borg, T. K., et al. Recognition of extracellular matrix components by neonatal and adult cardiac myocytes. Dev Biol. 104 (1), 86-96 (1984).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immnol. 111, A3-B1-3 (2015).
- Gilbert, T. W., Freund, J. M., Badylak, S. F. Quantification of DNA in biologic scaffold materials. J Surg Res. 152 (1), 135-139 (2009).
- Akhyari, P., et al. The quest for an optimized protocol for whole-heart decellularization: a comparison of three popular and a novel decellularization technique and their diverse effects on crucial extracellular matrix qualities. Tissue Eng Part C Methods. 17 (9), 915-926 (2011).
- Lu, T. Y., et al. Repopulation of decellularized mouse heart with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular progenitor cells. Nat Commun. 4 (2307), 1-11 (2013).
