In deze studies geven we nieuwe methodologie voor neonatale muizen cardiale scaffolds voor gebruik in regeneratieve studies.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Neonatale Cardiac Steigers: Novel Matrices voor Regenerative Studies
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De enige definitieve therapie voor hartfalen in het eindstadium is ortotopische harttransplantatie. Elk jaar wordt geschat dat er meer dan 100.000 donorharten nodig zijn voor harttransplantatieprocedures in de Verenigde Staten1-2. Vanwege het beperkte aantal donoren, worden er elk jaar ongeveer 2.400 transplantaties uitgevoerd in de VS2. Er zijn talrijke benaderingen ondernomen, van celtherapiestudies tot implantatie van mechanische hulpapparaten, hetzij alleen of in combinatie, in een poging om het hart te bewegen om zichzelf te repareren of om het falende hart te laten rusten3. Ondanks deze inspanningen worden ventrikel-assist-apparaten nog steeds grotendeels gebruikt om de overbrugging naar transplantatie mogelijk te maken en is de bruikbaarheid van celtherapieën, hoewel ze enige curatieve belofte bieden, nog steeds beperkt tot klinische onderzoeken. Bovendien is directe xenotransplantatie geprobeerd, maar het succes is beperkt gebleven vanwege immuunafwijzing. Het is duidelijk dat een andere strategie nodig is om extra organen voor transplantatie te produceren en, idealiter, zouden deze organen autoloog moeten zijn om de complicaties geassocieerd met afstoting en levenslange immunosuppressie te voorkomen. Decellulatie is een proces van het verwijderen van residente cellen uit weefsels om de inheemse extracellulaire matrix (ECM) of scaffold bloot te leggen. Perfusie decellulatie biedt volledige behoud van de driedimensionale structuur van het weefsel, terwijl het grootste deel van de mechanische eigenschappen van het weefsel intact blijft4. Deze scaffolds kunnen worden gebruikt voor bevolking met gezonde cellen om onderzoeksmodellen en, mogelijk, broodnodige organen voor transplantatie te genereren. We hebben de scaffolds van neonatale muizen (P3), bekend om hun opmerkelijke vermogen tot hartregeneratie,5-8 blootgesteld aan detergent-gemedieerde decellulatie en we hebben deze scaffolds opnieuw bevolkt met muis-cardiale cellen. Deze studies ondersteunen de haalbaarheid van het engineeren van een neonataal hartconstruct. Ze laten ook toe om te onderzoeken of de ECM van vroeg postnatale harten aanwijzingen kan bevatten die resulteren in verbeterde hercellulatisatiestrategieën.
Inleiding
Hartfalen komt vaak voor en dodelijk. Het is een progressieve ziekte die resulteert in verlaagde contractiliteit van het hart, die bloedtoevoer aan organen schaadt en laat de metabolische behoeften van het lichaam onvervulde. Men schat dat 5,7 miljoen Amerikanen hebben hartfalen en het is de voornaamste oorzaak van ziekenhuisopname in de Verenigde Staten 9. De gezamenlijke kosten van de behandeling van patiënten bij hartfalen in de Verenigde Staten meer dan $ 300.000.000.000 dollar per jaar 9-10. De enige definitieve therapie voor eindstadium hartfalen is orthotope harttransplantatie. Elk jaar, wordt geschat dat meer dan 100.000 donorharten zijn....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle muizen experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de Amerikaanse Animal Welfare Act en werden aan de Universiteit van Minnesota door de Institutional Animal Care en gebruik Comite goedgekeurd.
1. Werkwijze voor muizenhart Isolation
- Euthanaseren een neonatale muis door onthoofding met een eenmalig gebruik mes.
- Zwabberen de thorax met 70% ethanol.
- Ontleden de huid van de borst door snijden vanaf de borstwand met standaard schaar en trek de huid lateraal met een paar van # 5 tang.
- Perforeren buik net inferieur aan het borstbeen met de schaar door doorsnijden van de buikwand. Grijpen de processus xiphoideus....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
decellularisatie
Gemiddeld is de tijd decellularisatie P3 van een hart met dit protocol is ongeveer 14 uur. een gemiddelde hart gewicht van 23 mg voor de P3 pasgeborene.
Acellularity
Figuur 3a toont een volledig intacte P3 neonatale hart (hele mount). Figuur 3b toont dezelfde hart volgende cellen ontdoen. De figuren 4a en 4b de hematoxyline en eo.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De afhankelijkheid van deze techniek bij herhaalde perfusie van het hart maakt het vermijden van een embolie een essentieel onderdeel van een succesvol resultaat. Vanaf de eerste catheterisatie van het hart in de stappen 2,2-2,6, om de veranderingen van de oplossing tussen Steps 2,8-2,14, zijn er manipulaties dat de invoering van luchtbellen die afbreuk doen aan de stroom van perfusaat in de hartspier kan toestaan. Vanwege de kleine omvang van de neonatale hart, kunnen zelfs minuut bellen in het vaatstelsel een technisc.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs danken mevrouw Cynthia DeKay hartelijk voor de voorbereiding van de figuren.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 1. Materialen voor muishart isolatie | |||
| P1 muis puppen (zoals getoond; B6;D2-Tg(Myh6*-mCherry)2Mik/J) | Jackson Laboratories | 21577 | of equivalent |
| 60 mm Cultuurschaal | BD Falcon | 353004 | of equivalent |
| Fosfaat gebufferde zoutoplossing pH 7.4 (steriele) | Hyclone | SH30256.01 | of equivalent |
| Mes voor eenmalig gebruik | Stanley | 28-510 | of equivalent |
| Standaard schaar | Moria Bonn (Fine Science Tools) | 14381-43 | of equivalent |
| Veer schaar 10 cm | Fine Science Tools | 15024-10 | of equivalent |
| Vannas veer schaar - 3 mm snijkant | Fine Science Tools | 15000-00 | of equivalent |
| #5 Pincet | Dumnot (Fine Science Tools) | 11295-00 | of equivalent |
| 2. Materialen voor decellurisatie | |||
| Inlaatadapter | Chemglass | CG-1013 | autoclaveerbaar |
| Septum | Chemglass | CG-3022-99 | autoclaveerbaar |
| 1/8 inch ID x 3/8 OD C-Flex slang | Cole-Parmer | EW-06422-10 | autoclaveerbaar |
| Mannelijke luer naar 1/8" slangenslang adapter | McMaster-Carr | 51525K33 | autoclaveerbaar |
| Vrouwelijke luer naar 1/8" slangenslang adapter | McMaster-Carr | 51525K26 | autoclaveerbaar |
| Prolene 7-0 chirurgische hechting | Ethicon | 8648G | of equivalent |
| Ring standaard | Fisher Scientific | S47807 | of equivalent |
| Klem | Fisher Scientific | 05-769-6Q | of equivalent |
| Klem reguliere houder | Fisher Scientific | 05-754Q | of equivalent |
| 60 cc spuit vat | Coviden | 1186000777T | of equivalent |
| Beker | Kimble | 14000250 | of equivalent |
| 22 G x 1 Spuitnaald | BD | 305155 | of equivalent |
| 12 cc spuit | Coviden | 8881512878 | of equivalent |
| 3-weg stopkraan | Smith Medical | MX5311L | of equivalent |
| PE50 slang | BD Clay Adams Intramedic | 427411 | Moet warmtevormbaar zijn. Polyethyleen aanbevolen. |
| 1% SDS | Invitrogen | 15525-017 | Ultrapure kwaliteit aanbevolen. Maak verse oplossing en filter steriliseer voor gebruik. |
| 1% Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Maak verse oplossing van een 10% stock en filter steriliseer voor gebruik. |
| Steriele dH2O | Hyclone | SH30538.02 | Of MilliQ systeem gezuiverd water. |
| 1x Pen/Strep | Corning CellGro | 30-001-Cl | of equivalent |
| 3. Materialen voor DNA kwantificering | |||
| Proteinase K | Fisher | BP1700 | >30 U/mg activiteit |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | of equivalent |
| MgCl2.6H2O | Mallinckrodt | 5958-04 | of equivalent |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | of equivalent |
| Tris base/hydrochloride | Sigma-Aldrich | T1503/T5941 | of equivalent |
| Pico-Green dsDNA assay kit | Life Technologies | P7589 | vereist fluorimeter om te lezen |
| 4. Methode voor fixatie en sectie van weefsel | |||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | of equivalent |
| Gelatine Type A van varkenshuid | Sigma-Aldrich | G2500 | moet 300 bloom of hoger zijn |
| 5. Methode voor weefsel histologie | |||
| Cryomolds 10 x 10 x 5 mm | Tissue-Tek | 4565 | of equivalent |
| Cryostat | Hacker/Bright | Model OTF | of equivalent |
| Microscoopglazen 25 x 75 x 1 mm | Fisher Scientific | 12-550-19 | of equivalent |
| Hematoxyline 560 | Surgipath/Leica Selectech | 3801570 | of equivalent |
| Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | of equivalent |
| Define | Surgipath/Leica Selectech | 3803590 | of equivalent |
| Blauwe buffer | Surgipath/Leica Selectech | 3802915 | of equivalent |
| Alcoholische Eosin Y 515 | Surgipath/Leica Selectech | 3801615 | of equivalent |
| Formule 83 Xyleen vervanger | CBG Biotech | CH0104B | of equivalent |
| Permount Montage Medium | Fisher Chemical | SP15-500 | of equivalent |
| Collageen IV Antilichaam | Rockland | 600-401-106.1 | of equivalent |
| α-Actinin Antilichaam | Abcam | AB9465 | of equivalent |
| mCherry Antilichaam | Abcam | AB205402 | of equivalent |
| NKX2.5 Antilichaam | Santa Cruz Biotechnology | SC-8697 | of equivalent |
| Donkey anti-muis AF488 Antilichaam | Life Technology | A21202 | of equivalent |
| Donkey anti-kip AF594 Antilichaam | Jackson Immunoresearch | 703-585-155 | of equivalent |
| Donkey anti-geit CY5 Antilichaam | Jackson Immunoresearch | 705-175-147 | of equivalent |
| Fab Fragment Goat Anti-Konijn IgG (H+L) AF594 | Jackson Immunoresearch | 111-587-003 | of equivalent |
| Prolong Gold Antifade Mountant met DAPI | ThermoFisher | P36930 | of equivalent |
| 6. Isolatie van neonatale ventrikel cardiomyocyten met behulp van voorbeplanting | |||
| HBSS (Ca, Mg Vrij) | Hyclone | SH30031.02 | of equivalent |
| HEPES ( | |||
Referenties
- Yusen, R. D., et al. Registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: Thirty-second official adult lung and heart-lung transplantation report--2015. J Heart Lung Transplant. 34 (10), 1264-1277 (2015).
- Go, A. S., et al.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
