Neonatal Cardiac Stillas: Nye matriser for Regenerative Studies

Summary

I disse studiene gir vi metodikk for nye, nyfødte, murine hjerte stillas for bruk i regenerativ studier.

Abstract

The only definitive therapy for end stage heart failure is orthotopic heart transplantation. Each year, it is estimated that more than 100,000 donor hearts are needed for cardiac transplantation procedures in the United States^1-2. Due to the limited numbers of donors, only approximately 2,400 transplants are performed each year in the U.S.². Numerous approaches, from cell therapy studies to implantation of mechanical assist devices, have been undertaken, either alone or in combination, in an attempt to coax the heart to repair itself or to rest the failing heart³. In spite of these efforts, ventricular assist devices are still largely used for the purpose of bridging to transplantation and the utility of cell therapies, while they hold some curative promise, is still limited to clinical trials. Additionally, direct xenotransplantation has been attempted but success has been limited due to immune rejection. Clearly, another strategy is required to produce additional organs for transplantation and, ideally, these organs would be autologous so as to avoid the complications associated with rejection and lifetime immunosuppression. Decellularization is a process of removing resident cells from tissues to expose the native extracellular matrix (ECM) or scaffold. Perfusion decellularization offers complete preservation of the three dimensional structure of the tissue, while leaving the bulk of the mechanical properties of the tissue intact⁴. These scaffolds can be utilized for repopulation with healthy cells to generate research models and, possibly, much needed organs for transplantation. We have exposed the scaffolds from neonatal mice (P3), known to retain remarkable cardiac regenerative capabilities,^5-8 to detergent mediated decellularization and we repopulated these scaffolds with murine cardiac cells. These studies support the feasibility of engineering a neonatal heart construct. They further allow for the investigation as to whether the ECM of early postnatal hearts may harbor cues that will result in improved recellularization strategies.

Introduction

Hjertesvikt er vanlig og dødelig. Det er en progressiv sykdom som resulterer i redusert kontraktilitet av hjertet, noe som svekker blodstrømmen til organene og etterlater de metabolske krav av kroppen udekket. Det er anslått at 5,7 millioner amerikanere har hjertesvikt, og det er den primære årsaken til sykehusinnleggelse i USA ^ni. Den kollektive kostnaden for behandling av pasienter i hjertesvikt i USA overstiger $ 300 milliarder dollar per år ^9-10. Den eneste definitive terapi for slutten scenen hjertesvikt er orthotopic hjertetransplantasjon. Hvert år er det anslått at mer enn 100.000 donor hjerter er behov for hjertetransplantasjons prosedyrer i USA ^1-2. På grunn av begrenset antall givere, er det bare ca 2400 transplantasjoner utføres hvert år i USA ^to. Åpenbart må håndteres som andre strategier er nødvendig for å produsere flere organer for transplanta dette organet mangelsjon, og vil ideelt disse organene vil være autolog for derved å unngå komplikasjoner forbundet med avvisning og levetid immunsuppresjon.

Pattedyr voksne cardiomyocytes demonstrere en begrenset evne til reproduksjon ved skade, men nyere bevis tyder på at pattedyr neonatale hjerter opprettholde en bemerkelsesverdig evne til reproduksjon etter skade ^5-8. Nærmere bestemt, etter delvis kirurgisk reseksjon, en regenerativ vindu har blitt oppdaget mellom fødsel og postnatal dag 7. Dette regenerativ periode er kjennetegnet ved en mangel på fibrotiske arr, dannelse av neovaskularisering, frigjøring av angiogene faktorer fra epikard og kardiomyocytt proliferasjon ^{5-8 , 11.} Denne regenerative tidsvindu gir mulighet for ved hjelp av neonatal hjertet som en ny kilde av materiale for utvikling av en kunstig biologisk hjerte.

Den ekstracellulære matriks er kjent for å gi viktige signaler for å fremme cardiomyocyte spredning og vekst. Tydelige forskjeller i tilgjengeligheten av molekyler i neonatale og voksne matriser ¹² og deres evne til å fremme regenerering har utforsket ^13. Decellularized voksen matrikser har blitt anvendt i mange studier for å tilveiebringe en ECM stillas for cellulær repopulation og generering av en kunstig biologisk hjerte. Selv om disse studiene, og nye funn i stamcelleteknologi, er på fremmarsj raskt, flere hindringer ennå ikke er oppfylt. For eksempel, begrensninger i å bevare native struktur hos matriksen, cellulære integrering i matriksen vegg, og evne til å støtte proliferasjonen og veksten alle grense suksess for denne tilnærmingen. Mens overlegne regenerative egenskaper har blitt tilskrevet nyfødt hjertet, har de praktiske sidene ved å bruke en slik vev begrenset sin leting.

Med utgangspunkt i den påviste evne til reproduksjon av den neonatale hjerte, har vi utviklet nye matriser ved å utvikle enTeknikken med decellularization for P3 musen hjerte. P3 hjerte ble valgt for disse studiene som det er innenfor vinduet i hjerte regenerering som tidligere bestemt ⁶ men hjertet er stort nok til å høste, decellularize og recellularize. Målet med denne studien er å demonstrere gjennomførbarheten av å skape en matrise fra en neonatal mus hjerte. Våre undersøkelser gir bevis for muligheten for decellularizing et minutt, neonatal hjerte og samtidig opprettholde den strukturelle og protein integritet ECM. Vi viser også evnen til å recellularize denne hjerte ECM med mCherry uttrykker kardiomyocytter og vi har undersøkt disse kardiomyocytter for ekspresjon av forskjellige hjertemarkører følgende recellularization. Denne teknologien vil gi rom for testing av overlegenhet av en neonatal matrise for utvikling av en kunstig biologisk hjerte.

Protocol

Alle mus forsøkene ble utført i henhold til US dyrevernloven, og ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved University of Minnesota. 1. Metode for Mus Hjerte Isolation Avlive en neonatal mus ved halshogging med en engangsbruk blad. Vattpinne thorax med 70% etanol. Dissekere huden fra brystet ved å kutte det bort fra brystveggen med standard saks mens du trekker huden lateralt med et par # 5 tang. Perforere magen bare dårligere til sternum med saksen…

Representative Results

Decellularization I gjennomsnitt var på tide å decellularization av en P3 hjerte ved hjelp av denne protokollen er ca 14 timer. gitt en gjennomsnittlig hjertevekt på 23 mg for P3 nyfødte. Acellularity Figur 3a viser en fullt intakt P3 neonatal hjerte (hel mount). Figur 3b viser det samme hjerte følgende decellularization. Figurene 4a og 4b v…

Discussion

Avhengigheten av denne teknikken ved gjentatte perfusjoner hjertets gjør unngåelse av en embolisme en kritisk komponent for et vellykket resultat. Fra den første kateterisering av hjertet i trinn 2,2-2,6, til endringer av oppløsning mellom trinnene 2.8-2.14, er det manipulasjoner som kan tillate innføring av luftbobler som forstyrrer strømningen av perfusatet til myokard. På grunn av den lille størrelsen på neonatal hjerte, kan selv små bobler i blodkar føre en teknisk infarktet, og dermed gjengi decellulariz…

Materials

1. Materials For Mouse Heart Isolation
P1 mouse pups (as shown; B6;D2-Tg(Myh6*-mCherry)2Mik/J)	Jackson Laboratories	21577	or equivalent
60 mm Culture dish	BD Falcon	353004	or equivalent
Phosphate buffered saline pH 7.4 (sterile)	Hyclone	SH30256.01	or equivalent
Single Use Blade	Stanley	28-510	or equivalent
Standard Scissors	Moria Bonn (Fine Science Tools)	14381-43	or equivalent
Spring Scissors 10 cm	Fine Science Tools	15024-10	or equivalent
Vannas Spring Scissors – 3mm Cutting Edge	Fine Science Tools	15000-00	or equivalent
#5 Forceps	Dumnot (Fine Science Tools)	11295-00	or equivalent
2. Materials For Decellularization
Inlet adaptor	Chemglass	CG-1013	autoclavable
Septum	Chemglass	CG-3022-99	autoclavable
1/8 in. ID x 3/8 OD C-Flex tubing	Cole-Parmer	EW-06422-10	autoclavable
Male luer to 1/8" hose barb adaptor	McMaster-Carr	51525K33	autoclavable
Female luer to 1/8" hose barb adaptor	McMaster-Carr	51525K26	autoclavable
Prolene 7-0 surgical suture	Ethicon	8648G	or equivalent
Ring stand	Fisher Scientific	S47807	or equivalent
Clamp	Fisher Scientific	05-769-6Q	or equivalent
Clamp regular holder	Fisher Scientific	05-754Q	or equivalent
60 cc syringe barrel	Coviden	1186000777T	or equivalent
Beaker	Kimble	14000250	or equivalent
22g x 1 Syringe Needle	BD	305155	or equivalent
12 cc syringe	Coviden	8881512878	or equivalent
3-way stop cock	Smith Medical	MX5311L	or equivalent
22 x 1 g needle	BD	305155	or equivalent
PE50 tubing	BD Clay Adams Intramedic	427411	Must be formable by heat. Polyethylene recommended
1% SDS	Invitrogen	15525-017	Ultrapure grade recommended. Make up fresh solution and filter sterilize before use.
1% Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Make up fresh solution from a 10% stock and filter sterilize before use.
Sterile dH2O	Hyclone	SH30538.02	Or MilliQ system purified water.
1X Pen/Strep	Corning CellGro	30-001-Cl	or equivalent
3. Materials For DNA Quantitation
Proteinase K	Fisher	BP1700	>30U/mg activity
KCl	Sigma-Aldrich	P9333	or equivalent
MgCl*6H2O	Mallinckrodt	5958-04	or equivalent
Tween 20	Sigma-Aldrich	P1379	or equivalent
Tris base/hydrochloride	Sigma-Aldrich	T1503/T5941	or equivalent
Pico-Green dsDNA assay kit	Life Technologies	P7589	requires fluorimeter to read
4. Method for fixation and sectioning of tissue.
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	or equivalent
Gelatin Type A from porcine skin	Sigma-Aldrich	G2500	must be 300 bloom or greater
5. Method for tissue histology
Cryomolds 10 x 10 x 5mm	Tissue-Tek	4565	or equivalent
Cryostat	Hacker/Bright	Model OTF	or equivalent
Microscope Slides  25 x 75 x 1 mm	Fisher Scientific	12-550-19	or equivalent
Hematoxylin 560	Surgipath/Leica Selectech	3801570	or equivalent
Ethanol	Decon Laboratories	2701	or equivalent
Define	Surgipath/Leica Selectech	3803590	or equivalent
Blue buffer	Surgipath/Leica Selectech	3802915	or equivalent
Alcoholic Eosin Y 515	Surgipath/Leica Selectech	3801615	or equivalent
Formula 83 Xylene substitute	CBG Biotech	CH0104B	or equivalent
Permount Mounting Medium	Fisher Chemical	SP15-500	or equivalent
Collagen IV Antibody	Rockland	600-401-106.1	or equivalent
α-Actinin Antibody	Abcam	AB9465	or equivalent
mCherry Antibody	Abcam	AB205402	or equivalent
NKX2.5 Antibody	Santa Cruz Biotechnology	SC-8697	or equivalent
Donkey anti-mouse AF488 Antibody	Life Technology	A21202	or equivalent
Donkey anti-chicken AF594 Antibody	Jackson Immunoresearch	703-585-155	or equivalent
Donkey anti-goat CY5 Antibody	Jackson Immunoresearch	705-175-147	or equivalent
Fab Fragment Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) AF594	Jackson Immunoresearch	111-587-003	or equivalent
Prolong Gold Antifade Mountant with DAPI	ThermoFisher	P36930	or equivalent
6. Isolation of neonatal ventricular cardiomyocytes using pre-plating.
HBSS (Ca, Mg Free)	Hyclone	SH30031.02	or equivalent
HEPES (1M)	Corning CellGro	25-060-Cl	or equivalent
Cell Strainer	BD Falcon	352340	or equivalent
50 mL tube	BD Falcon	352070	or equivalent
Primeria 100 mm plates	Corning	353803	Primeria surface enhances fibroblast attachment promoting a higher myocyte purity
Trypsin	Difco	215240	or equivalent
DNase II	Sigma-Aldrich	D8764	or equivalent
DMEM (Delbecco's Minimal Essential Media)	Hyclone	SH30022.01	or equivalent
Vitamin B12	Sigma-Aldrich	V6629	or equivalent
Fibronectin coated plates	BD Bioscience	354501	or equivalent
Fetal bovine serum	Hyclone	SH30910.03	or equivalent
Heart bioreactor glassware	Radnoti Glass Technology	120101BEZ	Must be sterilizable by autoclaving or gas.