Summary
Bu çalışmalarda, biz rejeneratif çalışmalarda kullanılmak üzere yeni, yenidoğan murin kardiyak iskeleleri için bir yöntem sağlamak.
Introduction
Kalp yetmezliği yaygın ve ölümcül olduğunu. Bu organlara kan akışını bozar ve vücut karşılanmamış metabolik taleplerini bırakır kalp, azalmış kontraktilite ile sonuçlanan ilerleyici bir hastalıktır. 5,7 milyon Amerikalı kalp yetmezliği olduğu tahmin ve Amerika Birleşik Devletleri'nde 9 hastanede birincil nedenidir edilir. Amerika Birleşik Devletleri'nde kalp yetersizliğinde hastaların tedavisinde kolektif maliyet yıllık 9-10 başına 300 $ milyar doları aşmaktadır. son dönem kalp yetmezliği için tek kesin tedavi ortotopik kalp naklidir. Her yıl, 100.000'den fazla verici kalplerinde Birleşik Devletler 1-2'de kalp nakli işlemleri için gerekli olduğu tahmin edilmektedir. Nedeniyle donörlerin sınırlı sayıda için, sadece yaklaşık 2.400 nakli ABD 2 her yıl yapılmaktadır. Açıkçası, bu organ yetersizliği diğer stratejiler nakline için ek organları üretmek için gerekli olarak ele alınması gerekenreddi ve kullanım süresi bağışıklık bastırılması ile ilişkilidir komplikasyonları önlemek için yon ve ideal olarak, bu organlar otolog olabilir.
Memeli yetişkin kardiyomiyositlerde yaralanması üzerine sınırlı bir rejeneratif kapasitesini göstermek ama son kanıtlar memeli yenidoğan kalpleri yaralanma 5-8 aşağıdaki olağanüstü rejeneratif kapasitesini korumak olduğunu göstermektedir. Özellikle, kısmi cerrahi rezeksiyon sonrasında bir rejeneratif pencere doğum ve doğum sonrası gün arasında bulunmuştur 7. Bu rejeneratif dönemi fibrotik skar eksikliği, neovaskülarizasyon oluşumu, epicardium gelen anjiyogenik faktörlerin salınımı, kardiyomyosit çoğalması 5-8 ile karakterizedir 11. Bu zaman reaktif pencere biyoyapay kalbin gelişiminde malzemenin yeni bir kaynak olarak yenidoğan kalp kullanarak potansiyel sağlar.
hücre dışı matris cardiomyocyt teşvik etmek için önemli ipuçları sağlamak için bilinene çoğalması ve büyümesi. Yenidoğan ve yetişkin matrisler 12 ve yenilenmesini teşvik etme yeteneği moleküllerin durumu belirgin farklılıklar 13 araştırılmıştır. Hücresizleştirilmiş yetişkin matrisler hücre yeniden popüle bir ECM iskele ve biyosentetik bir kalp üretimi temin etmek üzere çeşitli çalışmalarda kullanılmıştır. kök hücre teknolojileri bu çalışmalar ve yeni keşifler, hızla ilerleyen ederken, birkaç engeller yerine getirilmesi için henüz. Örneğin, matris duvara matrisin doğal yapısını, hücre entegrasyon korunmasında sınırlamalar ve yeteneği bu yaklaşımın başarısı çoğalmasına ve büyüme tüm sınır desteklemek. Üstün rejeneratif özellikler yenidoğan kalp atfedilen olsa da, böyle bir doku kullanarak pratik yönleri onun keşif sınırlıdır.
Yenidoğan kalp gösterdi rejeneratif kapasitesi dayanarak, bir geliştirerek yeni matris geliştirdikP3 fare kalp için Decellularization tekniği. Daha önce 6 belirlenir, ancak kalp hasat, decellularize ve recellularize için yeterince büyük olduğu gibi kardiyak rejenerasyon pencere içinde olduğu gibi P3 kalp bu çalışmalar için seçildi. Bu çalışmanın amacı, bir yenidoğan fare kalp bir matris oluşturmak fizibilite göstermektir. Çalışmalarımız ECM yapısal ve proteinli bütünlüğünü koruyarak bir dakika, yenidoğan kalp decellularizing fizibilitesi için kanıt. Biz de MCherry ifade eden kardiyomiyositlerinin bu kalp ECM recellularize yeteneğini göstermek ve recellularization aşağıdaki çeşitli kardiyak belirteçlerin ifadesi için bu kardiyomiyositlerde inceledik. Bu teknoloji, bir biyosentetik kalbin gelişiminde neonatal matrisin üstünlük denemeden geçirilmesine izin verecektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm fare deneyleri ABD Hayvan Refahı Yasası uyarınca yapılmış ve Minnesota Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi.
Fare Kalp İzolasyon 1. Yöntem
- tek kullanımlık bıçak ile kafaları kesilmek suretiyle bir yenidoğan fare Euthanize.
- % 70 etanol ile toraks çubukla.
- # 5 forseps bir çift ile yanal cildi çekerken standart makas ile göğüs duvarından onu uzak keserek göğüs cildi parçalara ayır.
- Karın duvarından keserek makas ile sternum sadece alt karın Perfore. makasla göğüs iki tarafında kaburga olsa kesim sırasında 5. forseps ile kılıç şeklinde sürecini kavratmak, vücuttan rostrally sternum geri çekin. göğüs kafesi kalbi ortaya çıkarmak için forseps ile superior yansıtılır.
- Açık açık teşhir, 5. forseps ile yanal çekerek timus iki ana lob teşrihAort kemer yanı sıra kaval ve pulmoner venler.
- 10 cm yaylı makas ile aortik arktan önemli arterler, aorta kendisi transect. Kalbin taban ve brakiyosefalik arter arasında aort saklayın. trakea ve özefagus ayıran, öne kalbi yansıtmak için # ile 5 forseps kopmuş gemilerin uçlarını kavrayın.
- 10 cm yaylı makas ile, kalbin her iki tarafta da akciğer ve kalp arasında keserek, pulmoner damar ve diğer büyük damarlar transeksiyonu. damarlar drenaj sağlamak için açık kalır.
- büyük damarların kesik kenarlarından tutarak, 5. forseps ile mediastinumdan kalbi çıkarın. kateterizasyon için steril fosfat tamponlu tuz (PBS) ihtiva eden bir 60 mm kültür çanağı kalbi yerleştirin.
Langendorff perfüzyonu ile Decellularization 2. Yöntem
- önceden kateter hazırlayınız. 4 cm'lik bölümünü çizmekPE küçük bir alkol alevinde 50 boru küçük, daha ince kateteri oluşturun. Boyutları karşılamak için bir bıçak ile biter süs (Yaklaşık. Yakl. 500 mikron OD bir flanş ile 300 mikron dış çap OD) Şekil 1'de gösterildiği. Bu çekme her iki tarafında iki simetrik kateterleri sağlayacaktır.
- İnce ucunda açılış üzerine flanş eritmek için, kısaca ateşe hortumun kesik ucunu yönlendirin.
- PBS ile 12 ml şırınga doldurun ve şırınga 3-yollu stopcock koyarak kateter monte edin. stopcock bir 22 G x 1 iğne ekleyin ve septum boyunca iğne sürücü. Iğne (Şek. 1) üzerine çizilmiş PE boru kateteri kaydırın.
- tüm hava kabarcıkları bertaraf edildiğini güvence PBS ile monte parçaları sulamak.
- aort kapak geçmiş uzanan değil, izole kalp aort içine, yukarıda özetlenen ve 7-0 sütür bir kravat Arter olarak hazırlanan kateteri, yerleştirin. t flanşı istirahatO sıkı bir mühür yapmak ve kateter çıkmasını kalbi önlenmesi, kravat karşı proksimal kateter.
- nazikçe PBS içeren şırınga kullanarak kalbi perfüze iken, büyütme altında kateterizasyon gözlemleyin. Orada hiçbir sızıntı sistemde ve gizli kan kaldırılır gibi doku homojen blanches emin olun.
- giriş adaptörü boynuna septum yerleştirin ve cam üzerinde tarafı katlanarak mühür.
- Şekil l'de gösterildiği gibi, 20 mm Hg basıncı üreten bir sütun üretilmesi için yeterli uzunlukta bir hat ile distile su içinde% 1 sodyum dodesil sülfat (SDS), 60 ml (DH 2 O) ile dolu hazne takın. 1. 1 mm Hg ilişkisine dayalı sıvı sütunu yüksekliği baskısı hesaplayın 1,3595 cm H 2 O eşittir
Dikkat: SDS tahriş edici özelliklere sahip son derece yün tozdur. İletişim kaçınılmalıdır. Uygun koruyucu giysi kullanılarak toz anlaştım. - 14 saat boyunca,% 1 SDS ile kalp serpmek. Kalp gözlemlenebilir kalan doku ile görünüş olarak saydam olacak.
- Kalan SDS çözeltisi musluk sistemi kadar yıkayın ve 10 ml dH 2 O ile değiştirin 1x penisilin streptomisin (LTR yükseltici) durumunda ihtiva eden 60 ml PBS ve ardından 10 mi dH 2 O ve ardından (damıtılmış su içinde seyreltilmiş), 10 ml% 1 Triton X-100 ile kalp, serpmek.
- 4 ° C'de 1x Pen-Strep ile PBS içinde kalp saklayın. amaçlanan sonrası decellularization uygulama daha sonra aorta kateter sağlanmalıdır perfüzyon gerektiriyorsa, aksi takdirde dikiş kravat kesmek ve kateter çıkarın.
3. DNA tayini
- 50 mM KCI 200 ug / ml proteinaz K ile hücresizleştirilmiş ECM veya bir kalp atım bir özetini Hazırlama, 2.5 mM MgCI, 10 mM Tris (pH 8.3) içinde bir 2,% 0.45 Tween 20.
- Doku çözünene kadar çalkalanarak 55 ° C'de doku inkübe,4-5 saat.
- Tahlili 4,11 bağlanma DNA ile homojenat DNA içeriği nicelleştirmektedir.
4. Sabitleme ve Doku Kesit
- Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca PBS içinde% 4 paraformaldehid hücresizleştirilmiş, recellularized veya kontrol P3 kalpleri düzeltildi.
- PBS 3x doku yıkayın.
- batar kadar 4 ° C 'de 0.1 M fosfat tamponu içinde% 7.5 sükroz, bir solüsyon içerisinde bulunan dokunun yerleştirin.
- batar kadar, yine 4 ° C 'de 0.1 M fosfat tamponu içinde% 15 sakroz çözüm değiştirin.
- 37 ° C doku, sıcak% 15 sakaroz ve 0.1 M fosfat tampon maddesi içinde bir jelatin çözeltisi ile hacminin yarısı yerine ve bir gece boyunca dengelenmeye. jelatin konsantrasyonu% 1,% 2.5,% 5 ile adım adım artan ve son olarak% 7.5 iki kat.
- Taze% 7.5 jelatin kullanan cryomolds örnekleri yerleştirin. decellularized numunelerin şeklini geri, sıvı jelatin t olarak odalarına perfüze edilebilirO kalpler kalıplanmıştır. sıvı azot üzerinde cryomolds yüzen ile dondurun. -80 ° C'de saklayın.
- Kriyostat ile kesilir (10 mikron kalınlığında) kesitler. bölüm yüzeyine yakın slayt getirin ve bölüm nedeniyle elektrostatik tedavi slaytlar üzerinde yüke yüzeye bıçak kapalı hareket gözlemlemek. bir gecede slaytlar kurulayın ve gelecek analizi için -80 ° C'de saklayın.
- dondurucu Slayt çıkarmak Oda sıcaklığına ve daha sonra jelatin çözmek için 37 ° C 'de 20 dakika süre ile PBS içeren bir Coplin kavanoza yerleştirin.
- Hematoksilen ve Eosin ile Adım 4.7 kesilen bölümleri Leke. Bir Coplin kavanoza yerleştirin kayar. 1.5 dakika boyunca maddesi mavileştirici 1 dakika boyunca musluk suyu, 3 dakika boyunca tampon, 1.5 dakika boyunca musluk suyu, 45 sn için hematoksilen Adım 4.8'de sulu slaytlar Açığa,% 80 etanol, 1 dakika boyunca, Alkol Eosin Y 8 saniye, 1 dk 3x 1 dakikada, 1 dakika 2x% 100 etanol maddesi temizleme (ksilen yerine)% 80 etanol, reçine ile lamelgöre montaj ortamı. mikroskopik slaytlar inceleyin.
- nemli bir oda içinde hidratlanmış slaytlar koyarak bu kolajen IV, ECM yapısal proteinler kalp ECM, leke ECM proteininde reaktivite tutma teyit ve% 0.1 Triton ile fosfat tamponlu tuzlu su içinde% 10 normal eşek serumu (NDS) ile tedavi edilmesi için -X100 oda sıcaklığında 1 saat (RT) (PBST). Doku bölümleri kapsayacak şekilde yeterli hacme kullanın.
- % 5 NDS / PBST bir ampirik olarak tespit seyreltme de tercih birincil antikor ile çözüm değiştirin. Örneğin, kolajen IV antikoru 1 ile seyreltildi: 150. 4 ° C'de bir gece boyunca inkübe edilir.
- PBST 3x ile slaytlar yıkayın ve bir floresan boya ile konjuge seçim ikincil antikor uygulayın. bir ampirik olarak tespit miktarda antikor sulandırmak. Oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe edin. PBS 3x yıkayın.
- DAPI DAPI içeren mounti kullanılarak hücre çekirdeğinin olmaması doğrulamak için gibi bir DNA bağlayıcı boya ile slaytlar LekeKapak slaytlar kayma sırasında orta ng.
- 400X'lik 50 bir floresan mikroskop ile slaytlar inceleyin.
Recellularization 5. P1 Neonatal Fare Ventriküler Kardiyomiyositler
- % 70 etanol ile her yavru Sprey ve tek kullanımlık bıçak ile başını kesmek.
- toraks göğüs boşluğu maruz küçük steril makas ile orta hatta bölünmüş ise başparmak ve işaret parmağı arasındaki her yavru tutun. o büyük damarların ve sadece ventriküler doku bırakarak kulakçıklar serbest kesilir iken kalp göğüs serbestçe çıkıntı izin basınç uygulayın.
- 20 ml buz gibi soğuk Kalsiyum, bütün kalpler toplanana kadar, 20 mM 4- (2-hidroksietil) -1-piperazinetansülfonik asit (CBFHH) sahip bikarbonat bilgilerini Hank tamponlu tuzlu su çözeltisi içeren 50 ml'lik bir tüp içine doğrudan her kalp yerleştirin.
- CBFHH aspire ve boru taze CBFHH (buz soğukluğunda) 10-15 ml ekleyin. t doku dönen dokuyu yıkayıno tüp birkaç kez.
- 60 mm plastik Petri kabı içine kalpleri içeren solüsyon süzün.
- uzakta yaylı makas ile kalpleri onu kırparak buz üzerinde büyütme altında kalpleri herhangi gizli atriyal doku teşrih. homojen büyüklükte küçük parçalar halinde ventriküller kadar kıyma. 5. forseps ile çanak herhangi ayrılmış olmayan ventriküler doku çıkarın.
- steril mikro karıştırma çubuğu içeren küçük steril şişenin içine doku parçaları aktarmak için gerekli olduğu gibi CBFHH çözümünün kadar Pipet.
- Doku flakon dibine tortu ve CBFHH çözüm kaldırmak için izin verin.
- CBFHH bir enzim çözeltisi 1.75 mg / ml tripsin, 20 ug / ml DNaz II 50 ml hazırlayın. Pipet 5 Bu enzim solüsyonu ve bir manyetik karıştırıcı ile kıyılmış ventriküler doku ve yer ihtiva eden bir tübe ekleyin. 8 dakika boyunca, oda sıcaklığında sabit bir oranda (340 rpm) karıştırılır.
NOT: karıştırma eylem nazik olun ve henüz izin vermelidirbulamaç durdurulması için. - karıştırma plakasından şişe çıkarın ve bulamaç 3 dakika tortu izin verir. öncelikle kan hücreleri ve doku artıkları içerdiğinden pipetleyin, ilk sindirmek süpernatant atın ve.
- Pipetleyin ikinci 5 ml enzim çözeltisi kısım ve sindirerek ventrikül ekleyin. 8 dakika boyunca karıştırın ve bir diğer 3 dakika için tortu sağlar. Önceki digests başlamadan, iki adet 50 ml tüpler (1 ve 2 ile) hazırlanması Her biri 12 ml buz gibi soğuk fetal sığır serumu (FBS). Her bir tüp üzerinde bir 40 mikron hücre süzgeç yerleştirin. Pipet tüp 1 filtre aracılığıyla bu yüzer.
- FBS içeren iki tüp arasında sindirmek süpernatant yerleştirilmesini alternatif, sindirim sürecini bir ek 8 kez tekrarlayın. Her bir tüp içinde eşit hacimlerde sağlamak için tüpler 1 ve 2 arasında eşit Son süpernatant bölün.
NOT: Her toplama tüpü şimdi hücre süspansiyonu 32.5 ml toplam hacmi içerecektir. - tüpler içerirler santrifüj4 ° C'de 6 dakika boyunca 150 x g'de süpernatan ing.
- Sindirim alikotları toplarken, plaka başına (% 10 FBS, 1 x Pen-Strep, 1 x L-glutamin ile Dulbecco Modifiye Kartal Ortamı (DMEM)) ortam 6 ml beş 100 mm doku kültürü plakaları hazırlamak. Ortamı dengelenmeye 30 dakika için 37 ° C,% 5 CO2 seviyesinde bu alikotları inkübe edin.
- Her iki toplama tüpleri hücreleri birleştiren CBFHH enzim karışımı aspire ve yukarıda hazırlanan kültür ortamı 30 ml tekrar süspansiyon hücreleri.
- 100 mm levhaların her hücre süspansiyonu 6 ml dönün ve 37 ° C'de 45 dakika inkübe edilir.
- (Fibroblast fraksiyon yemekler bağlı başlamış ve eğer istenirse ayrı ayrı yetiştirilebilir) inkübasyonun sonunda, 5 yeni yemeklere yıkanarak yapışmayan hücreler transferi ve 45 dakika boyunca tekrar inkübe edin.
- Ön kaplama ikinci tur sonunda, yemekler medya ve yapışmaz hücreleri toplamak ve 150 ° C'de medya dönmeye6 dakika xg.
- (Perfüzat 100 ul Yapı başına 4.0 x 10 5 hücre), yaklaşık istenen konsantrasyona hücreleri getirmek için fazla ortamı dışarı çekilmesi. Sayımı ve veya canlılık testi 14 için bir numuneyi çıkarın.
P3 Kalp Matrix 6. Biyoreaktör Recellularization
- bir gecede hücrelerin eklemeden önce kültür ortamı (Adım 5.15 bakınız) ile izole kalp matrisi ön işleme tabi.
- Şekil l'de gösterildiği gibi, bir Langendorff sistemi elemanları bir araya getirin. 2. Cam parçaları Otoklav ve etilen oksit sterilite sağlamak için plastik parçaları sterilize edin. sistemin çeşitli alt birimleri destek standına monte edilmeden önce, bir laminar akış başlığı içinde monte edilebilir. Dolaşan su banyosu ve ısıtılmış su akış yolu açıklık amacıyla çıkarılmıştır.
- doku kültür ortamı 120 ml monte sistemi doldurun (Adım 5.15 bakınız).
- 60 mm cul Kademe 2.14 den kateterize kalp matrisi yerleştirinbüyütme altında ture bulaşık kateter Adım 5.20 hücre süspansiyonu ile yüklü x 1 iğne 22 g ile 1 ml şırınga bağlanıp. Bu montaj kalbi embolizan önlemek için hava kabarcıkları serbest olduğundan emin olun.
- Yavaşça koroner arterler ile kalp matriks içine hücre süspansiyonu 100 ul serpmek. Tamamlandığında, şırınga / iğne kombinasyonu ayırın.
NOT: Yaklaşık bir yavaş perfüzyon. min başına 20 ul kalbi transit, damarların dışarı akan hücreleri önlemek için gereklidir. - biyoreaktör kalp kavanoz kapağının alt kısmında Luer bağlantısına sabitlenmiş bir 22g künt saplama, saplama üzerine kateter itin.
- Peristaltik pompayı Şekil 2'de belirtildiği gibi işlemin akışı gözlemleyin. Hazneden işlemin akışı Aşama 2.5 aort yerleştirilen kateter (Şek. 2 kırmızı yolu) kabarcık kapanı vasıtasıyla pompa yoluyla. damar dışına kalp dolaşım akışını gözlemlemekMedya rezervuar apeks, çevrimli gelen s ve damla.
Not: perfüzyon akış hızı, yapısı damar direnci ve kalp boyutu ancak 100 ul 50 oranında bireysel etkenlere bağlıdır / dakika için iyi bir başlangıç noktasıdır. ara zaman noktalarında, fonksiyonel değerlendirmeler yürütülebilir. Neonatal recellularized kalp boyutu ölçeği bu gerçekleştirilebilir ama optik tabanlı sistemler yetişkin fare kalplerinde kullanılmıştır gibi davranış yenerek ölçmek için kullanılabileceğini belirledik, değerlendirme sınırlar. 4 yapı uzatılmış için perfüze edilebilir (23 saat kadar) süreler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
decellularization
Ortalama olarak, bu protokolü kullanarak bir P3 kalp Decellularization zamanı yaklaşık 14 saattir. P3 yenidoğan için 23 mg, ortalama kalp ağırlığı verilmiş.
Acellularity
Şekil 3a tamamen bozulmamış P3 yenidoğan kalp (bütün montaj). Şekil 3b. Decellularization aşağıdaki aynı kalp gösterir 4a Şekiller ve sırasıyla bozulmamış ve decellularized kalplerin hematoksilen ve eozin boyama göstermek 4b göstermektedir. Hematoksilen pozitif çekirdeklerin yokluğunu ve decellularized kalbinde eozinofilik yapıların azalmasını unutmayın. Buna ek olarak, hücresizleştirilmiş kalbin DNA içeriği önemli ölçüde sağlam kalp (n = 6) hücresizleştirilmiş merkezinde 4.73 ± 2.27 ug için 68.08 ± 2.25 ug azalır (n = 5).
Kollajen immünoreak
Decellularization Aşağıdaki hücre dışı matrisin (ECM) bakım ekzojen hücreler ve matriks işlevselliğine popülasyonu için gereklidir. Sağlam ve hücresizleştirilmiş ECM neonatal ECM içeriğini değerlendirmek için, kollajen IV immüno-boyama yapıldı. Şekil 4c ve kolajen IV sağlam hem de sağlam ve hücresizleştirilmiş kalp ifade edilir ve bu protein lokalizasyonu muhafaza olduğunu göstermek d DAPI pozitif çekirdekler etkili bir (Şekil 4e-h) kaldırılır ise, hücre çıkarılmasını takiben.
DNA muhtevası
DNA varlığı selülarite ek gösterge olarak kullanılır. Şekil 5'de, bir DNA Su bazlı Decellularization aşağıdaki yenidoğan kalpleri% 93 oranında azaltılması için gösterilmektedir. DNA, indirgeme Bu derece ile tutarlıdırdiğer dokularda 15-16 deterjan bazlı decellularization kullanarak literatürde rapor.
Recellularization
Bu recellularized kalbinde farklı kardiyomiyosit belirteçleri ekspresyonunu belirlemek için immünohistokimyasal gerçekleştirdik. 6, sol ventrikül duvarı (Şekil 6A ve 6B). Şekil 6C recellularized kalp DAPI etiketleme gösterir içine göç etmiş hücreler, Şekit. Şekil 6D-G, sırasıyla NKX 2.5, mCherry, α-aktinin ve DAPI için pozitif olan hücreler göstermektedir. Nkx2.5 α-aktinin farklılaşmış kardiyomiyositlerde işaretler bir sarkomerik proteini ise, kardiyak projenitör hücreleri etiketlemek için bilinmektedir. Bu hücreler, kardiyomiyosit belirteçleri EV ifade etmeye devam gösteren (Şekil 6H pembe) bu belirteçlerin ifade eden hücrelerin bir çoğunluğu gözlemlediktr perfüzyon 23 gün sonra.
Decellularization donanım. A Şekil 1. şematik. Deterjan çözüm. B 60 cc şırınga varil deposu. Sulama şırınga gibi ayrıntılı. C Kateter montaj. Çizilmiş PE boru kateter ucunun Detay. D. Drenaj ile decellularization odası ve septum. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2. Kalp biyoreaktör şematik gösterimi. 1. carbogen gaz nemlendirme (Yeşil çizgiler gaz akışını temsil). Medya perfüzyon için 2. Peristaltik pompa tahrik veoksijenasyon (Mor çizgiler oksijenatörde yoluyla medya akışını temsil). 3. İnce duvar oxygenator. 4. Sac oksijenatör ve medya rezervuar. 5. Önyük odası ve kabarcık tuzak. 6. Kalp odası (Kırmızı çizgiler kalbe ve medya akışını temsil). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3. P3 yenidoğan fare kalp Tüm montaj (A) öncesi ve Decellularization (B). Bu kalp perfüzyon (B) Aşağıdaki kalp saydam hale gelmesi Yöntem 2. Not açıklandığı gibi Langendorff perfüzyon yöntemi kullanılarak decellularized ve biraz büyütülür sonra . Ölçek = 2mm. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Yerli ve hücresizleştirilmiş P3 neonatal fare kalp Şekil 4. histolojisi., Soğuk bir bölümde (10 um) H & E (A, B), kolajen IV (C, D, G, H) ve DAPI (E, F, G, H ile boyandı ). nativ (A) ile karşılaştırıldığında birleştirilmiş resim G temsil edilir ve H., H & E boyama hücresizleştirilmiş doku (B) 'de, hücre çekirdekleri ve sitoplazma yokluğunu gösterir. Kollajen IV içeriği şu decellularization (D), DAPI boyama (çekirdekleri bir belirteci) kalırken kaldırılmıştır. Birleştirilen görüntüler saf kalp (G) ve hücresizleştirilmiş kalp (H), bu ko yokluğunda Kollajen IV ve DAPI ko göstermektedir. Bu veri hücreleri göstermektedir Resim uzun kalbin kollajen matrisi doldurmak. Ölçek = 500 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
DNA içeriğinin Şekil 5. değerlendirilmesi. Kontrol (n = 6) ve hücresizleştirilmiş (n = 5) piko yeşil bir yöntemle DNA içeriği açısından tahlil kalpler. Kantitasyonu ± standart sapma kalbin başına DNA mikrogram olarak ifade edilir. Asterisk, kontrol ile karşılaştırıldığında p <0.01 gösterir. Bu veriler decellularization P3 yenidoğan kalp anlamlı DNA içeriği azalttığını gösteriyor. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
OAD / 54459 / 54459fig6.jpg "/>
Şekil 6. Histoloji P3 kalp matrisi H & E (A, ölçek = 250 mikron, B, ölçek = 50 um), DAPI (C, ölçek = 250 mikron), NKX 2.5 P1 MCherry ifade kardiyomiyositlerinin. Lekeli ile Recellularization aşağıdaki 23 gün, mCherry, α-aktinin, DAPI ve birleştirilmiş (D, E, F, G, H, ölçek = 50 um). De P1 kardiyomiyositlerde (AC) kollajen matris etkin iskânından yola göstermiştir. Ayrıca, m-kiraz pozitif kardiyomiyositlerde Nkx2.5 ve kollajen matriks içine giriş aşağıdaki α-aktinin 23 gün ifade görülmektedir. Bu veriler bu hücrelerin uzun süre için kendi kardiyomiyosit kimliklerini koruduklarını göstermektedir. Bu f büyük halini görmek için tıklayınızŞEKIL.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kalbin tekrarlanan perfüzyonları bu tekniğin bağımlılığı bir emboli kaçınma başarılı bir sonuç önemli bir bileşeni yapar. Adımlar 2,8-2,14 arasında çözümün değişikliklere Adımlar 2,2-2,6 kalbin ilk kateterizasyon itibaren, hangi taviz miyokard içine perfüzat akışını hava kabarcıklarının giriş izin verebilir manipülasyonlar vardır. Nedeniyle yenidoğan kalp küçücük boyutuna, damarsal bile dakikalık kabarcıklar böylece eksik decellularization render, bir teknik infarkt neden olabilir. Buna ek olarak, daha sonraki yıkama adımlarında eksik perfüzyon olumsuz etkiler biyolojik uyumluluk, deterjan artığı ile sonuçlanabilir. değişikliği ile çözümün dışına gaz hamle çözünmüş bu da hava kabarcığı oluşumu kaynağı olabilir Dahası, Adım 2.14 önerildiği gibi 4 ° C depolama matris çıkarılırken olarak sıcaklık hızlı değişimler, dikkatle ele alınmalıdır sıcaklık. Winfüzyon sağlamak için, hücre süspansiyonu ile şırınga hazırlarken, ek bakım, uygulanması gereken recellularization için tavuk işlem ücretsiz bubble (6.4 Adım) 'dir.
Diğer dokular türlerini karşılamak için bu protokolün özelliklerini işlemek için gerekli olabilir. Decellularization protokolleri bir dizi rehberlik sağlayabilir 4,9,11 bildirdi vardır. artık DNA örneklediği gibi herhangi bir decellularization protokolünün nihai amacı (ler) yerli hücresel bileşenlerin ECM protein yapısının bakım ve ilgili biyokimya ve yeterli kaldırma içermelidir. Bu ortamda, aşırı perfüzyon basıncı uygulaması histolojik görüntülendi olabilir ECM ultrastrüktürün, bozulmasına yol açar.
P3 fare kalp büyüklüğü yetişkin doku ile karşılaştırıldığında hücre idaresi üzerinde bazı kısıtlamalar koyar. Yetişkin kalpler transmural injectio yapan kalın yeterince ventriküler duvar mevcut ikenna olası hücre teslim yöntemi, P3 kalp hücre süspansiyonu parçalanmayabilir edecek boyutta olan bir iğne, kalp önemli zarar gelmez yeterince küçüktür. Perfüzyon uygun bir dağıtım stratejisi, ancak etkili bir şekilde teslim edilmesi için belirli bir boyut ve şekle sahip hücreler bağlıdır. Yenidoğan fare miyositler bu konuda iyi çalışır. Diğer küçük dairesel hücreler de bu amaca hizmet için 11 gösterilmiştir. Bu kalplerin boyutu ölçeği, basınç hacim kateter gibi geleneksel fizyolojik fonksiyonel analiz kullanımını engellemektedir. video yakalama dayalı diğer yaklaşımlar dikkate alınması gerekebilir.
Bu veriler Decellularization ve neonatal fare kalp recellularization fizibilitesini destekler. Daha önceki çalışmalar, decellularization / Recellularization çalışma amacıyla yetişkin kalpte kullanımını göstermiştir. Bu yetişkin kalpleri üretilen matrisler yenidoğan kardiyomiyositlerinin 4 ve insan ile yeniden doldurulur edilmiştirUyarılmış pluripotent kök hücreler (hiPSCs) 17. hiPSCs durumunda, depolanmışsa kalpler Nanog, Sox2 ve Oct4 ve oluşan kas benzeri yapılar olarak Pluripotency belirteçlerinin bir düşüş göstermiştir; olgunlaşma tüm düşündüren. ECM hücre dışı öğeleri, ancak, rejeneratif kapasitesinin içerdiği bilinen dokulardan matrisler üretmek için çalışır için istenir hücre, doku ve organların gelişiminde önemli bir rol oynadığı gösterilmiştir. Çalışmalarda, biz recellularized kalpleri bile hala uzun süreli kültürden sonra, kardiyomiyosit belirteçleri ifade ettiğini göstermektedir. Bu veriler, yeni matrisler kullanılarak, kardiyomiyositler kardiyomiyositlerde olarak kimliklerini kaybetmeden uzun bir süre boyunca muhafaza edilebilir olduğunu göstermektedir. Bizim verilerimiz yenidoğan fare kalbi decellularizing için teknik ve fizibilite desteği. Yenidoğan matrisler repopulation çalışmaları için yeni yapıları temin edilmesi için hem de destek bilgisi jellerin üretimi için bir potansiyele sahiperior rejeneratif kapasitesi. Bu yeni doğan ECMleri kullanarak, şimdi hiPSCs dahil olmak üzere hücre tiplerinin, çeşitli fonksiyonel dokular oluşturacak şekilde bu iskeleler üstünlüğünü hitap edilmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Materials for mouse heart isolation | |||
| P1 mouse pups (as shown; B6;D2-Tg(Myh6*-mCherry)2Mik/J) | Jackson Laboratories | 21577 | or equivalent |
| 60 mm Culture dish | BD Falcon | 353004 | or equivalent |
| Phosphate buffered saline pH 7.4 (sterile) | Hyclone | SH30256.01 | or equivalent |
| Single Use Blade | Stanley | 28-510 | or equivalent |
| Standard Scissors | Moria Bonn (Fine Science Tools) | 14381-43 | or equivalent |
| Spring Scissors 10 cm | Fine Science Tools | 15024-10 | or equivalent |
| Vannas Spring Scissors - 3 mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15000-00 | or equivalent |
| #5 Forceps | Dumnot (Fine Science Tools) | 11295-00 | or equivalent |
| 2. Materials for decellularization | |||
| Inlet adaptor | Chemglass | CG-1013 | autoclavable |
| Septum | Chemglass | CG-3022-99 | autoclavable |
| 1/8 in. ID x 3/8 OD C-Flex tubing | Cole-Parmer | EW-06422-10 | autoclavable |
| Male luer to 1/8" hose barb adaptor | McMaster-Carr | 51525K33 | autoclavable |
| Female luer to 1/8" hose barb adaptor | McMaster-Carr | 51525K26 | autoclavable |
| Prolene 7-0 surgical suture | Ethicon | 8648G | or equivalent |
| Ring stand | Fisher Scientific | S47807 | or equivalent |
| Clamp | Fisher Scientific | 05-769-6Q | or equivalent |
| Clamp regular holder | Fisher Scientific | 05-754Q | or equivalent |
| 60 cc syringe barrel | Coviden | 1186000777T | or equivalent |
| Beaker | Kimble | 14000250 | or equivalent |
| 22 G x 1 Syringe Needle | BD | 305155 | or equivalent |
| 12 cc syringe | Coviden | 8881512878 | or equivalent |
| 3-way stop cock | Smith Medical | MX5311L | or equivalent |
| PE50 tubing | BD Clay Adams Intramedic | 427411 | Must be formable by heat. Polyethylene recommended. |
| 1% SDS | Invitrogen | 15525-017 | Ultrapure grade recommended. Make up fresh solution and filter sterilize before use. |
| 1% Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Make up fresh solution from a 10% stock and filter sterilize before use. |
| Sterile dH2O | Hyclone | SH30538.02 | Or MilliQ system purified water. |
| 1x Pen/Strep | Corning CellGro | 30-001-Cl | or equivalent |
| 3. Materials for DNA quantitation | |||
| Proteinase K | Fisher | BP1700 | >30 U/mg activity |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | or equivalent |
| MgCl2·6H2O | Mallinckrodt | 5958-04 | or equivalent |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | or equivalent |
| Tris base/hydrochloride | Sigma-Aldrich | T1503/T5941 | or equivalent |
| Pico-Green dsDNA assay kit | Life Technologies | P7589 | requires fluorimeter to read |
| 4. Method for fixation and sectioning of tissue | |||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | or equivalent |
| Gelatin Type A from porcine skin | Sigma-Aldrich | G2500 | must be 300 bloom or greater |
| 5. Method for tissue histology | |||
| Cryomolds 10 x 10 x 5 mm | Tissue-Tek | 4565 | or equivalent |
| Cryostat | Hacker/Bright | Model OTF | or equivalent |
| Microscope Slides 25 x 75 x 1 mm | Fisher Scientific | 12-550-19 | or equivalent |
| Hematoxylin 560 | Surgipath/Leica Selectech | 3801570 | or equivalent |
| Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | or equivalent |
| Define | Surgipath/Leica Selectech | 3803590 | or equivalent |
| Blue buffer | Surgipath/Leica Selectech | 3802915 | or equivalent |
| Alcoholic Eosin Y 515 | Surgipath/Leica Selectech | 3801615 | or equivalent |
| Formula 83 Xylene substitute | CBG Biotech | CH0104B | or equivalent |
| Permount Mounting Medium | Fisher Chemical | SP15-500 | or equivalent |
| Collagen IV Antibody | Rockland | 600-401-106.1 | or equivalent |
| α-Actinin Antibody | Abcam | AB9465 | or equivalent |
| mCherry Antibody | Abcam | AB205402 | or equivalent |
| NKX2.5 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-8697 | or equivalent |
| Donkey anti-mouse AF488 Antibody | Life Technology | A21202 | or equivalent |
| Donkey anti-chicken AF594 Antibody | Jackson Immunoresearch | 703-585-155 | or equivalent |
| Donkey anti-goat CY5 Antibody | Jackson Immunoresearch | 705-175-147 | or equivalent |
| Fab Fragment Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) AF594 | Jackson Immunoresearch | 111-587-003 | or equivalent |
| Prolong Gold Antifade Mountant with DAPI | ThermoFisher | P36930 | or equivalent |
| 6. Isolation of neonatal ventricular cardiomyocytes using pre-plating | |||
| HBSS (Ca, Mg Free) | Hyclone | SH30031.02 | or equivalent |
| HEPES (1 M) | Corning CellGro | 25-060-Cl | or equivalent |
| Cell Strainer | BD Falcon | 352340 | or equivalent |
| 50 ml tube | BD Falcon | 352070 | or equivalent |
| Primeria 100 mm plates | Corning | 353803 | Primeria surface enhances fibroblast attachment promoting a higher myocyte purity |
| Trypsin | Difco | 215240 | or equivalent |
| DNase II | Sigma-Aldrich | D8764 | or equivalent |
| DMEM (Delbecco's Minimal Essential Media) | Hyclone | SH30022.01 | or equivalent |
| Vitamin B12 | Sigma-Aldrich | V6629 | or equivalent |
| Fibronectin coated plates | BD Bioscience | 354501 | or equivalent |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30910.03 | or equivalent |
| Heart bioreactor glassware | Radnoti Glass Technology | 120101BEZ | Must be sterilizable by autoclaving or gas. |
References
- Yusen, R. D., et al. Registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: Thirty-second official adult lung and heart-lung transplantation report--2015. J Heart Lung Transplant. 34 (10), 1264-1277 (2015).
- Go, A. S., et al. Heart disease and stroke statistics--2014 update: A report from the american heart association. Circulation. 129 (3), e28-e292 (2014).
- Kapelios, C. J., Nanas, J. N., Malliaras, K. Allogeneic cardiosphere-derived cells for myocardial regeneration: current progress and recent results. Future Cardiol. 12 (1), 87-100 (2016).
- Ott, H. C., et al. Perfusion decellularized matrix: Using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat Med. 14 (2), 213-221 (2008).
- Porrello, E. R., Olson, E. O. A neonatal blueprint for cardiac regeneration. Stem Cell Research. 13 (3 Pt B), 556-570 (2014).
- Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).
- Polizzotti, B. D., et al. Neuregulin stimulation of cardiomyocyte regeneration in mice and human myocardium reveals a therapeutic window. Sci Transl Med. 7 (281), 281ra45 (2015).
- Jesty, S. A., et al. c-kit+ precursors support postinfarction myogenesis in the neonatal, but not adult, heart. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (33), 13380-13385 (2012).
- Ambrosy, A. P., et al. The Global Health and Economic Burden of Hospitalizations for Heart Failure: Lessons Learned From Hospitalized Heart Failure Registries. J Am Coll Cardiol. 63 (12), 1123-1133 (2014).
- Roger, V. L., et al. Executive Summary: Heart Disease and Stroke Statistics-2012 Update A Report From the American Heart Association. Circulation. 125 (22), 188-197 (2012).
- Kennedy-Lydon, T., Rosenthal, N. Cardiac regeneration: epicardial mediated repair. Proc R Soc B. 282 (1821), 2147-2172 (2015).
- Williams, C., Sullivan, K., Black, L. D. Partially Digested Adult Cardiac Extracellular Matrix Promotes Cardiomyocyte Proliferation In Vitro. Adv Healthcare Mat. 4 (10), 1545-1554 (2015).
- Borg, T. K., et al. Recognition of extracellular matrix components by neonatal and adult cardiac myocytes. Dev Biol. 104 (1), 86-96 (1984).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immnol. 111, A3-B1-3 (2015).
- Gilbert, T. W., Freund, J. M., Badylak, S. F. Quantification of DNA in biologic scaffold materials. J Surg Res. 152 (1), 135-139 (2009).
- Akhyari, P., et al. The quest for an optimized protocol for whole-heart decellularization: a comparison of three popular and a novel decellularization technique and their diverse effects on crucial extracellular matrix qualities. Tissue Eng Part C Methods. 17 (9), 915-926 (2011).
- Lu, T. Y., et al. Repopulation of decellularized mouse heart with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular progenitor cells. Nat Commun. 4 (2307), 1-11 (2013).
