Summary
이 연구에서 우리는 재생 연구에 사용되는 소설, 신생아, 쥐의 심장 발판을위한 방법론을 제공합니다.
Introduction
심부전은 일반적이고 치명적입니다. 그것은 기관에의 혈류를 저해하고, 신체의 대사 충족 수요를 남긴다 심장의 수축력 저하를 초래 진행성 질환이다. 570 만 미국인들이 심장 마비를 가지고있는 것으로 추정하고 미국 9 입원의 주요 원인이다. 미국에서 심장 마비 환자를 치료 집단 비용은 연간 9-10 당 $ (300) 억 달러를 초과합니다. 말기 심부전 유일한 최종 치료 동소 심장 이식이다. 매년, 10 만 명 이상의 기증자 마음이 미국 1-2에서 심장 이식 절차에 필요한 것으로 추정된다. 때문에 기증자의 제한된 번호 만 약 2,400 이식은 미국이 매년 수행됩니다. 분명히, 이러한 장기 결품 다른 전략 transplanta 추가 기관을 생산하는 데 필요한으로 해결되어야거부 평생 면역 억제와 관련된 부작용을 회피하기 위하여 기 및 이상적으로 이러한 장기자가있을 것이다.
포유류 성인 심근 부상에 따라 제한된 재생 능력을 보여하지만 최근의 증거는 포유류의 신생아 마음이 상해 5-8 다음과 같은 놀라운 재생 능력을 유지하는 것이 좋습니다. 특히, 부분적인 수술 적 절제 다음, 회생 창이 출생과 출생 후의 일 사이에 발견되었다 (7)이 회생 기간은 섬유 성 흉터의 부족, 신생 혈관의 형성, 심장 외막에서 혈관 신생 인자의 방출 및 심근 확산 5-8 특징 11. 시간이 회생 창이 bioartificial 심장의 개발을위한 신규 물질의 공급원으로 신생아 심장을 사용하는 가능성을 제공한다.
세포 외 기질은 cardiomyocyt를 촉진하는 중요한 단서를 제공하는 것으로 알려져E 증식 및 성장. 신생아 및 성인 행렬 (12) 및 재생을 촉진 할 수있는 능력 분자의 가용성에 뚜렷한 차이가 13을 탐구하고있다. Decellularized 성인 매트릭스 셀룰러 다시 채우기위한 ECM 지지체 및 bioartificial 심장의 생성을 제공하는 여러 연구에 사용되었다. 줄기 세포 기술이 연구 및 새로운 발견이 빠르게 발전하고 있지만, 몇 가지 장애물이 충족되어야 아직. 예를 들어, 매트릭스 벽으로 행렬의 기본 구조 셀룰러 통합 보존 한계 및 능력이 접근법의 성공 증식 및 성장은 모든 제한을 지원한다. 회생 특성이 우수 신생아 심장 기인되었지만, 이러한 조직을 사용하는 실용적인 측면은 탐색을 제한하고있다.
신생아 심장의 증명 재생 능력을 바탕으로, 우리는 개발을 통해 새로운 매트릭스를 개발했다P3 마우스 심장 탈세 포화의 기술. 이전에 6 결정하지만 마음 수확, decellularize 및 recellularize에 충분한 크기로는 심장 재생의 창 내에서 그대로 P3의 마음은이 연구를 위해 선택되었다. 이 연구의 목적은 쥐 신생아 심장에서 매트릭스를 생성하는 가능성을 입증한다. 우리의 연구는 ECM의 단백질 구조적 무결성을 유지하면서 분 신생아 심장 decellularizing의 가능성에 대한 증거를 제공한다. 우리는 또한 mCherry 표현 심근이 심장 ECM을 recellularize 할 수있는 능력을 보여 우리는 recellularization 다음과 같은 다양한 심장 마커의 발현이 심근을 조사했다. 이 기술은 bioartificial 심장의 개발 신생아 행렬의 우월성 시험을 허용한다.
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Protocol
모든 마우스 실험은 미국 동물 복지 법에 따라 수행하고 미네소타 대학에서 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.
마우스 심장 격리 1. 방법
- 단일 사용 블레이드 잘린에 의해 신생아 마우스를 안락사.
- 70 % 에탄올로 흉부를 면봉.
- # 5 포셉 한 쌍의 측 방향으로 피부를 당기면서 표준 가위로 가슴 벽에서 멀리 절단하여 가슴에서 피부를 해부하다.
- 복벽을 통해 절단에 의해 가위로 흉골 단지 열등한 복부를 관통. 가위로 가슴의 양쪽에 리브 불구하고 절단하는 동안 # 5 집게와 칼 모양의 프로세스를 파악, 몸에서 rostrally 흉골을 철회. 흉곽은 심장을 표시 할 수있는 집게와 우량 반영됩니다.
- 퉁명스럽게 노출, # 5 집게 측 방향으로 당겨 흉선의 두 가지 주요 로브를 해부대동맥 아치뿐만 아니라 대정맥과 폐정맥.
- 10 센티미터 봄 가위로 대동맥 궁에서 주요 동맥 및 대동맥 자체를 가로로 쪼개다. 마음의베이스와 팔 머리 동맥과 대동맥을 유지합니다. 기도와 식도에서 분리, 앞으로 마음을 반영하기 위해 #와 함께 5 집게를 절단 혈관의 끝을 잡고.
- 10 센티미터 봄 가위로 심장의 양쪽 폐와 심장 사이에서 절단하여, 폐 혈관 및 기타 주요 정맥을 가로로 쪼개다. 혈관은 배수를 제공 할 열려.
- 주요 혈관의 잘린 끝을 잡고는 # 5 집게와 종격동에서 마음을 제거합니다. 카테터 멸균 인산 완충 식염수 (PBS)를 포함하는 60mm 배양 접시에 마음을 놓습니다.
랑겐 돌프 관류에 의해 탈세 포화 2. 방법
- 사전에 카테터 어셈블리를 준비합니다. 4 센티미터 부분을 그립니다PE의 작은 알코올 불꽃 50 튜브는 작은, 얇은 카테터를 만들 수 있습니다. 측정 기준을 만족하는 날개 끝 손질 (약. 약. 500 μm의 지름의 플랜지 300 μm의 외경 OD)도 1에 도시 된이.이 손잡이의 각각의 측면에서 두 개의 대칭적인 카테터를 제공한다.
- 얇은 끝 부분에있는 구멍에 플랜지를 용융, 간단히 불꽃에 튜브의 절단 끝을 가리 킵니다.
- PBS로 12 mL를 주사기를 채우고 주사기에 3 방향 스톱 콕을 배치하여 카테터를 조립한다. 꼭지에 22 G × 1 바늘을 추가하고 격막을 통해 바늘을 구동한다. 바늘 (그림. 1)에 그려진 PE 튜브 카테터를 밀어 넣습니다.
- 모든 기포가 제거 된 것을 보장 PBS로 조립 부품 관개.
- 대동맥 밸브를지나 연장하지, 분리 된 심장의 대동맥으로, 위의 설명과 7-0 봉합사의 한 넥타이와 결찰로 제조 된 카테터를 삽입합니다. t의 플랜지를 휴식그는 꽉 밀봉을하고 카테터를 오는 마음을 방지 넥타이에 근위 카테터.
- 부드럽게 PBS가 들어있는 주사기를 사용하여 마음을 관류하면서, 배율 아래 카테터를 관찰한다. 거기에 누수가 시스템에없고 잠재 혈액이 제거 될 때 조직이 균일 blanches 있는지 확인합니다.
- 입구 어댑터의 목에 격벽을두고 유리 위에 측면 폴딩하여 밀봉.
- 도 20에 나타낸 바와 같이 mmHg의 압력을 발생하는 열을 생성하기 위해 충분한 길이의 선을 통하여 증류수 1 % 소듐 도데 실 설페이트 (SDS) 60 ㎖ (DH 2 O)로 충전 된 저장조에 부착. 1. 1 mmHg에서의 관계에 기초하여 상기 액체 컬럼의 높이의 압력을 계산하면 1.3595 cm의 H 2 O. 같다
주의 : SDS는 자극 특성을 가진 고도의 응집 분말이다. 접촉은 피해야한다. 적절한 보호 복을 사용하여 분말을 처리합니다. - 14 시간 동안 1 % SDS와 마음을 관류. 마음은 전혀 관찰 나머지 조직과 외관 반투명됩니다.
- 나머지 SDS 용액의 콕하도록 시스템을 씻어 내고 10 ㎖의 DH 2 O로 대체 1X 페니실린 스트렙토 마이신 (펜 연쇄상 구균)를 포함하는 60 ml의 PBS 다음 10 ml의 DH 2 O 다음 (증류수에 희석) 10 ml의 1 % 트리톤 X-100과 마음을, 관류.
- 4 ° C에서 1 배 펜 연쇄상 구균와 PBS의 마음을 저장합니다. 의도 된 게시물 탈세 포화 응용 프로그램이 다음 대동맥의 카테터가 유지되어야한다 관류를 필요로하는 경우, 그렇지 않으면 봉합 넥타이를 잘라 카테터를 제거합니다.
3. DNA 결정
- 50 mM의 KCl을 200 μg의 / ㎖ 프로 테 K를 사용하여 decellularized ECM 또는 제어 마음의 다이제스트를 준비, 2.5 밀리미터의 MgCl 10 mM 트리스 (산도 8.3) 2, 0.45 % 트윈 20.
- 조직이 용해 될 때까지 교반하면서 55 ℃에서 조직을 부화일반적으로 4 ~ 5 시간.
- 분석 4,11 바인딩 DNA와 균질의 DNA 함량을 정량.
4. 고정 및 조직의 단면
- 실온에서 30 분 동안 PBS에서 4 % 파라 포름 알데히드에 decellularized, recellularized 또는 제어 P3의 마음을 수정합니다.
- PBS 배에서 조직을 씻으십시오.
- 이 싱크 될 때까지 4 ℃에서 0.1 M 인산 완충액 7.5 % 자당 용액의 조직을 놓는다.
- 이 싱크 때까지, 다시 4 ° C에서 0.1 M 인산 버퍼에 15 % 자당의 해결책을 변경합니다.
- 37 ° C로 가온 조직을 15 % 수 크로스 및 0.1 M 인산염 완충액 젤라틴 용액 부피의 절반을 교체하고 밤새 평형. 젤라틴의 농도는 1 %, 2.5 %, 5 %를 단계적으로 증가하고 마지막으로 7.5 %를 두 번 있습니다.
- 신선한 7.5 % 젤라틴을 사용 cryomolds에서 샘플을 놓습니다. decellularized 샘플의 형상을 회복하기 위해 액체 젤라틴 t로서 챔버로 살포 될 수있다그는 마음이 성형. 액체 질소에 cryomolds 부동으로 고정. -80 ° C에서 보관하십시오.
- 그라 이오 스탯으로 잘라 (10 μm의 두께) 섹션. 섹션면에 가까운 슬라이드를 가져오고 섹션 인해 정전 기적으로 처리 된 슬라이드의 전하로 표면에 칼으로부터 이동 관찰합니다. 밤새 슬라이드를 건조 및 향후 분석을 위해 -80 ° C에 저장합니다.
- 냉장고에서 슬라이드를 제거, 실내 온도 평형 후 젤라틴을 용해 37 ° C에서 20 분 동안 PBS를 포함하는 코 플린 항아리에 넣습니다.
- 헤 마톡 실린 및 에오신와 단계 4.7에서 절단 된 부분을 얼룩. 코 플린 항아리에 넣어 슬라이드. 1.5 분 동안 에이전트 블루 우잉, 1 분 동안 수돗물, 3 분 동안 버퍼, 1.5 분 동안 수돗물, 45 초 동안 헤 마톡 실린에 단계 4.8에서 수화 슬라이드를 노출, 80 % 에탄올 1 분, 알코올 에오신 Y 8 초, 1 분 배 1 분, 1 분 배 100 % 에탄올, 에이전트를 삭제 (크실렌 대체) 80 % 에탄올, 수지와 커버 슬립기반 장착 매체. 현미경 슬라이드를 검사합니다.
- 가습 실에서 수화 슬라이드를 배치하여 이러한 콜라겐 IV와 같은 ECM 구조 단백질의 심장 ECM, 얼룩의 ECM 단백질의 반응성의 보존을 확인하고 0.1 % 트리톤과 인산염 완충 식염수에 10 % 정상 당나귀 혈청 (NDS)로 처리하려면 -X100 실온에서 1 시간 (RT)에 대한 (PBST). 조직 섹션을 충당하기에 충분한 볼륨을 사용합니다.
- 5 % NDS / PBST에서 경험적으로 결정된 희석 선택의 차 항체와 솔루션을 교체합니다. 예를 들어, 콜라겐 IV 항체를 1로 희석 하였다 : 150. 4 ℃에서 밤새 품어.
- PBST 배와 슬라이드를 세척하고 형광 염료와 결합 선택의 차 항체를 적용합니다. 실험적으로 결정된 양으로 항체를 희석. 실온에서 1 시간 동안 품어. PBS 3 배 씻으시오.
- DAPI는 DAPI 함유 mounti를 사용하여 세포 핵의 유무를 확인하는 등의 DNA 결합 염료 슬라이드 얼룩커버 슬라이드를 미끄러 때 매체 ng를.
- 400X 50에서 형광 현미경 슬라이드를 검사합니다.
Recellularization 5. P1 신생아 쥐 심실 심근
- 70 % 에탄올로 각각의 강아지 스프레이 단일 사용 블레이드 목을 베다.
- 흉부가 흉강을 노출 작은 멸균 가위로 중간 선에서 분할되는 동안 엄지 손가락과 집게 손가락 사이에 각각의 강아지를 잡으십시오. 이 주요 혈관 만 심실 조직을 떠나는 심방의 무료 절단하는 동안 심장이 가슴에서 자유롭게 돌출 할 수 있도록 압력을 적용합니다.
- 20 mL의 빙냉 칼슘 모든 하트가 수집 될 때까지 20 mM의 4- (2- 히드 록시 에틸) -1- 피페 라진 에탄 술폰산 (CBFHH)과 중탄산염 무료 행크 완충 식염수 용액을 함유하는 50 ㎖ 튜브에 직접 각각의 심장 놓는다.
- CBFHH을 기음과 튜브에 신선한 CBFHH (얼음처럼 차가운)의 10 ~ 15 ml에 추가 할 수 있습니다. t의 조직을 소용돌이에 의해 조직을 씻으십시오그는 튜브를 여러 번.
- 60 밀리미터 플라스틱 페트리 접시에 마음을 함유하는 용액을 가만히 따르다.
- 멀리 봄 가위로 마음에서 그것을 트리밍에 의해 얼음에 확대에 따라 마음에서 어떤 잠재적 인 심방 조직을 해부하다. 균일 크기의 작은 조각으로 심실을 말하다. # 5 집게로 요리에서 어떤 구분이 아닌 심실 조직을 제거합니다.
- 멸균 마이크로 교반 막대를 포함하는 작은 멸균 바이알에 조직 조각을 전송할 필요로 CBFHH 용액 많은 피펫.
- 조직은 유리 병의 바닥에 침전하고 CBFHH 솔루션을 제거 할 수 있습니다.
- CBFHH의 효소 용액 1.75 ㎎ / ㎖ 트립신, 20 μg의 / ㎖의 DNase II 50 ㎖를 확인합니다. 피펫 (5)이 효소 용액 mL 및 자기 교반기 다진 심실 조직과 장소를 함유하는 관에 추가. 8 분 동안 실온에서 일정한 속도 (340 RPM)에서 교반 하였다.
참고 : 교반 작용이 완만하고 아직 허용해야슬러리의 서스펜션. - 스터 판에서 병을 제거하고 슬러리를 3 분 동안 침전 할 수 있습니다. 그것은 주로 혈액 세포 및 조직 파편을 포함로 피펫은, 초기 소화 상층 액을 버리고.
- 피펫 제 5 ㎖의 효소 용액의 분취 량과 소화 뇌실에 추가. 8 분 동안 교반하고 또 다른 3 분 동안 침전 할 수 있습니다. 이전 다이제스트를 시작으로, 두 개의 50 ㎖ 튜브 (1 표지 및 2) 각각의 제조 12 ml를 함유하는 빙냉 소 태아 혈청 (FBS). 각 튜브 꼭대기 40 μm의 셀 스트레이너를 놓습니다. 피펫 관 (1)의 필터를 통해이 뜨는.
- FBS가 포함 된 두 개의 튜브의 다이제스트 상등액의 위치를 교대로 소화 공정을 추가로 8 회 반복한다. 각각의 튜브에서 동일한 양을 보장하기 위해 관 (1)과 (2) 사이에 균등 최종 상등액을 분할.
참고 : 각 컬렉션 튜브는 현재 세포 현탁액의 32.5 ml의 총 부피를 포함합니다. - 튜브가 포함 된 원심 분리기4 ° C에서 6 분의 상층 액 150 XG를 보내고.
- 소화 씩을 수집하는 동안, 접시 당 (10 % FBS, 1X 펜 연쇄상 구균, 1 배 L 글루타민과 둘 베코의 변형 이글의 미디어 (DMEM)) 미디어의 6 ㎖로 오 100mm의 조직 배양 플레이트를 준비합니다. 미디어를 평형 30 분 동안 37 ° C, 5 % CO 2에서 이러한 분취 량을 품어.
- 모두 수집 튜브에서 세포 결합 된 CBFHH 효소 혼합물 대기음 상기 제조 배양 배지의 30 ㎖로 세포를 재현 탁.
- 100 밀리 판의 각 세포 현탁액의 6 mL로 돌아가서 37 ° C에서 45 분 동안 품어.
- (섬유 아세포 분획 접시에 접착하기 시작하고, 원하는 경우 별도로 성장 될 수있다) 인큐베이션의 끝에, 5 새로운 요리에 비 부착 세포를 전송하고 45 분 동안 다시 배양한다.
- 프리 도금의 두 번째 라운드의 끝에서, 요리의 미디어 및 비 - 부착 세포를 수집하고 (150)에 미디어를 스핀6 분 XG.
- (관류 액 100 ㎕의 구조 당 4.0 × 10 5 세포)를 대략 원하는 농도로 세포를 가지고 초과 용지를 그립니다. 계산 및 또는 생존 능력 테스트 (14)에 대한 나누어지는을 제거합니다.
P3 심장 매트릭스 6. 생물 반응기 Recellularization
- 밤새 세포를 첨가하기 전에 배지 (단계 5.15 참조)와 격리 심장 매트릭스를 전처리.
- 도에 나타내는 바와 같이 랑겐 돌프 시스템의 요소들을 조립한다. 이. 유리 부를 오토 클레이브 산화 에틸렌 멸균을 보증하기 위해 플라스틱 부품 살균. 시스템의 다양한 서브 유닛이 지지대 상에 장착되기 전에 층류 후드에서 조립 될 수있다. 순환 수조 가열 수류는 명확성을 위해 생략되었다.
- 조직 배양 배지 120 ml에 함께 조립 된 시스템을 작성한다 (단계 5.15 참조).
- 60 밀리미터 막 다른의 단계 2.14에서 카테터 심장 매트릭스를 배치배율 아래 진짜야 요리 카테터에 단계 5.20에서 세포 현탁액로드 × 1 바늘 22 G와 1 ML의 주사기를 연결합니다. 이 어셈블리는 마음을 embolizing 피하기 위해 기포가 없는지 확인합니다.
- 부드럽게 통한 관상 동맥 심장 행렬에 세포 현탁액 100 μl를 관류. 완료되면, 주사기 / 바늘 조합을 분리합니다.
참고 : 약의 느린 관류. 분당 20 μL가 심장 천이, 정맥 유출 셀을 방지 할 필요가있다. - 생물 반응기 심장 병 뚜껑의 아래쪽에있는 루어 피팅에 고정 된 22g 무딘 스텁으로, 그루터기에 카테터를 밀어 넣습니다.
- 연동 펌프를 시작하고 그림 2에 설명 된대로 진행하는 것이 관찰한다. 저수지에서 흐름의 진행 단계 2.5에서 대동맥에 배치 카테터 (그림. 2에서 빨간색 경로)에 버블 트랩을 통해 펌프를 통해. 정맥에서 심장 순환 흐름을 관찰미디어 저장소에 정점, 재순환에서 s와 똑.
주 : 관류 유량 같은 구조의 혈관 저항 및 심장의 크기이지만 100 μL 내지 50의 비율로 각각의 요인에 의존 / 분 좋은 출발점이다. 중간 시점에서, 관능 평가가 수행 될 수있다. 신생아 recellularized 심장의 크기 규모는 수행 할 수 있지만, 우리는 광학 기반 시스템 그들이 성인 쥐 마음에 사용 된 것처럼 동작을 치고 정량화하는 데 사용할 수있는 것으로 확인의 평가를 제한한다. 4 구조는 확장을 위해 관류 할 수 있습니다 (23 시간까지) 시간의 기간.
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Representative Results
탈세 포화
평균적으로, 이러한 프로토콜을 사용하여 P3 심장 탈세 포화까지의 시간은 약 14 시간이다. P3의 신생아 23 mg의 평균 심장 무게 주어진.
Acellularity
도 3a는 완전히 그대로 P3 신생아 마음을 (전체 마운트). 그림 3b는. 탈세 포화 다음과 같은 마음을 보여줍니다도 4a 및도 각각 손상 및 decellularized 마음의 헤 마톡 실린 및 에오신 염색을 보여 4b는 보여줍니다. 헤 마톡 실린 긍정적 인 핵의 부재와 decellularized 마음에 호산 구조의 감소에 유의하십시오. 또한, decellularized 마음의 DNA 함량이 크게 그대로 마음 (N = 6) decellularized 마음에서 4.73 ± 2.27 μg의에 68.08 ± 2.25 μg의에서 감소 (N = 5).
콜라겐의 면역 반응성
탈세 포화 다음과 세포 외 기질 (ECM)의 유지는 외인성 세포 매트릭스의 기능을 다시 채우기 필수적이다. 손상 및 decellularized ECM에서 신생아 ECM의 내용을 평가하기 위하여, 콜라겐 IV에 대한 면역 염색을 실시 하였다. (c)도 그 콜라겐 IV는 견고 모두 그대로하고 decellularized 심장에서 발현되며,이 단백질의 위치 파악이 유지되는 것으로 보여 거라고 DAPI 양성 핵 효과적으로 (도 4E-H)를 제거하는 동안, 세포 제거를 수행.
DNA 내용
DNA의 존재는 세포 수의 부가적인 표시로서 사용된다. 그림 5에서, DNA는 세제를 기반으로 탈세 포화 다음 신생아 마음에 93 % 감소 할 것으로 입증된다. DNA 환원이 정도와 일치다른 조직 15 ~ 16에 세제를 기반으로 탈세 포화를 사용하여 문헌에보고합니다.
Recellularization
우리는 recellularized 마음에 다양한 심근 마커의 발현을 결정하기 위해 면역 조직 화학 염색을 수행했습니다. 6 좌심실의 벽 (그림 6a 및 6b).도 6c는 recellularized 마음의 DAPI 라벨을 보여줍니다으로 마이그레이션 한 세포를 보여줍니다. 그림 6D-G는 각각 NKX 2.5, mCherry, α-티닌 및 DAPI에 대한 긍정적 인 세포를 보여줍니다. NKX2.5은 α-티닌은 차별화 된 심근를 표시하는 sarcomeric 단백질 인 반면, 심장 전구 세포에 라벨을하는 것으로 알려져있다. 이 세포는 심근 마커 EV를 표현하기 위해 계속 것을 나타내는, (도 6H 핑크) 우리는이 마커를 모두 발현하는 세포의 대부분을 관찰실내 관류 23 일 후.
탈세 포화 하드웨어. (A)의 그림 1. 도식. 세제. B 60 cc의 주사기 배럴 저수지. 관개 주사기 상세한. C와 카테터 어셈블리. 그려진 PE 튜브 카테터 팁의 세부 사항. D. 배수와 탈세 포화 챔버와 격막. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 심장 생물 반응기의 도식 표현. 1. carbogen 가스의 가습 (녹색 라인은 가스 흐름을 나타낸다). 미디어 관류 2. 연동 펌프 드라이브산소 (보라색 선이 형산을 통해 미디어의 흐름을 나타낸다). 3. 얇은 벽 형산. 4. 시트 형산 및 미디어 저수지. 5. 사전로드 챔버와 버블 트랩. 6. 심장 챔버 (레드 라인 심장과에서 미디어의 흐름을 나타낸다). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. P3 신생아 마우스 마음의 전체 마운트 (A) 전에 탈세 포화 (B).이 마음 관류 (B) 다음 심장이 반투명하게하는 것이 방법 2 주에 설명 된대로 랑겐 돌프 관류 방법을 사용하여 decellularized 약간 확대 한 후 . 규모 = 2mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
네이티브 및 decellularized P3 신생아 마우스 마음의 그림 4. 조직학.의 저온 부 (10 μm의)는 H & E (A, B), 콜라겐 IV (C, D, G, H)와 DAPI (E, F, G, H로 염색했다 ). 기본 마음 (A)에 비해 병합 된 이미지는 G로 표시되고, H. H & E 염색은 decellularized 조직 (B)의 세포 핵 및 세포질의 부재를 보여줍니다. 콜라겐 IV 내용은 다음과 탈세 포화 (D), DAPI 염색 (핵의 마커)를 유지하면서 폐지된다. 병합 된 이미지는 순진한 마음 (G)와 decellularized 심장 (H)이 colocalization을의 부재에서 콜라겐 IV와 DAPI의 colocalization을을 보여줍니다. 이러한 데이터는 셀을 나타냅니다 없음 더 이상 마음의 콜라겐 매트릭스를 채 웁니다. 규모 = 500 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
DNA 함량도 5 평가. 제어 (N = 6)과 decellularized (N = 5) 피코 그린 법에 의해 DNA 함량에 대하여 분석 마음. 정량 표준 편차 ± 심장 당 DNA의 μg의로 표시됩니다. 별표는 컨트롤에 비해 P <0.01를 나타냅니다. 이러한 데이터는 탈세 포화가 P3 신생아 마음에 크게 DNA 함량을 줄일 수 있음을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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그림 6. 조직학 P3 심장 행렬의 H & E (A, 규모 = 250 μm의, B, 규모 = 50 μm의), DAPI (C, 규모 = 250 μm의), NKX 2.5 P1 mCherry 표현 심근. 스테인드와 recellularization을 다음 이십삼일, mCherry, α-티닌, DAPI와 병합 (D, E, F, G, H, = 50㎛의 스케일). 우리는 P1의 심근 (AC)와 콜라겐 매트릭스의 유효 다시 채우기를 증명하고있다. 또한, 우리는 m-체리 긍정적 인 심근는 Nkx2.5과 콜라겐 매트릭스에 소개 다음 α-티닌 이십삼일을 표현하는 것을 관찰했다. 이러한 데이터는 이러한 세포가 오랜 시간 동안 자신의 심근 정체성을 유지하고 있음을 나타냅니다. 이 F의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오igure.
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Discussion
마음의 반복 관류에이 기술의 의존도는 색전증을 피하기 성공적인 결과의 중요한 구성 요소를 만든다. 단계 2.8-2.14 사이의 솔루션의 변화 단계 2.2-2.6의 심장의 초기 카테터,에서, 어떤 타협 심근에 관류의 흐름을 기포의 도입을 허용 할 수 있습니다 조작이 있습니다. 때문에 신생아 심장의 소형 크기로, 혈관에 미세한 기포 따라서 불완전 탈세 포화 렌더링, 기술 경색의 원인이 될 수 있습니다. 또한, 나중에 세척 단계에서, 불완전 관류에 부정적인 영향을 생체 적합성 세제 잔류 물이 발생할 수 있습니다. 변화에 용액으로부터의 가스 움직임을 용해 할 때 또한 기포 형성의 원인이 될 수있는 또, 단계 2.14에 제시된 바와 같은 4 ℃로 보관 중 매트릭스를 제거 할 때와 같은 급격한 온도 변화는주의 접근해야 온도입니다. W주입을 위해, 세포 현탁액에 주사기를 준비 할 때, 부가적인 치료가 적용되어야 recellularization로 진행 편 무료 버블 (6.4 공정)이다.
이는 다른 조직 유형을 수용하기 위해 프로토콜의 세부 사항을 조작 할 필요가있다. 탈세 포화 프로토콜의 수는 지침을 제공 할 수 4,9,11보고있다. 잔류 DNA 예로 임의의 탈세 포화 프로토콜의 최종 목표 (들)은 천연 세포 성분의 상기 ECM 단백질 구조의 유지 및 관련 생화학, 적절한 제거를 포함한다. 이 설정에서, 과도한 관류 압력의 적용은 조직 학적으로 가시화 될 수있는 ECM의 미세 구조의 파괴에 이르게.
P3 마우스 심장의 크기는 성인 조직에 비해 세포 투여에 대한 몇 가지 제약을 둔다. 성인의 마음은 전층의 injectio하게 두꺼운만큼 심실 벽을 제시하면서NA 가능한 세포 전달 양상은 P3 심장 세포 현탁액을 용균하지 않습니다 크기있는 바늘이 심장에 상당한 피해를 충분히 작다. 관류 가능한 전달 전략이지만, 효과적으로 전달되도록 특정 크기 및 형상의 세포에 의존한다. 신생아 쥐의 근육 세포는이 점에서 잘 작동합니다. 다른 작은 원형 세포는이 목적 (11) 역할을하는 것으로 나타났다. 이 마음의 크기 규모는 압력 볼륨 카테터로서 종래의 생리적 기능 분석의 사용을 배제한다. 비디오 캡처에 기초하여 다른 방법이 고려 될 수있다.
이러한 데이터는 탈세 포화 및 신생아 마우스 마음의 recellularization의 타당성을 지원합니다. 이전의 연구는 탈세 포화 / recellularization 연구의 목적 성인 하트의 사용을 증명하고있다. 이러한 성인의 마음에서 생성 된 행렬은 신생아 심근 4 인간으로 다시 채워왔다유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs) 17. hiPSCs의 경우, 다시 채워 하트는 NANOG, SOX2 및 OCT4 형성된 근육 형 구조와 같은 다 능성 마커의 감소를 표시; 성숙의 모든 암시. 전자 재료의 세포 외 큐, 그러나, 재생 능력 항구 알려진 조직으로부터 매트릭스를 생성하려고 시도하라고 프롬프트 세포, 조직 및 기관의 개발에 중요한 역할을하는 것으로 나타났다. 우리의 연구에서 우리는 recellularized 마음은 여전히에도 장기간 배양 한 후, 심근 마커를 표현하는 것을 보여줍니다. 이러한 데이터는 신규 매트릭스를 이용하여, 심근 세포가 심근 세포로 자신의 정체성을 잃어 버리지 않고 장시간 동안 유지 될 수 있음을 나타낸다. 우리의 데이터는 신생아 마우스 마음을 decellularizing에 대한 기술과 가능성을 지원합니다. 신생아 행렬 다시 채우기 연구를위한 새로운 구조를 제공 할뿐만 아니라 SUP가 겔의 제조에 잠재력을 보유erior 재생 능력. 이들 신생아하는 ECM을 사용하여, 우리는 이제 hiPSCs 포함한 세포 종류의 다양한 기능적인 조직을 형성하기 위해 이러한 지지체의 우수성을 해결한다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Materials for mouse heart isolation | |||
| P1 mouse pups (as shown; B6;D2-Tg(Myh6*-mCherry)2Mik/J) | Jackson Laboratories | 21577 | or equivalent |
| 60 mm Culture dish | BD Falcon | 353004 | or equivalent |
| Phosphate buffered saline pH 7.4 (sterile) | Hyclone | SH30256.01 | or equivalent |
| Single Use Blade | Stanley | 28-510 | or equivalent |
| Standard Scissors | Moria Bonn (Fine Science Tools) | 14381-43 | or equivalent |
| Spring Scissors 10 cm | Fine Science Tools | 15024-10 | or equivalent |
| Vannas Spring Scissors - 3 mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15000-00 | or equivalent |
| #5 Forceps | Dumnot (Fine Science Tools) | 11295-00 | or equivalent |
| 2. Materials for decellularization | |||
| Inlet adaptor | Chemglass | CG-1013 | autoclavable |
| Septum | Chemglass | CG-3022-99 | autoclavable |
| 1/8 in. ID x 3/8 OD C-Flex tubing | Cole-Parmer | EW-06422-10 | autoclavable |
| Male luer to 1/8" hose barb adaptor | McMaster-Carr | 51525K33 | autoclavable |
| Female luer to 1/8" hose barb adaptor | McMaster-Carr | 51525K26 | autoclavable |
| Prolene 7-0 surgical suture | Ethicon | 8648G | or equivalent |
| Ring stand | Fisher Scientific | S47807 | or equivalent |
| Clamp | Fisher Scientific | 05-769-6Q | or equivalent |
| Clamp regular holder | Fisher Scientific | 05-754Q | or equivalent |
| 60 cc syringe barrel | Coviden | 1186000777T | or equivalent |
| Beaker | Kimble | 14000250 | or equivalent |
| 22 G x 1 Syringe Needle | BD | 305155 | or equivalent |
| 12 cc syringe | Coviden | 8881512878 | or equivalent |
| 3-way stop cock | Smith Medical | MX5311L | or equivalent |
| PE50 tubing | BD Clay Adams Intramedic | 427411 | Must be formable by heat. Polyethylene recommended. |
| 1% SDS | Invitrogen | 15525-017 | Ultrapure grade recommended. Make up fresh solution and filter sterilize before use. |
| 1% Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Make up fresh solution from a 10% stock and filter sterilize before use. |
| Sterile dH2O | Hyclone | SH30538.02 | Or MilliQ system purified water. |
| 1x Pen/Strep | Corning CellGro | 30-001-Cl | or equivalent |
| 3. Materials for DNA quantitation | |||
| Proteinase K | Fisher | BP1700 | >30 U/mg activity |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | or equivalent |
| MgCl2·6H2O | Mallinckrodt | 5958-04 | or equivalent |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | or equivalent |
| Tris base/hydrochloride | Sigma-Aldrich | T1503/T5941 | or equivalent |
| Pico-Green dsDNA assay kit | Life Technologies | P7589 | requires fluorimeter to read |
| 4. Method for fixation and sectioning of tissue | |||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | or equivalent |
| Gelatin Type A from porcine skin | Sigma-Aldrich | G2500 | must be 300 bloom or greater |
| 5. Method for tissue histology | |||
| Cryomolds 10 x 10 x 5 mm | Tissue-Tek | 4565 | or equivalent |
| Cryostat | Hacker/Bright | Model OTF | or equivalent |
| Microscope Slides 25 x 75 x 1 mm | Fisher Scientific | 12-550-19 | or equivalent |
| Hematoxylin 560 | Surgipath/Leica Selectech | 3801570 | or equivalent |
| Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | or equivalent |
| Define | Surgipath/Leica Selectech | 3803590 | or equivalent |
| Blue buffer | Surgipath/Leica Selectech | 3802915 | or equivalent |
| Alcoholic Eosin Y 515 | Surgipath/Leica Selectech | 3801615 | or equivalent |
| Formula 83 Xylene substitute | CBG Biotech | CH0104B | or equivalent |
| Permount Mounting Medium | Fisher Chemical | SP15-500 | or equivalent |
| Collagen IV Antibody | Rockland | 600-401-106.1 | or equivalent |
| α-Actinin Antibody | Abcam | AB9465 | or equivalent |
| mCherry Antibody | Abcam | AB205402 | or equivalent |
| NKX2.5 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-8697 | or equivalent |
| Donkey anti-mouse AF488 Antibody | Life Technology | A21202 | or equivalent |
| Donkey anti-chicken AF594 Antibody | Jackson Immunoresearch | 703-585-155 | or equivalent |
| Donkey anti-goat CY5 Antibody | Jackson Immunoresearch | 705-175-147 | or equivalent |
| Fab Fragment Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) AF594 | Jackson Immunoresearch | 111-587-003 | or equivalent |
| Prolong Gold Antifade Mountant with DAPI | ThermoFisher | P36930 | or equivalent |
| 6. Isolation of neonatal ventricular cardiomyocytes using pre-plating | |||
| HBSS (Ca, Mg Free) | Hyclone | SH30031.02 | or equivalent |
| HEPES (1 M) | Corning CellGro | 25-060-Cl | or equivalent |
| Cell Strainer | BD Falcon | 352340 | or equivalent |
| 50 ml tube | BD Falcon | 352070 | or equivalent |
| Primeria 100 mm plates | Corning | 353803 | Primeria surface enhances fibroblast attachment promoting a higher myocyte purity |
| Trypsin | Difco | 215240 | or equivalent |
| DNase II | Sigma-Aldrich | D8764 | or equivalent |
| DMEM (Delbecco's Minimal Essential Media) | Hyclone | SH30022.01 | or equivalent |
| Vitamin B12 | Sigma-Aldrich | V6629 | or equivalent |
| Fibronectin coated plates | BD Bioscience | 354501 | or equivalent |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30910.03 | or equivalent |
| Heart bioreactor glassware | Radnoti Glass Technology | 120101BEZ | Must be sterilizable by autoclaving or gas. |
References
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