Summary
In questi studi, forniamo metodologia per nuovi, neonatali, impalcature cardiaci murini per l'uso in studi rigenerative.
Introduction
L'insufficienza cardiaca è comune e mortale. È una malattia progressiva che si traduce in una riduzione della contrattilità del cuore, che ostacola il flusso di sangue agli organi e lascia le richieste metaboliche del corpo insoddisfatte. Si stima che 5,7 milioni di americani hanno l'insufficienza cardiaca ed è la causa primaria di ospedalizzazione negli Stati Uniti 9. Il costo collettivo di trattamento di pazienti in insufficienza cardiaca negli Stati Uniti supera i $ 300 miliardi di dollari l'anno 9-10. L'unica terapia definitiva per l'insufficienza cardiaca allo stadio terminale è il trapianto di cuore ortotopico. Ogni anno, si stima che più di 100.000 cuori dei donatori sono necessari per le procedure di trapianto cardiaco negli Stati Uniti 1-2. A causa del limitato numero di donatori, solo circa 2.400 trapianti vengono effettuati ogni anno negli Stati Uniti 2. Chiaramente, questa carenza di organi deve essere affrontato come altre strategie sono tenuti a produrre organi aggiuntivi per il trapiantozione e, idealmente, questi organi sarebbe autologo in modo da evitare le complicazioni associate con il rifiuto e la durata immunosoppressione.
Cardiomiociti adulti mammiferi dimostrano una limitata capacità di rigenerazione su di infortunio, ma recenti evidenze suggeriscono che mammiferi cuori neonatali mantengono una notevole capacità rigenerativa dopo un trauma 5-8. In particolare, dopo la resezione chirurgica parziale, una finestra rigenerativa è stato scoperto tra la nascita e postnatale giorno 7. Questo periodo rigenerativa è caratterizzata da una mancanza di cicatrice fibrotica, formazione di neovascolarizzazione, rilascio di fattori angiogenici dalla epicardio e cardiomiociti proliferazione 5-8 , 11. Questa finestra rigenerativo di tempo fornisce il potenziale di utilizzo cuore neonatale quale nuovo fonte di materiale per lo sviluppo di un cuore bioartificiale.
La matrice extracellulare è nota per fornire spunti importanti per promuovere cardiomyocyte la proliferazione e la crescita. Chiare differenze nella disponibilità di molecole nelle matrici neonatali e adulti 12 e la loro capacità di promuovere la rigenerazione sono state esplorate 13. matrici adulti decellularized sono stati utilizzati in diversi studi per fornire un ponteggio ECM per ripopolazione cellulare e la generazione di un cuore bioartificiale. Mentre questi studi, e le nuove scoperte nel campo delle tecnologie di cellule staminali, stanno avanzando rapidamente, diversi ostacoli devono ancora essere soddisfatte. Ad esempio, limitazioni nella preservando la struttura originaria della matrice, l'integrazione cellulare nella parete della matrice, e la capacità di sostenere la proliferazione e la crescita tutti i limiti del successo di questo approccio. Mentre gli attributi rigenerativa superiori sono state attribuite al cuore neonatale, gli aspetti pratici di utilizzo di un tessuto così hanno limitato la sua esplorazione.
Sulla base della capacità rigenerativa dimostrata del cuore neonatale, abbiamo sviluppato nuovi matrici sviluppando unatecnica di decellularization per il cuore P3 mouse. Il cuore P3 è stato scelto per questi studi in quanto è all'interno della finestra di rigenerazione cardiaca come precedentemente determinato 6 ma il cuore è grande abbastanza per il raccolto, decellularize e recellularize. L'obiettivo di questo studio è quello di dimostrare la fattibilità della creazione di una matrice da un cuore neonatale del mouse. I nostri studi forniscono prove per la fattibilità di decellularizing un minuto, cuore neonatale pur mantenendo l'integrità strutturale e proteica della ECM. Dimostriamo anche la capacità di recellularize questo ECM cardiaco con mCherry cardiomiociti che esprimono e abbiamo esaminato questi cardiomiociti per l'espressione di diversi marcatori cardiaci seguenti Recellularization. Questa tecnologia permetterà per la prova della superiorità di una matrice neonatale per lo sviluppo di un cuore bioartificiale.
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Protocol
Tutti gli esperimenti di topo sono stati eseguiti in conformità con Animal Welfare Act degli Stati Uniti e sono stati approvati dal Comitato di Cura e uso istituzionale degli animali presso l'Università del Minnesota.
1. Metodo per l'isolamento Cuore mouse
- Euthanize un mouse neonatale per decapitazione con una sola lama utilizzo.
- Tampone torace con il 70% di etanolo.
- Sezionare la pelle dal petto tagliando via dalla parete toracica con le forbici standard, tirando la pelle lateralmente una coppia di pinze # 5.
- Perforare l'addome appena inferiore allo sterno con le forbici tagliando attraverso la parete addominale. Afferrando il processo xifoideo con # 5 pinze, ritrarre lo sterno rostralmente dal corpo durante il taglio se le costole su entrambi i lati del torace con le forbici. La gabbia toracica si riflette superiormente con la pinza per rivelare il cuore.
- Senza mezzi termini sezionare i due lobi principali del timo tirando lateralmente # 5 pinze, esponendol'arco dell'aorta, nonché le vene cavali e polmonari.
- Transetto le principali arterie dall'arco aortico e l'aorta in sé, con le forbici a molla 10 cm. Conservare l'aorta tra la base del cuore e l'arteria anonima. Afferrare le estremità dei vasi mozzate con il # 5 pinze per riflettere cuore avanti, separandolo dalla trachea e dell'esofago.
- Transect vascolare polmonare e altre grandi vene, tagliando tra i polmoni e il cuore su entrambi i lati del cuore con le forbici a molla 10 cm. Le vene rimangono aperti per fornire il drenaggio.
- Rimuovere il cuore dal mediastino con il # 5 pinze, afferrare le estremità mozzate dei grandi vasi. Mettere il cuore in un piatto di cultura 60 millimetri contenente sterile tampone fosfato salino (PBS) per cateterizzazione.
2. Metodo per Decellularization da Langendorff perfusione
- Preparare il complesso di catetere in anticipo. Disegnare una sezione di quattro centimetriPE 50 tubi in una piccola fiamma alcool per creare un più piccolo, più sottile catetere. Tagliare le estremità con una lama per soddisfare le dimensioni (circa. 300 um OD diametro esterno di una flangia di circa. OD 500 micron) di figura 1. Ciò fornirà due cateteri simmetriche da ciascun lato del tiro.
- Puntare l'estremità tagliata del tubo nella fiamma brevemente, per fondere una flangia sulla apertura all'estremità sottile.
- Riempire la siringa 12 ml con PBS e assemblare il catetere inserendo un rubinetto a 3 vie sulla siringa. Aggiungere un 22 G x 1 ago per il rubinetto e guidare l'ago attraverso il setto. Far scorrere il tubo del catetere PE disegnato sul dell'ago (Fig. 1).
- Lavare le parti assemblate con PBS, assicurando che tutte le bolle d'aria sono stati rimossi.
- Inserire il catetere, preparato come descritto sopra, in aorta del cuore isolato, che non si estende oltre la valvola aortica e legare con un tirante di 7-0 sutura. Appoggiare la flangia di tegli catetere prossimale contro la cravatta, facendo una perfetta tenuta e prevenire il cuore di venire fuori il catetere.
- Osservare la cateterizzazione sotto ingrandimento, mentre delicatamente perfusione cuore utilizzando la siringa contenente PBS. Assicurarsi che non vi siano perdite nel sistema e il tessuto blanches omogeneo come il sangue latente viene rimosso.
- Posizionare il setto nel collo dell'adattatore ingresso e sigillarlo ripiegando i lati sopra il vetro.
- Fissare il serbatoio riempito con 60 ml di 1% solfato di sodio dodecil (SDS) in acqua distillata (DH 2 O) tramite una linea di lunghezza sufficiente a produrre una colonna che genera 20 millimetri Hg di pressione, come mostrato in Fig. 1. Calcolare la pressione dall'alto colonna di liquido in base al rapporto di 1 mm Hg è pari a 1,3595 centimetri H 2 O.
Attenzione: SDS è una polvere altamente flocculante con proprietà irritanti. Contatto dovrebbe essere evitato. Maneggiare la polvere utilizzando appropriati indumenti protettivi. - Profumato cuore con 1% SDS per 14 ore. Il cuore sarà traslucido in apparenza senza tessuto rimanente osservabile.
- Lavare il sistema fino al rubinetto della soluzione rimanente SDS e sostituirla con 10 ml dH 2 O. Profumato cuore con 10 ml di 1% Triton X-100 (diluito in acqua distillata), seguita da 10 ml dH 2 O, seguiti da 60 ml di PBS contenenti 1x streptomicina penicillina (Pen-Strep).
- Conservare il cuore in PBS con 1x Pen-Strep a 4 ° C. Se l'applicazione palo decellularization destinato richiede perfusione quindi il catetere in aorta deve essere mantenuto, altrimenti tagliare il legame di sutura e rimuovere il catetere.
Determinazione 3. DNA
- Preparare un digest del decellularized ECM o il controllo cardiaco utilizzando 200 mg / ml proteinasi K in 50 mM KCl, 2,5 mM MgCl 2, 0,45% di Tween 20 in 10 mM Tris (pH 8,3).
- Incubare il tessuto a 55 ° C con agitazione fino a quando il tessuto è dissolto,in genere 4-5 ore.
- Quantificare il contenuto di DNA della omogenato con un DNA test di 4,11 vincolante.
4. Fissazione e il sezionamento di tessuto
- Fix decellularized, cuori recellularized o controllo P3 in 4% paraformaldeide in PBS per 30 minuti a temperatura ambiente.
- Lavare il tessuto in PBS 3x.
- Posizionare il tessuto in una soluzione di 7,5% di saccarosio in tampone fosfato 0,1 M a 4 ° C fino affonda.
- Cambiare la soluzione al 15% di saccarosio in tampone fosfato 0,1 M a 4 ° C, ancora, fino affonda.
- Riscaldare il tessuto a 37 ° C, sostituire la metà del volume con soluzione di gelatina nel 15% di saccarosio e 0,1 M tampone fosfato ed equilibrare la notte. Le concentrazioni di gelatina sono aumentati graduale attraverso 1%, 2,5%, 5% e infine 7,5% due volte.
- Mettere i campioni in cryomolds utilizzando fresco 7,5% di gelatina. Per ripristinare la forma dei campioni decellularized, liquido gelatina può essere perfuso nelle camere come tlui cuori sono modellati. Congelare galleggiando i cryomolds in azoto liquido. Conservare a -80 ° C.
- CUT (10 micron di spessore) sezioni con un criostato. Portare la slitta vicino alla superficie della sezione e osservare la sezione spostarsi fuori dal coltello sulla superficie dovuta alla carica sui vetrini trattati elettrostaticamente. Asciugare le diapositive durante la notte e conservare a -80 ° C per le analisi future.
- Rimuovere i vetrini dal congelatore, equilibrare a temperatura ambiente e poi posto in una vaschetta Coplin contenente PBS per 20 minuti a 37 ° C per sciogliere la gelatina.
- Macchiare le sezioni tagliate dal punto 4.7 con ematossilina eosina. Collocare i vetrini in una vaschetta Coplin. Esporre le diapositive idratato al punto 4.8 per ematossilina per 45 secondi, l'acqua del rubinetto per 1,5 minuti, tampone per 3 minuti, l'acqua del rubinetto per 1 minuto, agente azzurrante per 1,5 min, 80% di etanolo per 1 min, alcolica Eosina Y per 8 secondi, 80% di etanolo per 1 minuto, 100% di etanolo per 1 min 2x, stanza di compensazione (sostituto di xilene) per 1 min 3x, coprioggetto con resinaMezzo di montaggio basato. Esaminare le diapositive al microscopio.
- Per confermare il mantenimento di ECM proteine reattività del ECM cuore, macchia per proteine strutturali ECM come il collagene IV, ponendo le diapositive idratati in una camera umidificata e trattare con il 10% normale asino siero (NDS) in tampone fosfato con 0,1% Triton -X100 (PBST) per 1 ora a temperatura ambiente (RT). Utilizzare un volume sufficiente a coprire le sezioni di tessuto.
- Sostituire la soluzione con l'anticorpo primario di scelta ad una diluizione empiricamente determinato 5% NDS / PBST. Per esempio, l'anticorpo collagene IV è stato diluito a 1: 150. Incubare per una notte a 4 ° C.
- Lavare i vetrini con PBST 3x e applicare un anticorpo secondario di scelta coniugato con un colorante fluorescente. Diluire l'anticorpo di una quantità determinata empiricamente. Incubare per 1 ora a RT. Lavare con PBS 3x.
- Colorare i vetrini con un colorante legame al DNA come DAPI per verificare l'assenza di nuclei delle cellule utilizzando un mounti DAPI contenenteng media quando il coperchio scivolare le diapositive.
- Esaminare i vetrini con un microscopio a fluorescenza da 50 a 400X.
5. P1 neonatale murino ventricolare cardiomiociti per Recellularization
- Spruzzare ogni cucciolo con il 70% di etanolo e decapitarlo con una lama singola uso.
- Tenere ogni pup tra il pollice e l'indice, mentre il torace è diviso sulla linea mediana con piccole forbici sterili per esporre la cavità toracica. Applicare pressione per consentire cuore di sporgere liberamente dal petto mentre è tagliato libera dei grandi vasi e gli atri lasciando solo il tessuto ventricolare.
- Mettere ogni cuore direttamente in un tubo da 50 ml contenente 20 ml ghiacciata di calcio, soluzione salina tamponata Bicarbonato libero di Hank con 20 mM 4- (2-idrossietil) Acido -1-piperazineethanesulfonic (CBFHH) fino a quando tutti i cuori sono raccolti.
- Aspirare il CBFHH e aggiungere 10-15 ml di CBFHH fresco (ghiacciata) al tubo. Lavare il tessuto agitando il tessuto in tegli provetta diverse volte.
- Decantare la soluzione contenente il cuore in una plastica Petri piastre da 60 mm.
- Sezionare qualsiasi tessuto atriale latente dal cuore sotto ingrandimento sul ghiaccio da tagliare via dal cuore con le forbici a molla. Tritare i ventricoli in piccoli pezzi in modo omogeneo dimensioni. Rimuovere qualsiasi tessuto non-ventricolare separato dal piatto con # 5 pinze.
- Pipettare tanto della soluzione CBFHH come è necessario per trasferire i frammenti di tessuto in una piccola fiala sterile contenente una sterile bar micro mescolare.
- Lasciare il tessuto sedimentare sul fondo della fiala e rimuovere la soluzione CBFHH.
- Portare 50 ml di una soluzione enzimatica 1,75 mg / ml di tripsina, 20 ug / ml DNasi II in CBFHH. Dispensare 5 ml di questa soluzione enzimatica e aggiungerlo a una provetta contenente il tessuto ventricolare tritato e posto su un agitatore magnetico. Mescolare ad un tasso costante (340 rpm) a temperatura ambiente per 8 min.
NOTA: L'azione di agitazione deve essere dolce e tuttavia consentireper la sospensione della sospensione. - Rimuovere la fiala dalla piastra mescolare e lasciare l'impasto per sedimentare per 3 min. Pipetta e scartare il surnatante iniziale di digerire, in quanto contiene principalmente le cellule del sangue e detriti dei tessuti.
- Pipettare un secondo 5 ml aliquota della soluzione enzimatica e aggiungerlo al ventricolo digerire. Mescolare per 8 minuti e lasciare sedimentare per altri 3 minuti. Prima di iniziare i digest, preparare due provette da 50 ml (etichettati 1 e 2) ciascuna contenente 12 ml di ghiacciata siero fetale bovino (FBS). Mettere un filtro cella di 40 micron in cima a ciascun tubo. Pipettare questo surnatante attraverso il filtro sul tubo 1.
- Ripetere il processo di digestione ulteriori 8 volte, alternando il posizionamento del surnatante digest tra i due tubi contenenti FBS. Dividere l'ultimo surnatante in parti uguali tra i tubi 1 e 2 per garantire volumi uguali in ogni tubo.
NOTA: Ogni tubo di raccolta conterrà ora 32,5 ml di volume totale di sospensione cellulare. - Centrifugare le provette contengonoing XG surnatante 150 per 6 minuti a 4 ° C.
- Mentre la raccolta delle aliquote di digestione, preparare cinque 100 piastre di coltura dei tessuti mm con 6 ml di media (Dulbecco Modified Eagle media (DMEM) con il 10% FBS, 1x Pen-Strep, 1x L-glutammina) per piastra. Incubare le aliquote a 37 ° C, 5% CO 2 per 30 minuti per equilibrare la media.
- Aspirare la miscela di enzimi CBFHH e risospendere le cellule in 30 ml di terreni di coltura preparato in precedenza, che unisce le cellule da entrambi i tubi di raccolta.
- Ritorno 6 ml di sospensione cellulare per ciascuna delle piastre 100 mm e incubare per 45 min a 37 ° C.
- Al termine dell'incubazione, trasferire le cellule non aderenti a 5 piatti nuovi e ri-incubare per 45 min (la frazione fibroblasti avrà iniziato ad aderire ai piatti e può essere coltivata separatamente se desiderato).
- Al termine del secondo turno di pre-placcatura, raccogliere i media e le cellule non aderenti dai piatti e far girare i mezzi di comunicazione a 150xg per 6 min.
- Aspirare supporti in eccesso per portare le cellule alla concentrazione desiderata approssimativa, (4.0 x 10 5 cellule per costrutto in 100 ml di perfusato). Rimuovere una aliquota per il conteggio e la vitalità o il test di 14.
6. bioreattore Recellularization di P3 Cuore Matrix
- Pretrattare la matrice cuore isolato con terreni di coltura (vedi punto 5.15) per una notte prima di aggiungere le cellule.
- Assemblare gli elementi di un sistema di Langendorff come mostrato in Fig. 2. Autoclave le parti in vetro e ossido di etilene sterilizzare le parti in plastica per assicurare la sterilità. Varie unità secondarie del sistema possono essere assemblati in una cappa a flusso laminare prima di essere montato sul supporto. Di circolazione bagno di acqua e riscaldata percorso del flusso d'acqua è stato omesso per chiarezza.
- Riempire il sistema assemblato con 120 ml di terreni di coltura tissutale (vedere il punto 5.15).
- Posizionare la matrice cuore cateterismo dal punto 2.14 in un cul 60 millimetripiatto tura sotto ingrandimento e collegare una siringa da 1 ml con 22 G x 1 ago caricato con sospensione cellulare dal punto 5.20 al catetere. Assicurarsi che questa assemblea è privo di bolle d'aria per evitare embolizzazione cuore.
- profumato delicatamente i 100 ml di sospensione cellulare nella matrice cuore attraverso le arterie coronarie. Una volta completato, staccare la combinazione della siringa / ago.
NOTA: Un lento perfusione di circa mq. 20 ml per min è necessaria per evitare che le cellule di fluire fuori dalle vene, in transito cuore. - Con un 22g stub smussato fissato al raccordo Luer sul lato inferiore del coperchio vaso cuore bioreattore, spingere il catetere sul perno.
- Avviare la pompa peristaltica e osservare che il flusso procede come illustrato in figura 2. Flusso procede dal serbatoio tramite la pompa attraverso il gorgogliatore al catetere posizionato in aorta nel passo 2.5 (percorso rosso in Fig. 2). Osservare il flusso della circolazione cardiaco della venas e gocciolare dall'apice, ricircolo al serbatoio media.
NOTA: La portata perfusione dipende da fattori individuali quali la resistenza vascolare del costrutto, e la dimensione del cuore, ma un tasso di 50 a 100 microlitri / min è un buon punto di partenza. In momenti intermedi, le valutazioni funzionali possono essere eseguiti. La scala dimensione del cuore recellularized neonatale limita le valutazioni, che possono essere eseguite, ma abbiamo stabilito che i sistemi basati otticamente possono essere utilizzati per quantificare battere comportamento così come sono stati utilizzati in cuori di ratto adulto. 4 Il costrutto può essere perfusi per esteso periodi di tempo (fino a 23 ore).
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Representative Results
decellularization
In media, il tempo di decellularization di un cuore P3 utilizzando questo protocollo è di circa 14 ore. dato un peso medio di 23 mg di cuore per il neonato P3.
Acellularity
Figura 3a mostra un cuore neonatale completamente intatto P3 (tutto il monte). La figura 3b mostra lo stesso cuore seguente decellularization. Figure 4a e 4b mostrano la ematossilina e eosina di cuori intatti e decellularized, rispettivamente. Si noti l'assenza di ematossilina nuclei positivi e la diminuzione delle strutture di eosinofili nel cuore decellularized. Inoltre, il contenuto di DNA del cuore decellularized è significativamente ridotto da 68.08 ± 2,25 mcg nel cuore intatto (n = 6) a 4,73 ± 2,27 mcg nel cuore decellularized (n = 5).
Collagene immunoreattività
Il mantenimento della matrice extracellulare (ECM) seguente decellularization è essenziale ripopolazione con cellule esogene e alla funzionalità della matrice. Per valutare il contenuto della ECM neonatale in ECM intatta e decellularized, è stata eseguita immuno-colorazione per il collagene IV. Figura 4c e d dimostrare che il collagene IV è robusto espresso sia cuore intatto e decellularized e che la localizzazione di questa proteina viene mantenuta dopo la rimozione delle cellule, mentre DAPI nuclei positivi vengono rimossi in modo efficace (Figura 4e-h).
contenuto di DNA
La presenza di DNA viene usato come indicazione supplementare di cellularità. Nella Figura 5, il DNA è dimostrato essere diminuito del 93% nei cuori neonatali seguente decellularization base detergente. Questo grado di riduzione DNA è coerente consegnalazioni in letteratura utilizzando decellularization base detergente in altri tessuti 15-16.
Recellularization
Abbiamo effettuato immunoistochimica per determinare l'espressione di diversi marcatori di cardiomiociti nel cuore recellularized. La Figura 6 illustra cellule che sono migrate nella parete del ventricolo sinistro (Figura 6A e 6B). Figura 6C illustra l'etichettatura DAPI del cuore recellularized. Figura 6D-G illustra le cellule che sono positivi per 2,5 NKX, mCherry, α-actinina e DAPI, rispettivamente. NKX2.5 è noto per etichettare le cellule progenitrici cardiache, mentre α-actinina è una proteina sarcomerica che segna cardiomiociti differenziati. Abbiamo osservato una maggioranza delle cellule che esprimono tutti questi marcatori (rosa; Figura 6H), indicando che queste cellule continuano ad esprimere marcatori cardiomiociti evit dopo 23 giorni di perfusione.
Figura 1. Schema di hardware decellularization. A. 60 cc serbatoio siringa per soluzione detergente. B. Complesso di catetere con irrigazione siringa come dettagliata. C. Particolare della punta del catetere PE tubo trafilato. D. Camera di Decellularization e setto con scarico. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Rappresentazione schematica del bioreattore cuore. 1. Umidificazione di gas CarboGen (linee verdi rappresentano il flusso di gas). 2. azionamento della pompa peristaltica per perfusione media eossigenazione (linee viola rappresentano il flusso di media attraverso ossigenatore). 3. ossigenatore a parete sottile. 4. ossigenatore Foglio e serbatoio media. camera 5. precarico e delle bolle. 6. camera di Cuore (linee rosse rappresentano il flusso di mezzi da e per il cuore). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. intero monte di P3 cuore neonatale mouse prima (A) e dopo decellularization (B). Questo cuore è decellularized utilizzando il metodo di perfusione Langendorff come descritto nel metodo 2. Si noti che il cuore diventa trasparente e leggermente ampliata dopo perfusione (B) . Scala = 2 mm. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Istologia di P3 cuore del mouse neonatale nativo e decellularized. Sezione criostato (10 micron) sono state colorate con H & E (A, B), Collagene IV (C, D, G, H) e DAPI (E, F, G, H ). immagini uniti sono rappresentati in G e H. H & E colorazione mostra l'assenza di nuclei cellulari e citoplasma nel tessuto decellularized (B) rispetto al cuore nativa (A). Mentre il contenuto di collagene IV rimane seguente decellularization (D), colorazione DAPI (un marcatore di nuclei) è abolito. Le immagini unite dimostrano la colocalizzazione di collagene IV e DAPI nel cuore naive (G) e l'assenza di questa colocalizzazione nel cuore decellularized (H). Questi dati indicano che le cellule non compilare più la matrice di collagene del cuore. Scala = 500 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5. Valutazione del contenuto di DNA. Controllo (n = 6) e decellularized (n = 5) cuori analizzati per il contenuto di DNA mediante il metodo pico-verde. La quantificazione espresso come mg di DNA per cuore ± deviazione standard. L'asterisco indica p <0,01 rispetto al controllo. Questi dati indicano che decellularization riduce in modo significativo il contenuto di DNA nel cuore neonatale P3. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Figura 6. Istologia di P3 matrice cuore 23 giorni seguenti Recellularization con P1 mCherry esprimono cardiomiociti. Colorate con H & E (A, scala = 250 micron, B, scala = 50 micron), DAPI (C, scala = 250 micron), NKX 2.5, mCherry, α-actinina, DAPI, e uniti (D, e, F, G, H, scala = 50 micron). Abbiamo dimostrato il ripopolamento efficace della matrice di collagene con cardiomiociti P1 (AC). Inoltre, abbiamo osservato che m-ciliegia cardiomiociti positivi esprimono Nkx2.5 e alfa-actinina 23 giorni introduzione nella matrice di collagene. Questi dati indicano che queste cellule mantengono la loro identità cardiomiociti per lunghi periodi di tempo. Fate clic qui per vedere una versione più grande di questo fIGURA.
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Discussion
La dipendenza di questa tecnica su ripetuto perfusione del cuore fa evitare un'embolia una componente critica di un esito positivo. Dal cateterizzazione iniziale del cuore nei passaggi 2.2-2.6, ai cambiamenti di soluzione tra Piazza 2.8-2.14, ci sono manipolazioni che possono permettere l'introduzione di bolle d'aria che compromettono il flusso di perfusato nel miocardio. A causa del peso ridotto cuore neonatale, anche bolle minute vascolarizzazione possono causare un infarto tecnica, rendendo il decellularization incompleta. Inoltre, nelle fasi di lavaggio successive, perfusione incompleta può provocare detersivo residuo che influisce negativamente biocompatibilità. Inoltre, rapidi cambiamenti di temperatura, come quando si rimuove la matrice dal magazzino 4 ° C come suggerito nella Fase 2.14, devono essere affrontati con cura come questo può anche essere una fonte di formazione di bolle d'aria quando disciolto gas si muove dalla soluzione con il cambiamento in temperatura. Wgallina procedere alla Recellularization, la cura supplementare dovrebbe essere applicata, quando si prepara la siringa con la sospensione cellulare, al fine di garantire l'infusione bolla libero (Passo 6.4).
Può essere necessario per manipolare le specifiche di questo protocollo per accogliere altri tipi di tessuti. Ci sono una serie di protocolli decellularization riportato 4,9,11 che potrebbe fornire una guida. L'obiettivo finale (s) di qualsiasi protocollo decellularization dovrebbe comprendere il mantenimento della struttura delle proteine ECM e relativi biochimica e un'adeguata rimozione di componenti cellulari nativi come esemplificato da DNA residuo. In questa impostazione, l'applicazione di una eccessiva pressione di perfusione porta alla rottura della ultrastruttura ECM, che può essere visualizzato istologicamente.
La dimensione del cuore P3 del mouse pone alcuni vincoli all'amministrazione cellule rispetto al tessuto adulto. Mentre cuori adulti presentano una parete ventricolare abbastanza spessa che rende transmurale iniectiona consegna possibile cellula modalità, cuore P3 è abbastanza piccolo che un ago, le cui dimensioni non lisare una sospensione cellulare, fa danni rilevanti al cuore. Perfusione è una strategia consegna valida, ma dipende da cellule di una certa dimensione e la forma da consegnare efficacemente. Neonatali miociti murini funzionano bene in questo senso. Altre cellule circolari piccoli hanno anche dimostrato di servire a questo scopo 11. La scala di dimensioni di questi cuori preclude l'uso di analisi funzionale fisiologica convenzionale come ad esempio cateteri volumi pressione. Altri approcci basati sulla cattura video possono avere per essere considerato.
Questi dati supportano la fattibilità di decellularization e Recellularization del cuore neonatale mouse. Studi precedenti hanno dimostrato l'utilizzo di cuori adulti per motivi di studio decellularization / Recellularization. Le matrici prodotte da questi cuori adulti sono stati ripopolato con cardiomiociti neonatali 4 e umanacellule staminali pluripotenti indotte (hiPSCs) 17. Nel caso dei hiPSCs, i cuori ripopolati visualizzate una diminuzione marcatori pluripotenza come NANOG, SOX2 e OCT4 e strutture muscolari simili formate; tutto suggestiva di maturazione. I segnali extracellulari della ECM, tuttavia, hanno dimostrato di giocare un ruolo critico nello sviluppo di cellule, tessuti e organi che ci hanno spinto a tentare di generare matrici da tessuti noti per ospitare capacità rigenerativa. Nei nostri studi, abbiamo dimostrato che i cuori recellularized ancora esprimono marcatori cardiomiociti, anche dopo la cultura prolungato. Questi dati indicano che, utilizzando nuove matrici, cardiomiociti possono essere mantenuti per lunghi periodi di tempo senza perdere la loro identità di cardiomiociti. I nostri dati supportano la tecnica e la fattibilità per decellularizing cuore neonatale mouse. Le matrici neonatali tengono il potenziale per fornire nuovi costrutti per studi ripopolamento nonché per la produzione di gel che hanno superior capacità rigenerativa. L'utilizzo di questi ECM neonatali, ora stiamo affrontando la superiorità di questi ponteggi per formare tessuti funzionali con una varietà di tipi di cellule, tra cui hiPSCs.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Materials for mouse heart isolation | |||
| P1 mouse pups (as shown; B6;D2-Tg(Myh6*-mCherry)2Mik/J) | Jackson Laboratories | 21577 | or equivalent |
| 60 mm Culture dish | BD Falcon | 353004 | or equivalent |
| Phosphate buffered saline pH 7.4 (sterile) | Hyclone | SH30256.01 | or equivalent |
| Single Use Blade | Stanley | 28-510 | or equivalent |
| Standard Scissors | Moria Bonn (Fine Science Tools) | 14381-43 | or equivalent |
| Spring Scissors 10 cm | Fine Science Tools | 15024-10 | or equivalent |
| Vannas Spring Scissors - 3 mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15000-00 | or equivalent |
| #5 Forceps | Dumnot (Fine Science Tools) | 11295-00 | or equivalent |
| 2. Materials for decellularization | |||
| Inlet adaptor | Chemglass | CG-1013 | autoclavable |
| Septum | Chemglass | CG-3022-99 | autoclavable |
| 1/8 in. ID x 3/8 OD C-Flex tubing | Cole-Parmer | EW-06422-10 | autoclavable |
| Male luer to 1/8" hose barb adaptor | McMaster-Carr | 51525K33 | autoclavable |
| Female luer to 1/8" hose barb adaptor | McMaster-Carr | 51525K26 | autoclavable |
| Prolene 7-0 surgical suture | Ethicon | 8648G | or equivalent |
| Ring stand | Fisher Scientific | S47807 | or equivalent |
| Clamp | Fisher Scientific | 05-769-6Q | or equivalent |
| Clamp regular holder | Fisher Scientific | 05-754Q | or equivalent |
| 60 cc syringe barrel | Coviden | 1186000777T | or equivalent |
| Beaker | Kimble | 14000250 | or equivalent |
| 22 G x 1 Syringe Needle | BD | 305155 | or equivalent |
| 12 cc syringe | Coviden | 8881512878 | or equivalent |
| 3-way stop cock | Smith Medical | MX5311L | or equivalent |
| PE50 tubing | BD Clay Adams Intramedic | 427411 | Must be formable by heat. Polyethylene recommended. |
| 1% SDS | Invitrogen | 15525-017 | Ultrapure grade recommended. Make up fresh solution and filter sterilize before use. |
| 1% Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Make up fresh solution from a 10% stock and filter sterilize before use. |
| Sterile dH2O | Hyclone | SH30538.02 | Or MilliQ system purified water. |
| 1x Pen/Strep | Corning CellGro | 30-001-Cl | or equivalent |
| 3. Materials for DNA quantitation | |||
| Proteinase K | Fisher | BP1700 | >30 U/mg activity |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | or equivalent |
| MgCl2·6H2O | Mallinckrodt | 5958-04 | or equivalent |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | or equivalent |
| Tris base/hydrochloride | Sigma-Aldrich | T1503/T5941 | or equivalent |
| Pico-Green dsDNA assay kit | Life Technologies | P7589 | requires fluorimeter to read |
| 4. Method for fixation and sectioning of tissue | |||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | or equivalent |
| Gelatin Type A from porcine skin | Sigma-Aldrich | G2500 | must be 300 bloom or greater |
| 5. Method for tissue histology | |||
| Cryomolds 10 x 10 x 5 mm | Tissue-Tek | 4565 | or equivalent |
| Cryostat | Hacker/Bright | Model OTF | or equivalent |
| Microscope Slides 25 x 75 x 1 mm | Fisher Scientific | 12-550-19 | or equivalent |
| Hematoxylin 560 | Surgipath/Leica Selectech | 3801570 | or equivalent |
| Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | or equivalent |
| Define | Surgipath/Leica Selectech | 3803590 | or equivalent |
| Blue buffer | Surgipath/Leica Selectech | 3802915 | or equivalent |
| Alcoholic Eosin Y 515 | Surgipath/Leica Selectech | 3801615 | or equivalent |
| Formula 83 Xylene substitute | CBG Biotech | CH0104B | or equivalent |
| Permount Mounting Medium | Fisher Chemical | SP15-500 | or equivalent |
| Collagen IV Antibody | Rockland | 600-401-106.1 | or equivalent |
| α-Actinin Antibody | Abcam | AB9465 | or equivalent |
| mCherry Antibody | Abcam | AB205402 | or equivalent |
| NKX2.5 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-8697 | or equivalent |
| Donkey anti-mouse AF488 Antibody | Life Technology | A21202 | or equivalent |
| Donkey anti-chicken AF594 Antibody | Jackson Immunoresearch | 703-585-155 | or equivalent |
| Donkey anti-goat CY5 Antibody | Jackson Immunoresearch | 705-175-147 | or equivalent |
| Fab Fragment Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) AF594 | Jackson Immunoresearch | 111-587-003 | or equivalent |
| Prolong Gold Antifade Mountant with DAPI | ThermoFisher | P36930 | or equivalent |
| 6. Isolation of neonatal ventricular cardiomyocytes using pre-plating | |||
| HBSS (Ca, Mg Free) | Hyclone | SH30031.02 | or equivalent |
| HEPES (1 M) | Corning CellGro | 25-060-Cl | or equivalent |
| Cell Strainer | BD Falcon | 352340 | or equivalent |
| 50 ml tube | BD Falcon | 352070 | or equivalent |
| Primeria 100 mm plates | Corning | 353803 | Primeria surface enhances fibroblast attachment promoting a higher myocyte purity |
| Trypsin | Difco | 215240 | or equivalent |
| DNase II | Sigma-Aldrich | D8764 | or equivalent |
| DMEM (Delbecco's Minimal Essential Media) | Hyclone | SH30022.01 | or equivalent |
| Vitamin B12 | Sigma-Aldrich | V6629 | or equivalent |
| Fibronectin coated plates | BD Bioscience | 354501 | or equivalent |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30910.03 | or equivalent |
| Heart bioreactor glassware | Radnoti Glass Technology | 120101BEZ | Must be sterilizable by autoclaving or gas. |
References
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- Lu, T. Y., et al. Repopulation of decellularized mouse heart with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular progenitor cells. Nat Commun. 4 (2307), 1-11 (2013).
