Summary
これらの研究では、我々は、回生の研究で使用するための新規、新生児マウスの心臓足場のための方法論を提供します。
Introduction
心不全は一般的で致命的です。これは、臓器への血流を阻害し、身体満たされていないの代謝要求を残す心臓の収縮低下をもたらす進行性疾患です。 570万人のアメリカ人が心不全を有し、それは米国9における入院の主要な原因であると推定されます。米国における心不全の患者を治療するための集団的コストは年間9-10につき$ 300億ドルを超えました。末期の心不全のための唯一の決定的な治療法は、同所心臓移植です。毎年、10万人以上のドナーの心臓は、米国1-2で心臓移植の手続きのために必要とされていると推定されています。ドナーの限られた数に、わずか約2400移植は、米国2で毎年行われています。明らかに、この臓器不足は、他の戦略がtransplantaための付加的な臓器を産生するために必要とされるように対処する必要があります拒絶反応や生涯免疫抑制に関連する合併症を回避するようションとは、理想的には、これらの器官は、自己のだろう。
哺乳類の成体の心筋細胞は、損傷時に限られた再生能力を実証するが、最近の証拠は、哺乳動物の新生児の心がけが5-8以下の驚くべき再生能力を維持することを示唆しています。具体的には、部分的な外科的切除後、再生ウィンドウが誕生し、生後7日目、この回生期間は線維性瘢痕の欠如によって特徴づけられる、血管新生の形成、心外膜からの血管新生因子の放出、および心筋細胞の増殖5-8との間で発見されました、11。この時間の回生ウィンドウには、バイオ人工心臓の開発のための材料の新規供給源としての新生児の心臓を使用しての可能性を提供します。
細胞外マトリックスはcardiomyocytを促進する重要な手がかりを提供することが知られていますEの増殖と成長。新生児と成人の行列12および再生を促進する能力において分子の利用可能性の明確な違いは、13を検討されています。脱細胞化された成人のマトリックスは、細胞の再増殖およびバイオ人工心臓の発生のためのECMの足場を提供するために、いくつかの研究で使用されてきました。これらの研究、および幹細胞技術の新たな発見は、急速に進展しているが、いくつかのハードルが満たされていません。例えば、マトリックスの天然構造、マトリックス壁への細胞の統合、およびすべての制限このアプローチの成功増殖と成長をサポートする能力を維持するには限界。優れた再生属性は新生児心臓に帰されてきたが、そのような組織を使用して実用的な側面は、その探索を制限しています。
新生児の心臓の実証された再生能力に基づいて、我々は、開発することによって、新たな行列を開発しましたP3のマウスの心臓のための脱細胞化の手法。以前は6に決定するが、心臓が収穫、脱細胞化および再細胞化に十分な大きさであるとして、それは心臓再生のウィンドウ内にあるようP3の心はこれらの研究のために選択しました。本研究の目的は、新生児マウスの心臓から行列を作成することの実現可能性を実証することです。我々の研究は、ECMの構造とタンパク質性の整合性を維持しながら、分、新生児の心臓を脱細胞化の実現可能性のための証拠を提供します。また、mCherryを発現する心筋細胞でこの心臓ECMを再細胞化する能力を示す、我々は再細胞化後の種々の心臓マーカーの発現のために、これらの心筋細胞を検討しました。この技術は、バイオ人工心臓の開発のための新生児の行列の優位性のテストのためにできるようになります。
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Protocol
すべてのマウス実験は米国の動物福祉法に基づいて行われたミネソタ大学の施設内動物管理使用委員会によって承認されました。
マウスの心臓の単離のための1手法
- 単回使用の刃で断頭により新生児マウスを安楽死させます。
- 70％エタノールで胸部を綿棒。
- ＃5ピンセットで横方向に皮膚を引っ張りながら、標準的なはさみで胸壁から離れて切断することにより、胸部から肌を解剖。
- 腹壁を通して切断することによりハサミで胸骨のすぐ下の腹部を穿孔。はさみで胸の両側にリブかかわらず切断しながら、＃5鉗子で剣状突起をつかみ、身体から吻側胸骨を撤回。胸郭は、心臓を明らかにするためにピンセットで上方に反射されます。
- ぶっきらぼうにさらす、＃5鉗子で横方向に引っ張ることにより、胸腺の二つの主ローブを分析大動脈弓だけでなく、大静脈と肺静脈。
- 10cmの春のはさみで、大動脈弓、大動脈自体からの主要な動脈を横断。心のベースと腕頭動脈の間に大動脈を保持します。気管と食道からそれを分離し、前方の心を反映するために、＃5鉗子で切断された血管の端をつかみます。
- 10cmの春のはさみで心臓の両側に肺と心臓の間で切断することにより、肺血管系および他の主要な静脈を横断。静脈は排水を提供するために開いたままになります。
- 主要な血管の切断端を把持し、＃5鉗子で縦隔から心臓を取り出します。カテーテル挿入のための滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を含む60mm培養皿に心を置きます。
ランゲンドルフ灌流によって脱細胞化のため2.方法
- 事前にカテーテルアセンブリを準備します。 4センチメートルセクションを描きます小型化、薄型化カテーテルを作成するための小さなアルコールの炎におけるPE 50チューブの。寸法を満たすためにブレードを用いて両端をトリム（約約500μmの外径のフランジと300μmの外径OD）は、 図1に示す。これは、プルの各側面から2つの対称的なカテーテルを提供します。
- 薄い端の開口部にフランジを溶融するために、簡単に炎の中にチューブの切断端を指します。
- PBSで12ミリリットル注射器を記入し、注射器に3方活栓を配置することによって、カテーテルを組み立てます。コックに22 G×1針を追加し、隔壁を通して針を駆動します。針（ 図1）上に描かれたPEチューブカテーテルをスライドさせます。
- すべての気泡が除去されたことを保証する、PBSとの組立部品を洗浄。
- 7-0縫合糸の1タイで大動脈弁とライゲート過ぎて伸びるない、孤立した心臓の大動脈に、上記で概説したように調製し、カテーテルを挿入します。トンのフランジを休ま彼はタイトなシールを作り、カテーテルから外れるの心を防ぐ、タイに対して近位カテーテル。
- 優しくPBSを含む注射器を用いて心臓を灌流しながら、倍率の下でカテーテル法を守ってください。漏れがシステムに存在しないことを確認し、潜在血液が除去されるように組織が均一に白く。
- 入口アダプタの首に隔膜を配置し、ガラスの上側面を折り畳むことによってそれを封印。
- 図 20に示すようmmHgで圧力を発生させる列を生成するのに十分な長さのラインを介して蒸留水（のdH 2 O）中の1％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を60mlを充填したリザーバーを取り付けます。 1。1ミリメートル水銀の関係に基づいて、液柱の高さからの圧力を計算すると1.3595センチメートルのH 2 Oに等しいです。
注意：SDSは、刺激性の特性を有する非常に綿状粉末です。接触は避けるべきです。適切な防護服を使用した粉末を処理します。 - 14時間、1％SDSで心臓を灌流。心臓が観察されない残りの組織と外観に半透明になります。
- 残りのSDS溶液のコックにシステムをフラッシュし、10ミリリットルのdH 2 Oでそれを置き換えます1×ペニシリンストレプトマイシン（ペニシリン-ストレプトマイシン）を含有する60ミリリットルのPBS、続いて10ミリリットルのdH 2 Oに続いて（蒸留水で希釈した）10ミリリットル、1％トリトンX-100との心を、灌流します。
- 4℃で1×ペニシリン - ストレプトマイシンを含むPBS中で心を保管してください。意図された後の脱細胞化アプリケーションが灌流を必要とする場合は、大動脈内カテーテルは、そうでなければ、縫合ネクタイをカットし、カテーテルを取り外し、維持されるべきです。
3. DNAの決意
- 50のKCl、2.5mMのMgCl 2を、10 mMトリス（pHは8.3）で0.45％のTween 20中に200μg/ mlのプロテイナーゼKを使用して、脱細胞化ECMまたはコントロール心のダイジェストを準備します。
- 組織が溶解するまで、攪拌しながら55℃で組織をインキュベート通常、4-5時間。
- アッセイ4,11を結合DNAとホモジネートのDNA含有量を定量します。
4.固定および組織のセクショニング
- 室温で30分間、PBS中の4％パラホルムアルデヒド中で脱細胞化し、再細胞化または制御P3心を修正しました。
- PBS 3倍で組織を洗います。
- それが沈むまで4℃で0.1 Mリン酸緩衝液中の7.5％スクロースの溶液中で組織を置きます。
- それは沈むまで、再度、4℃で0.1 Mリン酸緩衝液中15％スクロース溶液を変更します。
- 37°Cに組織を加温し、15％スクロースおよび0.1Mリン酸緩衝液中のゼラチン溶液で容量の半分を交換し、一晩平衡化。ゼラチンの濃度は、1％、2.5％、5％を介して段階的に増加し、最終的に7.5％倍されます。
- 新鮮な7.5％のゼラチンを使用してcryomoldsでサンプルを置きます。脱細胞化サンプルの形状を復元するには、液体のゼラチンは、tとの室に灌流することができます彼の心臓は、成形されています。液体窒素でcryomoldsを浮遊させることによって凍結。 -80℃で保管してください。
- クライオスタットで切断し（厚さ10μm）のセクション。セクションの表面に近いスライドを持参し、セクションが原因で静電処理したスライド上の電荷を表面にナイフからオフに移動を観察。一晩スライドを乾燥させ、将来の分析のために-80℃で保存します。
- 冷凍庫からスライドを外し、室温に平衡化した後、ゼラチンを溶解させ、37℃で20分間、PBSを含むコプリンジャーに配置します。
- ヘマトキシリンおよびエオシンでステップ4.7から切断面を染色します。コプリンジャーにスライドを置きます。 1.5分間剤を青味、1分間水道水を、3分間バッファー、1.5分間水道水を、45秒間ヘマトキシリンにステップ4.8で水和スライドを公開し、80％エタノールで1分間、アルコールエオシンY 8秒間、 1分間の3×1分、1分2×100％エタノール、エージェントをクリアする（キシレン代替物）80％エタノール、樹脂とカバーガラスベースの取り付けメディア。顕微鏡でスライドを調べます。
- 加湿チャンバー内での水和スライドを配置することによって、このようなコラーゲンIVなどのECMの構造タンパク質のための心臓ECM、汚れのECMタンパク質の反応性の保持を確認し、0.1％トリトンを含むリン酸緩衝生理食塩水で10％正常ロバ血清（NDS）で処理するには室温（RT）で1時間-X100（PBST）。組織切片をカバーするのに十分な量を使用してください。
- 5％NDS / PBST中で経験的に決定された希釈での選択の一次抗体を含む溶液を交換してください。 150：例えば、コラーゲンIV抗体は1で希釈しました。 4℃で一晩インキュベートします。
- PBST 3倍でスライドを洗浄し、蛍光色素と結合した任意の二次抗体を適用します。経験的に決定された量によって抗体を希釈します。 RTで1時間インキュベートします。 PBS 3回洗浄します。
- mountiを含むDAPIを用いて細胞核が存在しないことを確認するために、例えば、DAPIなどのDNA結合色素とのスライドを染色カバースライドを滑る際にメディアをngの。
- 400Xの50での蛍光顕微鏡でスライドを調べます。
再細胞化のため5. P1新生児マウス心室心筋細胞
- 70％エタノールで各子犬をスプレーし、単回使用の刃で首を切ります。
- 胸郭が胸腔を露出するように、小さな滅菌ハサミで正中線で分割されている間、親指と人差し指の間の各子犬を保持します。それは、主要な血管および唯一の心室組織を残して心房の自由切断されながら心臓が胸から自由に突出することを可能にするために圧力を適用します。
- 20 mlの氷冷カルシウム、全ての心が収集されるまで、20mMの4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジンエタンスルホン酸（CBFHH）と重炭酸フリーハンクス緩衝生理食塩溶液を含む50mlチューブに直接心を置き。
- CBFHHを吸引し、チューブに新鮮なCBFHH（氷冷）10〜15ミリリットル追加。トンで組織を旋回することによって、組織を洗います彼はチューブを数回。
- 60ミリメートルのプラスチックペトリ皿に心を含む溶液をデカント。
- 春のはさみで心から離れてトリミングすることにより、氷上で倍率で心からの任意の潜在心房組織を解剖。均一なサイズの小さな断片に心室をみじん切りに。 ＃5ピンセットで皿からの分離された非心室組織を削除します。
- ピペットで滅菌マイクロ撹拌棒が含まれている小型の滅菌バイアル中に組織片を転送するために必要とされるようCBFHHソリューションの多くを。
- 組織がバイアルの底に沈殿し、CBFHH溶液を除去することができます。
- CBFHH中の酵素液1.75 mg / mlでトリプシン、20 / mlのDNアーゼIIの50ミリリットルを構成しています。ピペットで5この酵素溶液のmlおよび磁気撹拌機でミンチ心室組織と場所を含むチューブに追加します。 8分間室温で一定速度（340 rpm）で攪拌します。
注：攪拌作用が穏やかな、まだ許可する必要がありますスラリーの懸濁のため。 - 撹拌プレートからバイアルを取り外し、スラリーを3分間沈降することを可能にします。ピペットと、それは主に血液細胞および組織破片が含まれて、最初のダイジェスト上清を廃棄します。
- ピペット第5ミリリットルの酵素溶液のアリコートと消化心室に追加します。 8分間撹拌し、それが他の3分間沈降することを可能にします。ダイジェストを開始する前に、2 50mlチューブ（1を標識し、2）をそれぞれ含む12ミリリットルの氷冷ウシ胎児血清（FBS）を準備します。各チューブの上に40μmのセルストレーナーを配置します。ピペットでチューブ1上のフィルターを通してこの上清。
- FBSを含む2つのチューブの間ダイジェスト上清の配置を交互に、消化プロセスをさらに8回繰り返します。各チューブに等しい体積を確保するため、チューブ1と2の間で均等に最後の上清を分割します。
注：各コレクションチューブは現在、細胞懸濁液の32.5ミリリットル総容量が含まれています。 - 遠心管が含まれています4℃で6分間、上澄み150 XGをる。
- 消化アリコートを収集しながら、（10％FBS、1×ペニシリン - ストレプトマイシン、1×L-グルタミンを含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM））メディアの6ミリリットルで5 100ミリメートル組織培養プレートを準備プレート当たり。培地を平衡化するために30分間、37℃、5％CO 2で、これらのアリコートをインキュベートします。
- 両方のコレクションチューブからの細胞を組み合わせ、CBFHH酵素混合物を吸引し、上記で調製した培地を30mlに細胞を再懸濁。
- 100mMのプレートの各細胞懸濁液を6mlを戻し、37℃で45分間インキュベートします。
- インキュベーションの終わりに、5つの新しい皿に非接着細胞を転送し（線維芽細胞画分は、皿に付着し始めているであろうと、所望であれば別々に成長させることができる）45分間再度インキュベートします。
- めっき前の第二ラウンドの終了時に、皿から培地および非接着細胞を収集し、150で媒体を回転6分間XG。
- （灌流液100μlのコンストラクトあたり4.0×10 5細胞）を、おおよその所望の濃度に細胞をもたらすために余分なメディアをオフに描画します。計数およびまたは生存能力試験の14のためのアリコートを削除します。
P3ハートマトリックスの6バイオリアクター再細胞化
- 一晩細胞を添加する前に、培養培地（ステップ5.15参照）で単離された心臓マトリックスを前処理。
- 図に示すようにランゲンドルフシステムの要素を組み立てます。 2。ガラス部品とエチレンオキシドをオートクレーブ滅菌性を保証するために、プラスチック部品を滅菌します。システムの種々のサブユニットは、支持台上に載置される前に、層流フード内で組み立てることができます。循環水浴加熱水流路は、明確にするために省略されています。
- （ステップ5.15参照）を組織培養培地120mlで組み立てシステムを埋めます。
- 60ミリメートルのCULのステップ2.14からカテーテルを挿入し、心臓の行列を配置トゥーレ倍率下皿とカテーテルへのステップ5.20から細胞懸濁液をロード×1針22 Gで1 mlシリンジを接続します。このアセンブリは、心臓塞栓避けるために気泡がないことを確認してください。
- 穏やかに冠状動脈を介して心臓マトリックスに100μlの細胞懸濁液を灌流。完了すると、注射器/針の組み合わせを切り離します。
注：約の遅い灌流。毎分20μlのは、心臓を通過、静脈から流出するから細胞を防止するために必要とされます。 - バイオリアクター心臓瓶のふたの下側のルアーフィッティングに固定さ22グラム鈍いスタブと、スタブ上にカテーテルを押してください。
- 蠕動ポンプを起動し、 図2に概説されるように進むことを確認します。貯水池からの移行をステップ2.5で大動脈内に配置されたカテーテル（ 図2の赤いパス）に気泡トラップを介して、ポンプを介して。静脈から心臓循環の流れを観察します頂点からsおよびドリップ、メディアリザーバーに再循環。
注：灌流流量は、このような構築物の血管抵抗、および心臓の大きさのような個々の要因に依存するが、50μL/分〜100の割合は、良い出発点です。中間の時点で、機能的な評価を行うことができます。新生児の再細胞化心臓のサイズスケールを行うことができますが、我々は、光学ベースのシステムは、彼らが大人のラット心臓で使用されてきたと同じように行動を破って定量化するために使用することができることを決定した評価を、制限されています。4構築物は、拡張のために灌流することができます（23時間まで）期間。
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Representative Results
脱細胞化
平均して、このプロトコルを使用して、P3の心臓の脱細胞化までの時間は約14時間です。 P3の新生児用23mgの平均心重量与えられました。
Acellularity
図3aは、完全に無傷でP3新生児の心臓（全体のマウント）を示している。 図3bは、脱細胞化以下同じ心を示している。 図4aおよび図4bショー無傷で脱細胞化心臓のヘマトキシリンおよびエオシン染色を、それぞれ。ヘマトキシリン陽性核の不在と脱細胞化心臓における好酸球構造の減少に注意してください。また、脱細胞化心臓のDNA含有量を大幅に無傷の心臓（n = 6）が脱細胞化心臓における4.73±2.27μgのにで68.08±2.25μgのから減少した（n = 5）。
コラーゲン免疫反応性
脱細胞化以下の細胞外マトリックス（ECM）の維持は、外因性細胞とマトリックスの機能を再増殖することが不可欠です。無傷で脱細胞化ECMにおける新生児のECMのコンテンツを評価するために、コラーゲンIVための免疫染色を行った。 図4Cを、そのコラーゲンIVはロバスト両方無傷および脱細胞化心臓で発現し、このタンパク質の局在化が維持されることを実証しているdは DAPI陽性の核が効果的に除去しながら、細胞除去後（ 図4E-H）。
DNA量
DNAの存在は、細胞性のさらなる指標として使用されます。 図5において、DNAは、界面活性剤ベースの脱細胞化を以下の新生児の心の中で93％減少することが実証されています。 DNAの減少のこの程度は、と一致しています他の組織15-16で洗剤ベースの脱細胞化を使用して文献の報告。
再細胞化
我々は、再細胞化心臓内の様々な心筋細胞マーカーの発現を決定するために免疫組織化学を行った。 図6は 、左心室（ 図6Aおよび6B）の壁に移動した細胞を示している。 図6Cは、再細胞化心臓のDAPI標識を示している。 図6D-Gは、それぞれNKX 2.5、mCherryを、αアクチニンとDAPI、に対して陽性である細胞を示しています。 NKX2.5は、αアクチニンは、分化心筋細胞をマークサルコメア蛋白質であるのに対し、心臓前駆細胞を標識することが知られています。これらの細胞は心筋細胞マーカーのEVを発現し続けることを示す。（ 図6Hピンク）当社は、これらのマーカーの全てを発現する細胞の大部分を観察していますアン灌流の23日後。
脱細胞化のハードウェア。Aの図1の回路図 。洗剤溶液のための60ccのシリンジバレル槽。B。灌漑注射器などの詳細。Cとのカテーテルアセンブリ。描かれたPEチューブ、カテーテル先端の詳細。D。ドレインと脱細胞化室および隔壁。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2.心臓バイオリアクターの模式図。1。カルボゲンガスの加湿（緑の線は、ガス流を表します）。メディア灌流のため2.蠕動ポンプ駆動と酸素（紫色線は人工肺を介してメディアフローを表します）。 3.薄い壁の人工肺。 4.シート人工肺とメディア貯水池。 5.プリロード室と気泡トラップ。 6.ハート室（レッドラインは心臓へとからメディアフローを表す）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3. P3新生児マウスの心臓のホールマウント（A）の前及び脱細胞化（B）。この心臓を灌流（B）後の心臓が半透明になるという方法2注記に記載されているようにランゲンドルフ灌流法を用いて、脱細胞化し、わずかに拡大された後、 。スケール= 2ミリメートル。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
天然および脱細胞化P3新生児マウスの心臓の図4.組織学。クライオスタット部（10μm）をH＆E（A、B）、コラーゲンIV（C、D、G、H）およびDAPI（E、F、G、Hを用いて染色しました。 ）。天然の心臓（A）と比較した場合、マージされた画像はGで表され、H. H＆E染色は、脱細胞化組織（B）における細胞核と細胞質が存在しないことを示しています。コラーゲンIV含有量は、次の脱細胞化（D）、DAPI染色（核のマーカー）のまま廃止されています。マージされた画像は、ナイーブ心臓（G）におけるコラーゲンIVおよびDAPIの共局在化および脱細胞化心臓（H）で、この共局在が存在しないことを実証します。これらのデータは、細胞が無いことを示しています長い心のコラーゲンマトリックスを移入します。スケール= 500ミクロン。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
DNA量の図5の評価。コントロール（N = 6）および脱細胞化（n = 5）をピコグリーン法によりDNA含量についてアッセイした心臓。定量化は、標準偏差±心あたりμgのDNAとして表現しました。アスタリスクは、対照と比較してp <0.01を示しています。これらのデータは、脱細胞化がP3新生児の心に大幅にDNA含有量を減少させることを示す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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P3の心臓マトリックスの図6.組織学P1 mCherryを発現する心筋細胞で再細胞化。H＆Eで染色した（A、= 250ミクロンスケール、B、スケール= 50ミクロン）、DAPI（= 250μmのC、スケール）は、 次の23日間 、NKX 2.5、 mCherryを、αアクチニン、DAPI、およびマージ（D、E、F、G、H、スケール=50μM）。私たちは、P1の心筋細胞（AC）とコラーゲンマトリックスの効果的な再増殖を示しました。さらに、当社は、m桜陽性の心筋細胞がコラーゲンマトリックスへの導入以下のNkx2.5およびαアクチニン23日を発現することを観察しました。これらのデータは、これらの細胞は、長期間にわたってそれらの心筋細胞のアイデンティティを維持することを示している。 このFの拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。igure。
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Discussion
心の繰り返し灌流にこの技術の依存性は、塞栓症の回避成功した結果の重要な要素になります。ステップ2.2から2.6での心臓の初期カテーテル法からは、ステップ2.8から2.14の間の溶液の変化に、心筋に灌流液の流れを損なう気泡の導入を可能にすることができる操作があります。新生児心臓の小柄なサイズに、血管系であっても微小な気泡は、このように不完全な脱細胞化をレンダリング、技術的な梗塞を引き起こす可能性があります。さらに、後の洗浄工程において、不完全な灌流は、洗剤残留物に悪影響を与える生体適合性をもたらすことができます。これはまた、気泡形成の源とすることができるように変更して溶液からガス移動を溶解したときさらに、このようなステップ2.14において示唆されるように4℃の貯蔵からマトリックスを除去するときのように急激な温度変化は、注意して接近されるべきです温度インチW再細胞化に鶏進む細胞懸濁液を注射器を準備する際、追加のケアは、注入が無気泡（ステップ6.4）であることを確認するために、適用されるべきです。
他の組織タイプに対応するために、このプロトコルの詳細を操作する必要があるかもしれません。ガイダンスを提供することができ4,9,11を報告した脱細胞化プロトコルの数があります。残存DNAにより例示されるように任意の脱細胞化プロトコルの最終目標（複数可）は、ECMタンパク質の構造の維持および関連生化学、およびネイティブの細胞成分を十分に除去することを含むべきです。この設定では、過度の灌流圧の適用は、組織学的に可視化することができるECMの微細構造の破壊をもたらします。
P3マウスの心臓の大きさは、成人組織と比較して細胞投与にいくつかの制約を置きます。大人の心は貫充血を作る厚い十分な心室壁を提示しながら、ナ可能な細胞送達様式は、P3の心臓は、細胞懸濁液を溶解しませんその大きさの針は、心臓にかなりのダメージを与えることは十分に小さいです。灌流は、実行可能なデリバリー戦略ですが、効果的に配信されるように一定の大きさと形状の細胞に依存します。新生児マウスの筋細胞は、この点でうまく機能します。他の小円形細胞も、この目的11を提供するために示されています。これらの心のサイズスケールは、このような圧力ボリュームカテーテルなどの従来の生理学的機能分析の使用を排除します。ビデオキャプチャに基づく他のアプローチを考慮しなければならないことがあります。
これらのデータは、新生児マウスの心臓の脱細胞化および再細胞化の実現可能性をサポートしています。以前の研究では、脱細胞化/再細胞化の研究を目的とした大人の心を使用することを実証しました。これらの大人の心から生産行列は、新生児心筋4と人間との再増殖されてきました人工多能性幹細胞（hiPSCs）17。 hiPSCsの場合には、再増殖した心臓は、NANOG、SOX2、およびOCT4および形成された筋状の構造などの多能性マーカーの減少を表示しました。成熟のすべての示唆に富みます。 ECMの細胞外の合図は、しかしながら、再生能力を保有することが知られている組織からの行列を生成しようとするために、私たちを促し、細胞、組織、および器官の発達に重要な役割を果たすことが示されています。我々の研究では、我々は再細胞化心臓はまだであっても長期培養した後、心筋細胞マーカーを発現することを示しています。これらのデータは、新規の行列を用いて、心筋細胞は心筋細胞としてのアイデンティティを失うことなく長期間維持することができる、ことを示しています。我々のデータは、新生児マウスの心臓を脱細胞化するための技術と可能性をサポートしています。新生児の行列が再増殖研究のためだけでなく、SUPを持つゲルの製造のための新規構築物を提供するための可能性を秘めてerior再生能力。これらの新生児のECMを使用して、我々は今hiPSCs含む細胞型の様々な機能的組織を形成するために、これらの足場の優位性に対処しています。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Materials for mouse heart isolation | |||
| P1 mouse pups (as shown; B6;D2-Tg(Myh6*-mCherry)2Mik/J) | Jackson Laboratories | 21577 | or equivalent |
| 60 mm Culture dish | BD Falcon | 353004 | or equivalent |
| Phosphate buffered saline pH 7.4 (sterile) | Hyclone | SH30256.01 | or equivalent |
| Single Use Blade | Stanley | 28-510 | or equivalent |
| Standard Scissors | Moria Bonn (Fine Science Tools) | 14381-43 | or equivalent |
| Spring Scissors 10 cm | Fine Science Tools | 15024-10 | or equivalent |
| Vannas Spring Scissors - 3 mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15000-00 | or equivalent |
| #5 Forceps | Dumnot (Fine Science Tools) | 11295-00 | or equivalent |
| 2. Materials for decellularization | |||
| Inlet adaptor | Chemglass | CG-1013 | autoclavable |
| Septum | Chemglass | CG-3022-99 | autoclavable |
| 1/8 in. ID x 3/8 OD C-Flex tubing | Cole-Parmer | EW-06422-10 | autoclavable |
| Male luer to 1/8" hose barb adaptor | McMaster-Carr | 51525K33 | autoclavable |
| Female luer to 1/8" hose barb adaptor | McMaster-Carr | 51525K26 | autoclavable |
| Prolene 7-0 surgical suture | Ethicon | 8648G | or equivalent |
| Ring stand | Fisher Scientific | S47807 | or equivalent |
| Clamp | Fisher Scientific | 05-769-6Q | or equivalent |
| Clamp regular holder | Fisher Scientific | 05-754Q | or equivalent |
| 60 cc syringe barrel | Coviden | 1186000777T | or equivalent |
| Beaker | Kimble | 14000250 | or equivalent |
| 22 G x 1 Syringe Needle | BD | 305155 | or equivalent |
| 12 cc syringe | Coviden | 8881512878 | or equivalent |
| 3-way stop cock | Smith Medical | MX5311L | or equivalent |
| PE50 tubing | BD Clay Adams Intramedic | 427411 | Must be formable by heat. Polyethylene recommended. |
| 1% SDS | Invitrogen | 15525-017 | Ultrapure grade recommended. Make up fresh solution and filter sterilize before use. |
| 1% Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Make up fresh solution from a 10% stock and filter sterilize before use. |
| Sterile dH2O | Hyclone | SH30538.02 | Or MilliQ system purified water. |
| 1x Pen/Strep | Corning CellGro | 30-001-Cl | or equivalent |
| 3. Materials for DNA quantitation | |||
| Proteinase K | Fisher | BP1700 | >30 U/mg activity |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | or equivalent |
| MgCl2·6H2O | Mallinckrodt | 5958-04 | or equivalent |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | or equivalent |
| Tris base/hydrochloride | Sigma-Aldrich | T1503/T5941 | or equivalent |
| Pico-Green dsDNA assay kit | Life Technologies | P7589 | requires fluorimeter to read |
| 4. Method for fixation and sectioning of tissue | |||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | or equivalent |
| Gelatin Type A from porcine skin | Sigma-Aldrich | G2500 | must be 300 bloom or greater |
| 5. Method for tissue histology | |||
| Cryomolds 10 x 10 x 5 mm | Tissue-Tek | 4565 | or equivalent |
| Cryostat | Hacker/Bright | Model OTF | or equivalent |
| Microscope Slides 25 x 75 x 1 mm | Fisher Scientific | 12-550-19 | or equivalent |
| Hematoxylin 560 | Surgipath/Leica Selectech | 3801570 | or equivalent |
| Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | or equivalent |
| Define | Surgipath/Leica Selectech | 3803590 | or equivalent |
| Blue buffer | Surgipath/Leica Selectech | 3802915 | or equivalent |
| Alcoholic Eosin Y 515 | Surgipath/Leica Selectech | 3801615 | or equivalent |
| Formula 83 Xylene substitute | CBG Biotech | CH0104B | or equivalent |
| Permount Mounting Medium | Fisher Chemical | SP15-500 | or equivalent |
| Collagen IV Antibody | Rockland | 600-401-106.1 | or equivalent |
| α-Actinin Antibody | Abcam | AB9465 | or equivalent |
| mCherry Antibody | Abcam | AB205402 | or equivalent |
| NKX2.5 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-8697 | or equivalent |
| Donkey anti-mouse AF488 Antibody | Life Technology | A21202 | or equivalent |
| Donkey anti-chicken AF594 Antibody | Jackson Immunoresearch | 703-585-155 | or equivalent |
| Donkey anti-goat CY5 Antibody | Jackson Immunoresearch | 705-175-147 | or equivalent |
| Fab Fragment Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) AF594 | Jackson Immunoresearch | 111-587-003 | or equivalent |
| Prolong Gold Antifade Mountant with DAPI | ThermoFisher | P36930 | or equivalent |
| 6. Isolation of neonatal ventricular cardiomyocytes using pre-plating | |||
| HBSS (Ca, Mg Free) | Hyclone | SH30031.02 | or equivalent |
| HEPES (1 M) | Corning CellGro | 25-060-Cl | or equivalent |
| Cell Strainer | BD Falcon | 352340 | or equivalent |
| 50 ml tube | BD Falcon | 352070 | or equivalent |
| Primeria 100 mm plates | Corning | 353803 | Primeria surface enhances fibroblast attachment promoting a higher myocyte purity |
| Trypsin | Difco | 215240 | or equivalent |
| DNase II | Sigma-Aldrich | D8764 | or equivalent |
| DMEM (Delbecco's Minimal Essential Media) | Hyclone | SH30022.01 | or equivalent |
| Vitamin B12 | Sigma-Aldrich | V6629 | or equivalent |
| Fibronectin coated plates | BD Bioscience | 354501 | or equivalent |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30910.03 | or equivalent |
| Heart bioreactor glassware | Radnoti Glass Technology | 120101BEZ | Must be sterilizable by autoclaving or gas. |
References
- Yusen, R. D., et al. Registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: Thirty-second official adult lung and heart-lung transplantation report--2015. J Heart Lung Transplant. 34 (10), 1264-1277 (2015).
- Go, A. S., et al. Heart disease and stroke statistics--2014 update: A report from the american heart association. Circulation. 129 (3), e28-e292 (2014).
- Kapelios, C. J., Nanas, J. N., Malliaras, K. Allogeneic cardiosphere-derived cells for myocardial regeneration: current progress and recent results. Future Cardiol. 12 (1), 87-100 (2016).
- Ott, H. C., et al. Perfusion decellularized matrix: Using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat Med. 14 (2), 213-221 (2008).
- Porrello, E. R., Olson, E. O. A neonatal blueprint for cardiac regeneration. Stem Cell Research. 13 (3 Pt B), 556-570 (2014).
- Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).
- Polizzotti, B. D., et al. Neuregulin stimulation of cardiomyocyte regeneration in mice and human myocardium reveals a therapeutic window. Sci Transl Med. 7 (281), 281ra45 (2015).
- Jesty, S. A., et al. c-kit+ precursors support postinfarction myogenesis in the neonatal, but not adult, heart. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (33), 13380-13385 (2012).
- Ambrosy, A. P., et al. The Global Health and Economic Burden of Hospitalizations for Heart Failure: Lessons Learned From Hospitalized Heart Failure Registries. J Am Coll Cardiol. 63 (12), 1123-1133 (2014).
- Roger, V. L., et al. Executive Summary: Heart Disease and Stroke Statistics-2012 Update A Report From the American Heart Association. Circulation. 125 (22), 188-197 (2012).
- Kennedy-Lydon, T., Rosenthal, N. Cardiac regeneration: epicardial mediated repair. Proc R Soc B. 282 (1821), 2147-2172 (2015).
- Williams, C., Sullivan, K., Black, L. D. Partially Digested Adult Cardiac Extracellular Matrix Promotes Cardiomyocyte Proliferation In Vitro. Adv Healthcare Mat. 4 (10), 1545-1554 (2015).
- Borg, T. K., et al. Recognition of extracellular matrix components by neonatal and adult cardiac myocytes. Dev Biol. 104 (1), 86-96 (1984).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immnol. 111, A3-B1-3 (2015).
- Gilbert, T. W., Freund, J. M., Badylak, S. F. Quantification of DNA in biologic scaffold materials. J Surg Res. 152 (1), 135-139 (2009).
- Akhyari, P., et al. The quest for an optimized protocol for whole-heart decellularization: a comparison of three popular and a novel decellularization technique and their diverse effects on crucial extracellular matrix qualities. Tissue Eng Part C Methods. 17 (9), 915-926 (2011).
- Lu, T. Y., et al. Repopulation of decellularized mouse heart with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular progenitor cells. Nat Commun. 4 (2307), 1-11 (2013).
