Summary
I dessa studier ger vi metodik för nya, neonatala, murina hjärt ställningar för användning i regenerativa studier.
Introduction
Hjärtsvikt är vanligt och dödliga. Det är en progressiv sjukdom som resulterar i minskad kontraktilitet av hjärtat, vilket försämrar blodflödet till organ och lämnar de metaboliska kraven från kroppens otillfredsställda. Det uppskattas att 5,7 miljoner amerikaner har hjärtsvikt och det är den främsta orsaken till sjukhusvistelse i USA 9. Den sammantagna kostnaden för behandling av patienter i hjärtsvikt i USA överstiger $ 300 miljarder dollar per år 9-10. Den enda definitiva terapi för slutstadiet av hjärtsvikt är orthotopic hjärttransplantation. Varje år uppskattas det att mer än 100.000 givar hjärtan behövs för hjärttransplantationsförfaranden i USA 1-2. På grund av de begränsade antalet donatorer är endast cirka 2400 transplantationer utförs varje år i USA två. Uppenbarligen måste denna organbristen åtgärdas som andra strategier krävs för att producera ytterligare organ för transplantation och helst skulle dessa organ vara autologa för att undvika de komplikationer som är förknippade med avstötning och livstids immunsuppression.
Däggdjur vuxna cardiomyocytes visa en begränsad förnyelseförmåga vid skada men nyligen tyder på att däggdjur neonatala hjärtan upprätthålla en anmärkningsvärd förnyelseförmåga efter skada 5-8. Speciellt efter partiell kirurgisk resektion, en regenerativ fönster har upptäckts mellan födelse och postnatal dag 7. Denna regenerativa period kännetecknas av en brist på fibrotisk ärr, bildandet av kärlnybildning, frigörande av angiogena faktorer från epikardium och cardiomyocyte spridning 5-8 , 11. Denna regenerativa tidsfönster ger möjlighet till användning av den neonatala hjärt som en ny källa av material för utveckling av en bioartificiell hjärta.
Den extracellulära matrisen är känd för att ge viktiga ledtrådar för att främja cardiomyocyte spridning och tillväxt. Tydliga skillnader i tillgången på molekyler i neonatala och vuxna matriser 12 och deras förmåga att främja regenerering har undersökts 13. Decellulariserade vuxna matriser har använts i flera studier för att tillhandahålla en ECM byggnadsställning för cellulär rekolonisering och genereringen av en bioartificiell hjärta. Även om dessa studier, och nya upptäckter inom stamcellsteknik, avancerar snabbt, flera hinder har ännu inte uppfyllt. Till exempel begränsningar i att bevara nativa strukturen av matrisen, cellulära integration i matrisen väggen, och förmåga att stödja spridning och tillväxt all gräns framgången med detta tillvägagångssätt. Medan överlägsna regenerativa egenskaper har tillskrivits den neonatala hjärtan, har de praktiska aspekterna av att använda en sådan vävnad begränsat sin utforskning.
Baserat på den demonstrerade regenerativ kapacitet neonatal hjärta, har vi utvecklat nya matriser genom att utveckla entekniken med decellularisering för P3 mus hjärta. P3 hjärta valdes för dessa studier eftersom det är inom fönstret hjärt förnyelse som tidigare bestämts 6 men hjärtat är tillräckligt stor för att skörda, decellularize och recellularize. Målet med denna studie är att visa att det är möjligt att skapa en matris från en neonatal mus hjärta. Våra studier visar att möjligheten att decellularizing en minut, neonatal hjärta samtidigt som strukturella och proteinhaltigt integritet ECM. Vi visar också förmågan att recellularize denna hjärt ECM med mCherry uttrycker cardiomyocytes och vi har undersökt dessa kardiomyocyter för uttryck av olika hjärtmarkörer efter recellularization. Denna teknik gör det möjligt för testning av överlägsenhet en neonatal matris för utvecklingen av en bioartificiell hjärta.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla mus experiment utfördes i enlighet med US djurskyddslagen och har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén vid University of Minnesota.
1. Metod för Mouse Heart Isolering
- Avliva en neonatal mus genom dekapitering med en enda användning blad.
- Tvätta bröstkorgen med 70% etanol.
- Dissekera huden från bröstkorgen genom att skära bort från bröstkorgen med standard sax samtidigt som du drar huden sidled med ett par # 5 pincett.
- Perforera buken bara underlägsen sternum med sax genom att skära genom bukväggen. Greppa xiphoid processen med # 5 pincett, dra bröstbenet rostrally från kroppen och samtidigt minska även revbenen på vardera sidan av bröstkorgen med sax. Bröstkorgen återspeglas superiorly med pincett för att avslöja hjärtat.
- Rakt på sak dissekera de två huvud lober bräss genom att dra i sidled med # 5 pincett, utsättabågen av aorta, liksom cava och lungvenerna.
- Transekt de stora artärerna från aortabågen och aorta själv, med 10 cm våren sax. Behålla aortan mellan basen på hjärtat och brachiocephalic artären. Ta tag i ändarna av de kapade fartyg med # 5 pincett för att återspegla hjärtat framåt, separera den från luftstrupen och matstrupen.
- Transekt pulmonella vaskulaturen och andra stora vener, genom att skära mellan lungorna och hjärtat på båda sidor av hjärtat med 10 cm våren sax. Venerna förblir öppna för att ge dränering.
- Ta hjärtat från mediastinum med # 5 pincett, gripa de avhuggna ändarna av de stora fartyg. Placera hjärtat i en 60 mm odlingsskål innehållande steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS) för kateterisering.
2. Metod för decellularisering av Langendorff Perfusion
- Förbered kateterenheten i förväg. Rita en 4 cm sektionPE 50 slang i en liten alkohol flamma för att skapa en mindre, tunnare kateter. Trimma ändarna med ett blad för att möta de mått (Ung. 300 ^ m OD ytterdiameter med en fläns på ca. 500 ^ m OD) som visas i figur 1. Detta kommer att ge två symmetriska katetrar från vardera sidan av den pådragbara.
- Peka den skurna änden av slangen i lågan kort, för att smälta en fläns på öppningen vid den tunna änden.
- Fylla 12 ml spruta med PBS och montera katetern genom att placera en 3-vägs avstängningskran på sprutan. Lägg till en 22 G x 1 st till kranen och driva nålen genom skiljeväggen. Skjut dras PE slangen kateter på nålen (Fig. 1).
- Skölj de hopsatta delarna med PBS, som garanterar att alla luftbubblor har tagits bort.
- Föra in katetern, framställd som beskrivs ovan, i aorta hos det isolerade hjärtat, inte sträcker sig förbi aortaklaffen och ligera med en tie av 7-0 sutur. Vila flänsen på than kateter proximalt mot slips, gör en tät förslutning och förhindra hjärtat från att komma ut katetern.
- Observera kateterisering under förstoring, medan försiktigt perfusion av hjärtat med hjälp av sprutan som innehåller PBS. Se till att det inte finns några läckor i systemet och vävnaden homogent blanches som latent blod tas bort.
- Placera septumet in i halsen av adaptern inloppet och försegla den genom att vika sidorna över glaset.
- Fästa reservoaren fylldes med 60 ml 1% natriumdodecylsulfat (SDS) i destillerat vatten (dH 2 O) via en ledning av tillräcklig längd för att producera en kolonn som genererar 20 mm Hg tryck, såsom visas i Fig. 1. Beräkna trycket från vätskekolonnhöjd baserat på förhållandet av 1 mm Hg är lika med 1,3595 cm H 2 O.
Varning: SDS är en mycket flockig pulver med irriterande egenskaper. Kontakta bör undvikas. Hantera pulvret med hjälp av lämpliga skyddskläder. - BEGJUTA hjärtat med en% SDS under 14 h. Hjärtat kommer att genomskinliga i utseende utan någon observerbar återstående vävnaden.
- Spola systemet upp till kranen av återstående SDS-lösningen och ersätta den med 10 ml dH2O BEGJUTA hjärtat med 10 ml 1% Triton X-100 (utspädd i destillerat vatten), följt av 10 ml dH 2 O, följt av 60 ml PBS innehållande 1x penicillin streptomycin (Pen-Strep).
- Lagra hjärtat i PBS med 1 x Pen-Strep vid 4 ° C. Om den avsedda efter decellularisering applikationen kräver perfusion då bör bibehållas katetern i aorta, annars skär sutur slips och ta bort katetern.
3. DNA Bestämning
- Förbereda ett sammandrag av den decellulariserade ECM eller kontroll hjärta med användning av 200 ^ g / ml proteinas K i 50 mM KCl, 2,5 mM MgCl2, 0,45% Tween 20 i 10 mM Tris (pH 8,3).
- Inkubera vävnaden vid 55 ° C under omröring tills vävnaden är upplöst,typiskt 4-5 h.
- Kvantifiera DNA-innehållet av homogenatet med en DNA-bindningsanalys 4,11.
4. Fixering och Sektionering av Tissue
- Fix decellulariserade, recellularized eller kontroll P3 hjärtan i 4% paraformaldehyd i PBS under 30 min vid rumstemperatur.
- Tvätta vävnaden i PBS 3x.
- Placera vävnaden i en lösning av 7,5% sackaros i 0,1 M fosfatbuffert vid 4 ° C tills den sjunker.
- Ändra lösningen till 15% sackaros i 0,1 M fosfatbuffert vid 4 ° C, återigen, tills den sjunker.
- Värm vävnaden till 37 ° C, ersätta hälften av volymen med gelatinlösningen i 15% sackaros och 0,1 M fosfatbuffert och jämvikt över natten. Koncentrationer av gelatin ökas stegvis genom ett%, 2,5%, 5% och slutligen 7,5% två gånger.
- Placera proverna i cryomolds med färska 7,5% gelatin. För att återställa formen hos de decellulariserade prover, kan flytande gelatin perfuseras in i kamrarna som than hjärtan formas. Frysa genom flyta cryomolds på flytande kväve. Förvara vid -80 ° C.
- Klipp (10 ^ m tjock) sektioner med en kryostat. Föra sliden nära snittytan och observera avsnittet rulla iväg från kniven på ytan på grund av laddningen på elektrostatiskt behandlade objektglasen. Torka glasen över natten och förvara vid -80 ° C för framtida analys.
- Ta bort objektglasen från frysen, jämvikt vid rumstemperatur och därefter i ett Coplin-kärl innehållande PBS under 20 min vid 37 ° C för att lösa gelatinet.
- Färga skurna sektionerna från steg 4,7 med Hematoxylin och Eosin. Placera objektglasen i ett Coplin-kärl. Exponera glasen hydratiserade i Steg 4,8 till Hematoxylin under 45 sekunder, kranvatten under 1,5 min, buffert under 3 min, kranvatten under 1 min, blåelse agent för 1,5 min, 80% etanol under 1 minut, alkoholhaltiga Eosin Y för 8 sek, 80% etanol under 1 min, 100% etanol under 1 min 2x, clearing agent (xylensubstitut) under 1 min 3x, täckglas med hartsbaserat monteringsmedel. Undersök bilderna mikroskop.
- För att bekräfta bibehållande av ECM-protein reaktiviteten hos hjärtat ECM, bets för ECM strukturella proteiner såsom kollagen IV genom att placera de hydratiserade glasen i en fuktig kammare och behandla med 10% normalt donkey serum (NDS) i fosfatbuffrad saltlösning med 0,1% Triton -X100 (PBST) under 1 timme vid rumstemperatur (RT). Använda en tillräcklig volym för att täcka vävnadssnitt.
- Ersätt lösningen med den primära antikroppen av val vid en empiriskt bestämd utspädning i 5% NDS / PBST. Till exempel, var den Collagen IV antikropp utspädd till 1: 150. Inkubera över natten vid 4 ° C.
- Tvätta bilderna med PBST 3x och applicera en sekundär antikropp av val konjugerad med ett fluorescerande färgämne. Späd antikroppen genom en empiriskt bestämd mängd. Inkubera under 1 h vid RT. Tvätta med PBS 3x.
- Färga objektglasen med en DNA-bindande färgämne, såsom DAPI för att kontrollera frånvaron av cellkärnor genom användning av en DAPI innehållande mounting mediet när locket glider bilderna.
- Undersök bilderna med ett fluorescerande mikroskop vid 50 till 400X.
5. P1 Neonatal Murine Ventrikulär Cardiomyocytes för Recellularization
- Spraya varje pup med 70% etanol och halshugga med en enda användning blad.
- Håll varje pup mellan tummen och pekfingret medan bröstkorgen är delad vid mittlinjen med små steril sax för att exponera brösthålan. Utöva påtryckningar för att tillåta hjärtat att skjuta fritt från bröstet medan den skärs fri från stora fartyg och förmaken vilket innebär att endast den ventrikulära vävnad.
- Placera varje hjärta direkt i en 50 ml rör innehållande 20 ml iskall Kalcium, Bikarbonat fri Hanks buffrade koksaltlösning med 20 mM 4- (2-hydroxietyl) -1-piperazinetansulfonsyra (CBFHH) tills alla hjärtan uppsamlas.
- Aspirera CBFHH och tillsätt 10-15 ml färsk CBFHH (iskall) till röret. Tvätta vävnaden genom att snurra vävnaden i than rör flera gånger.
- Dekantera lösningen innehållande hjärtan in i en 60 mm plastpetriskål.
- Dissekera någon latent förmaksvävnad från hjärtan under förstoring på is genom att klippa bort från hjärtan med våren sax. Finhacka upp kamrarna i homogent stora små bitar. Ta bort eventuella separerade icke-ventrikulära vävnad från skålen med # 5 pincett.
- Pipettera så mycket av CBFHH lösning som behövs för att överföra de vävnadsfragment in i en liten steril flaska som innehåller en steril mikro omrörarstav.
- Göra det möjligt för vävnaden att sedimentera till botten av flaskan och avlägsna CBFHH lösningen.
- Fyll upp 50 ml av en enzymlösning 1,75 mg / ml trypsin, 20 pg / ml DNas II i CBFHH. Pipett 5 ml av denna enzymlösning och lägga det till ett rör innehållande malet kammarvävnad och placera på en magnetomrörare. Rör om vid en konstant hastighet (340 rpm) vid rumstemperatur under 8 min.
OBS! Omrörning åtgärder bör vara mild och ändå tillåtaför upphängning av slammet. - Ta bort flaskan från omrörningsplatta och låta slammet sedimentera under 3 min. Pipett och kassera den initiala smälta supernatanten, eftersom den innehåller i huvudsak blodceller och vävnadsrester.
- Pipett en andra 5 ml alikvot av enzymlösningen och lägg till den smälta ventrikeln. Rör om under 8 min och låta den sedimentera under ytterligare 3 min. Före starten digereringarna, förbereda två 50 ml rör (märkta 1 och 2) var och en innehållande 12 ml iskall fetalt bovint serum (FBS). Placera en 40 ìm cell sil ovanpå varje rör. Pipet denna supernatant genom filtret på röret 1.
- Upprepa rötningsprocessen ytterligare 8 gånger, omväxlande placeringen av uppslutningsvätskan mellan de två rör innehållande FBS. Split sista vätskan lika mellan rören 1 och 2 för att säkerställa lika stora volymer i varje rör.
OBS: Varje provröret kommer nu att innehålla 32,5 ml totala volymen av cellsuspension. - Centrifugera rören innehållering supernatanten 150 xg under 6 min vid 4 ° C.
- Samtidigt samla in den uppslutnings alikvoter, förbereda fem 100 mm vävnadsodlingsplattor med 6 ml media (Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) med 10% FBS, 1 x Pen-Strep, 1x L-glutamin) per platta. Inkubera dessa alikvoter vid 37 ° C, 5% CO2 under 30 min för att jämvikta media.
- Aspirera CBFHH enzymblandningen och återsuspendera cellerna i den 30 ml av odlingsmedia som framställts ovan, som kombinerar de cellerna från båda uppsamlingsrören.
- Återvända 6 ml cellsuspension till var och en av mm plattor 100 och inkubera i 45 min vid 37 ° C.
- Vid slutet av inkubationen, överför de icke-vidhäftande cellerna till 5 nya rätter och åter inkubera under 45 min (fibroblast fraktionen kommer att ha börjat att hålla sig till disken och kan odlas ut separat om så önskas).
- Vid slutet av den andra omgången av pre-plätering, samla in media och icke vidhäftande celler från skålarna och snurra medierna vid 150xg under 6 min.
- Sug ut överflödigt material för att bringa cellerna till den ungefärliga önskade koncentrationen, (4,0 x 10 5 celler per konstrukt i 100 ^ perfusat). Ta en portion för räkning och eller livskraft test 14.
6. Bioreaktor Recellularization av P3 Heart Matrix
- Förbehandla isolerade hjärta matris med odlingsmedium (se steg 5,15) över natten innan du lägger till celler.
- Montera elementen i en Langendorff systemet som visas i fig. 2. Autoklavera glasdelar och etylenoxid sterilisera plastdelar för att säkerställa sterilitet. Olika underenheterna i systemet kan monteras i en huv med laminärt flöde innan de monteras på stödstativet. Cirkulerande vattenbad och upphettades vattenflödesvägen har utelämnats för tydlighets skull.
- Fyll det monterade systemet med 120 ml vävnadsodlingsmedium (se steg 5,15).
- Placera kateter hjärtat matrisen från steg 2,14 i en 60 mm culTure skålen under förstoring och anslut en 1 ml spruta med 22 G x 1 nål laddad med cellsuspensionen från steg 5,20 till katetern. Se till att denna sammansättning är fri från luftbubblor att undvika embolizing hjärtat.
- BEGJUTA försiktigt 100 pl cellsuspension in i hjärtat matrisen via kranskärlen. När du är klar, ta bort sprutan / nål kombination.
OBS: En långsam perfusion av ca. 20 | il per min krävs för att förhindra cellerna från att strömma ut ur venerna, transiterar hjärtat. - Med en 22 g trubbig stub fäst vid luerkoppling på undersidan av burken locket bioreaktorn hjärta, tryck på katetern på stöta.
- Starta den peristaltiska pumpen och observera att de fortsätter flödet som beskrivs översiktligt i fig 2. Fortsätter flödet från reservoaren via pumpen genom bubbelfällan till katetern placeras i aorta i Steg 2,5 (röd bana i Fig. 2). Observera flödet av hjärtcirkulationen ur venens och droppa från toppen, recirkulerande till media behållaren.
OBS: perfusion Flödeshastigheten är beroende av enskilda faktorer, såsom den vaskulära motståndet av konstruktionen, och storleken av hjärtat, men en hastighet av 50 till 100 | j, l / min är en bra startpunkt. Vid mellanliggande tidpunkter, kan funktionella bedömningar utföras. Storlekstabellen på neonatal recellularized hjärta begränsar bedömningar som kan utföras, men vi har bestämt att optiskt baserade system kan användas för att kvantifiera slå beteende precis som de har använts i vuxen råtthjärtan. 4 Konstruktionen kan perfusion för längre tidsperioder (upp till 23 timmar).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
decellularisering
I genomsnitt, tid att decellularisering av en P3 hjärtat med hjälp av detta protokoll är cirka 14 timmar. ges en genomsnittlig hjärtvikt av 23 mg för P3 nyfödda barnet.
acellularitet
Figur 3a visar en helt intakt P3 neonatal heart (hela montera). Figur 3b visar samma hjärtat efter decellulariseringen. Figurerna 4a och 4b visar hematoxylin och eosin-färgning av intakta och decellulariserade hjärtan, respektive. Notera avsaknaden av hematoxylin positiva kärnor och minskning av eosinofila strukturer i den decellulariserade hjärtat. Dessutom är DNA-innehållet i den decellulariserade hjärtat signifikant reducerad från 68,08 ± 2,25 | j, g i det intakta hjärtat (n = 6) till 4,73 ± 2,27 | ig i den decellulariserade hjärtat (n = 5).
Collagen immunoreaktivitet
Upprätthållandet av den extracellulära matrisen (ECM) efter decellularisering är nödvändig för att återpopulation med exogena celler, och för funktionaliteten av matrisen. Att bedöma innehållet i den neonatala ECM i intakt och decellulariserade ECM, var immuno-färgning för kollagen IV utföras. Figur 4c och d visar att kollagen IV är robust uttryck i både den intakta och decellulariserade hjärta och att lokaliseringen av detta protein bibehålles efter avlägsnande cell, medan DAPI positiva kärnor avlägsnas effektivt (figur 4e-h).
DNA-innehåll
Närvaron av DNA används som en ytterligare indikation på cellularitet. I figur 5 är DNA visats vara minskade med 93% i neonatala hjärtan efter tvättmedel baserad decellularisering. Denna grad av DNA-reduktion ligger i linje medrapporter i litteraturen med diskmedel baserade decellularisering i andra vävnader 15-16.
Recellularization
Vi har utfört immunohistokemi för bestämning av uttrycket av olika cardiomyocyte markörer i recellularized hjärtat. Figur 6 illustrerar celler som har migrerat in i väggen av den vänstra ventrikeln (figur 6A och 6B). Figur 6C visar DAPI märkning av recellularized hjärta. Figur 6D-G illustrerar celler som är positiva för NKX 2,5, mCherry, α-actinin och DAPI, respektive. Nkx2.5 är känd för att märka hjärt progenitorceller, medan α-actinin är en sarcomeric protein som markerar differentierade cardiomyocytes. Vi har observerat en majoritet av celler som uttrycker alla dessa markörer (rosa; Figur 6H), vilket indikerar att dessa celler fortsätter att uttrycka cardiomyocyte markörer even efter 23 dagar av perfusion.
Figur 1. Schematisk bild av decellularisering hårdvara. A. 60 cc spruta fat behållare för rengöringsmedel. B. Kateterenhet med bevattning spruta så detaljerad. C. Detalj av det dragna PE slangen kateterspetsen. D. Decellularisering kammare och septum med avloppet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Schematisk representation av hjärtat bioreaktor. 1. Befuktning av carbogen gas (Gröna linjerna representerar gasflödet). 2. Peristaltisk pump enhet för medie perfusion ochsyresättning (Lila linjer representerar medierna passerar genom oxygenator). 3. Tunnväggad oxygenator. 4. Sheet oxygenator och mediebehållare. 5. Preload kammare och bubbelfällan. 6. hjärtkammaren (röda linjerna representerar medieflödet till och från hjärtat). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Hela Mount P3 neonatal mus hjärta före (A) och efter decellularisering (B). Detta hjärtat decellulariseras använder Langendorff perfusion metod som beskrivits i Metod 2. Observera att hjärtat blir genomskinlig och något förstorad efter perfusion (B) . Skala = 2 mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Histologi av nativ och decellulariserade P3 neonatal mus hjärta. Kryostat sektion (10 ^ m) färgades med H & E (A, B), Collagen IV (C, D, G, H) och DAPI (E, F, G, H ). Sammanslagna bilderna är representerade i G och H. H & E-färgning visar en frånvaro av cellkärnor och cytoplasma i decellulariserade vävnaden (B) jämfört med den nativa hjärt (A). Medan kollagen IV innehållet är följande decellularisering (D), DAPI färgning (en markör för kärnor) avskaffas. De sammanslagna bilderna visar samlokalisering av kollagen IV och DAPI i naiva hjärta (G) och frånvaron av detta colocalization i den decellulariserade hjärta (H). Dessa data tyder på att celler inte längre befolka kollagenmatrisen i hjärtat. Skala = 500 nm. Klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Utvärdering av DNA-innehållet. Kontroll (n = 6) och decellulariseras (n = 5) hjärtan analyseras med avseende på DNA-innehåll av pico-gröna metod. Kvantifiering uttryckt som pg DNA per hjärta ± standardavvikelse. Asterisk indikerar p <0,01 jämfört med kontroll. Dessa data indikerar att decellularisering minskar DNA-innehåll avsevärt i P3 neonatal hjärta. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
oad / 54459 / 54459fig6.jpg "/>
Figur 6. Histologi av P3 hjärta matris 23 dagar efter recellularization med P1 mCherry uttrycker cardiomyocytes. Färgades med H & E (A, skala = 250 um, B, skala = 50 pm), DAPI (C, skala = 250 um), NKX 2,5, mCherry, α-actinin, DAPI, och slogs samman (D, E, F, G, H, skala = 50 ^ m). Vi har visat det effektiva återpopulation av kollagenmatrisen med P1 cardiomyocytes (AC). Dessutom observerade vi att m-körsbär positiva kardiomyocyter uttrycker Nkx2.5 och a-actinin 23 dagar efter införandet i kollagenmatrisen. Dessa data indikerar att dessa celler behålla sin cardiomyocyte identitet under längre tidsperioder. Klicka här för att se en större version av denna figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Beroendet av denna teknik vid upprepade perfusion av hjärtat gör undvikande av en blodpropp en kritisk komponent i ett framgångsrikt resultat. Från den första kateterisering av hjärtat i steg 2,2-2,6, till förändringarna i lösning mellan steg 2.8-2.14 finns manipulationer som kan tillåta införsel av luftbubblor som äventyrar flödet av perfusatet i hjärtmuskeln. På grund av den ringa storleken av den neonatala hjärta, kan även mycket små bubblor i kärl orsaka en teknisk infarkt, vilket gör det decellularisering ofullständig. Dessutom, i de senare tvättstegen, kan ofullständig perfusion resultera i tvättmedelsrester som negativt påverkar biokompatibilitet. Dessutom snabba temperaturförändringar, till exempel när du tar bort matrisen från 4 ° C lagring föreslås i steg 2,14, bör behandlas med försiktighet eftersom det kan också vara en källa till luftbubbelbildning när upplöst gas rör sig ut ur lösningen med förändringen i temperatur. Whöna vidare till recellularization bör ytterligare försiktighet tillämpas vid upprättandet sprutan med cellsuspensionen, för att säkerställa att infusionen är bubbelfri (steg 6,4).
Det kan vara nödvändigt att manipulera detaljerna i detta protokoll för att rymma andra typer vävnader. Det finns ett antal decellularisering protokoll rapporterade 4,9,11 som kan ge vägledning. Slutmålet (s) någon decellularisering protokoll bör omfatta underhåll av ECM proteinstruktur och relaterad biokemi, och adekvat avlägsnande av inhemska cellulära komponenter som exemplifieras av resterande DNA. I denna inställning leder tillämpningen av överdriven perfusionstryck till störningar av ECM ultra, som kan visualiseras histologiskt.
Storleken på P3 mus hjärta sätter vissa begränsningar för cell administration jämfört med vuxen vävnad. Även vuxna hjärtan presenterar en tjock nog kammarväggen som gör transmural injectiona möjlig cell leverans modalitet är P3 hjärta liten nog att en nål, vars storlek kommer inte lyserar en cellsuspension, gör betydande skada på hjärtat. Perfusion är en livskraftig leveransstrategi, men beror på celler av en viss storlek och form för att levereras på ett effektivt sätt. Neonatal murina myocyter fungerar bra i detta avseende. Andra små cirkulära celler har även visat sig tjäna detta syfte 11. Storleken omfattningen av dessa hjärtan utesluter användning av konventionella fysiologiska funktionell analys såsom tryckvolym katetrar. Andra metoder baserade på videoinspelning kan behöva övervägas.
Dessa data stöder möjligheten att decellularisering och recellularization av den neonatala musen hjärta. Tidigare studier har visat användning av vuxna hjärtan i syfte att decellularisering / recellularization studier. Matriserna som framställts av dessa vuxna hjärtan har nyinsatta med neonatala kardiomyocyter 4 och människainducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs) 17. I fallet med de hiPSCs, den nyinsatta hjärtan uppvisade en minskning i pluripotens markörer såsom NANOG, Sox2, och Oct4 och formade muskel-liknande strukturer; alla tyder på mognad. De extracellulära signaler av ECM, har dock visat sig spela en viktig roll i utvecklingen av mänskliga celler, vävnader och organ som fick oss att försöka generera matriser från vävnader som är kända för att hysa förnyelseförmåga. I våra studier, visar vi att recellularized hjärtan fortfarande uttrycka cardiomyocyte markörer, även efter långvarig kultur. Dessa data indikerar att, med hjälp av nya matriser, kan kardiomyocyter upprätthållas under långa tidsperioder utan att förlora sin identitet som kardiomyocyter. Våra data stöder tekniken och möjligheten för decellularizing neonatal mus hjärta. De neonatala matriser hålla potentialen för att tillhandahålla nya konstruktioner för återpopulationsstudier såväl som för framställning av geler som har superior förnyelseförmåga. Med hjälp av dessa nyfödda ECM är vi nu ta itu med överlägsenhet av dessa ställningar för att bilda funktionella vävnader med en mängd olika celltyper, inklusive hiPSCs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Materials for mouse heart isolation | |||
| P1 mouse pups (as shown; B6;D2-Tg(Myh6*-mCherry)2Mik/J) | Jackson Laboratories | 21577 | or equivalent |
| 60 mm Culture dish | BD Falcon | 353004 | or equivalent |
| Phosphate buffered saline pH 7.4 (sterile) | Hyclone | SH30256.01 | or equivalent |
| Single Use Blade | Stanley | 28-510 | or equivalent |
| Standard Scissors | Moria Bonn (Fine Science Tools) | 14381-43 | or equivalent |
| Spring Scissors 10 cm | Fine Science Tools | 15024-10 | or equivalent |
| Vannas Spring Scissors - 3 mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15000-00 | or equivalent |
| #5 Forceps | Dumnot (Fine Science Tools) | 11295-00 | or equivalent |
| 2. Materials for decellularization | |||
| Inlet adaptor | Chemglass | CG-1013 | autoclavable |
| Septum | Chemglass | CG-3022-99 | autoclavable |
| 1/8 in. ID x 3/8 OD C-Flex tubing | Cole-Parmer | EW-06422-10 | autoclavable |
| Male luer to 1/8" hose barb adaptor | McMaster-Carr | 51525K33 | autoclavable |
| Female luer to 1/8" hose barb adaptor | McMaster-Carr | 51525K26 | autoclavable |
| Prolene 7-0 surgical suture | Ethicon | 8648G | or equivalent |
| Ring stand | Fisher Scientific | S47807 | or equivalent |
| Clamp | Fisher Scientific | 05-769-6Q | or equivalent |
| Clamp regular holder | Fisher Scientific | 05-754Q | or equivalent |
| 60 cc syringe barrel | Coviden | 1186000777T | or equivalent |
| Beaker | Kimble | 14000250 | or equivalent |
| 22 G x 1 Syringe Needle | BD | 305155 | or equivalent |
| 12 cc syringe | Coviden | 8881512878 | or equivalent |
| 3-way stop cock | Smith Medical | MX5311L | or equivalent |
| PE50 tubing | BD Clay Adams Intramedic | 427411 | Must be formable by heat. Polyethylene recommended. |
| 1% SDS | Invitrogen | 15525-017 | Ultrapure grade recommended. Make up fresh solution and filter sterilize before use. |
| 1% Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Make up fresh solution from a 10% stock and filter sterilize before use. |
| Sterile dH2O | Hyclone | SH30538.02 | Or MilliQ system purified water. |
| 1x Pen/Strep | Corning CellGro | 30-001-Cl | or equivalent |
| 3. Materials for DNA quantitation | |||
| Proteinase K | Fisher | BP1700 | >30 U/mg activity |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | or equivalent |
| MgCl2·6H2O | Mallinckrodt | 5958-04 | or equivalent |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | or equivalent |
| Tris base/hydrochloride | Sigma-Aldrich | T1503/T5941 | or equivalent |
| Pico-Green dsDNA assay kit | Life Technologies | P7589 | requires fluorimeter to read |
| 4. Method for fixation and sectioning of tissue | |||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | or equivalent |
| Gelatin Type A from porcine skin | Sigma-Aldrich | G2500 | must be 300 bloom or greater |
| 5. Method for tissue histology | |||
| Cryomolds 10 x 10 x 5 mm | Tissue-Tek | 4565 | or equivalent |
| Cryostat | Hacker/Bright | Model OTF | or equivalent |
| Microscope Slides 25 x 75 x 1 mm | Fisher Scientific | 12-550-19 | or equivalent |
| Hematoxylin 560 | Surgipath/Leica Selectech | 3801570 | or equivalent |
| Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | or equivalent |
| Define | Surgipath/Leica Selectech | 3803590 | or equivalent |
| Blue buffer | Surgipath/Leica Selectech | 3802915 | or equivalent |
| Alcoholic Eosin Y 515 | Surgipath/Leica Selectech | 3801615 | or equivalent |
| Formula 83 Xylene substitute | CBG Biotech | CH0104B | or equivalent |
| Permount Mounting Medium | Fisher Chemical | SP15-500 | or equivalent |
| Collagen IV Antibody | Rockland | 600-401-106.1 | or equivalent |
| α-Actinin Antibody | Abcam | AB9465 | or equivalent |
| mCherry Antibody | Abcam | AB205402 | or equivalent |
| NKX2.5 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-8697 | or equivalent |
| Donkey anti-mouse AF488 Antibody | Life Technology | A21202 | or equivalent |
| Donkey anti-chicken AF594 Antibody | Jackson Immunoresearch | 703-585-155 | or equivalent |
| Donkey anti-goat CY5 Antibody | Jackson Immunoresearch | 705-175-147 | or equivalent |
| Fab Fragment Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) AF594 | Jackson Immunoresearch | 111-587-003 | or equivalent |
| Prolong Gold Antifade Mountant with DAPI | ThermoFisher | P36930 | or equivalent |
| 6. Isolation of neonatal ventricular cardiomyocytes using pre-plating | |||
| HBSS (Ca, Mg Free) | Hyclone | SH30031.02 | or equivalent |
| HEPES (1 M) | Corning CellGro | 25-060-Cl | or equivalent |
| Cell Strainer | BD Falcon | 352340 | or equivalent |
| 50 ml tube | BD Falcon | 352070 | or equivalent |
| Primeria 100 mm plates | Corning | 353803 | Primeria surface enhances fibroblast attachment promoting a higher myocyte purity |
| Trypsin | Difco | 215240 | or equivalent |
| DNase II | Sigma-Aldrich | D8764 | or equivalent |
| DMEM (Delbecco's Minimal Essential Media) | Hyclone | SH30022.01 | or equivalent |
| Vitamin B12 | Sigma-Aldrich | V6629 | or equivalent |
| Fibronectin coated plates | BD Bioscience | 354501 | or equivalent |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30910.03 | or equivalent |
| Heart bioreactor glassware | Radnoti Glass Technology | 120101BEZ | Must be sterilizable by autoclaving or gas. |
References
- Yusen, R. D., et al. Registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: Thirty-second official adult lung and heart-lung transplantation report--2015. J Heart Lung Transplant. 34 (10), 1264-1277 (2015).
- Go, A. S., et al. Heart disease and stroke statistics--2014 update: A report from the american heart association. Circulation. 129 (3), e28-e292 (2014).
- Kapelios, C. J., Nanas, J. N., Malliaras, K. Allogeneic cardiosphere-derived cells for myocardial regeneration: current progress and recent results. Future Cardiol. 12 (1), 87-100 (2016).
- Ott, H. C., et al. Perfusion decellularized matrix: Using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat Med. 14 (2), 213-221 (2008).
- Porrello, E. R., Olson, E. O. A neonatal blueprint for cardiac regeneration. Stem Cell Research. 13 (3 Pt B), 556-570 (2014).
- Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).
- Polizzotti, B. D., et al. Neuregulin stimulation of cardiomyocyte regeneration in mice and human myocardium reveals a therapeutic window. Sci Transl Med. 7 (281), 281ra45 (2015).
- Jesty, S. A., et al. c-kit+ precursors support postinfarction myogenesis in the neonatal, but not adult, heart. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (33), 13380-13385 (2012).
- Ambrosy, A. P., et al. The Global Health and Economic Burden of Hospitalizations for Heart Failure: Lessons Learned From Hospitalized Heart Failure Registries. J Am Coll Cardiol. 63 (12), 1123-1133 (2014).
- Roger, V. L., et al. Executive Summary: Heart Disease and Stroke Statistics-2012 Update A Report From the American Heart Association. Circulation. 125 (22), 188-197 (2012).
- Kennedy-Lydon, T., Rosenthal, N. Cardiac regeneration: epicardial mediated repair. Proc R Soc B. 282 (1821), 2147-2172 (2015).
- Williams, C., Sullivan, K., Black, L. D. Partially Digested Adult Cardiac Extracellular Matrix Promotes Cardiomyocyte Proliferation In Vitro. Adv Healthcare Mat. 4 (10), 1545-1554 (2015).
- Borg, T. K., et al. Recognition of extracellular matrix components by neonatal and adult cardiac myocytes. Dev Biol. 104 (1), 86-96 (1984).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immnol. 111, A3-B1-3 (2015).
- Gilbert, T. W., Freund, J. M., Badylak, S. F. Quantification of DNA in biologic scaffold materials. J Surg Res. 152 (1), 135-139 (2009).
- Akhyari, P., et al. The quest for an optimized protocol for whole-heart decellularization: a comparison of three popular and a novel decellularization technique and their diverse effects on crucial extracellular matrix qualities. Tissue Eng Part C Methods. 17 (9), 915-926 (2011).
- Lu, T. Y., et al. Repopulation of decellularized mouse heart with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular progenitor cells. Nat Commun. 4 (2307), 1-11 (2013).
