Summary
במחקרים אלה, אנו מספקים מתודולוגיה חדשנית, בילוד, פיגומי לב בעכברים לשימוש במחקרים רגנרטיבית.
Introduction
אי ספיקת לב היא נפוצה וקטלנית. זוהי מחלה פרוגרסיבית כי תוצאות התכווצות ירד של הלב, אשר משבש את זרימת דם לאיברים ועוזב את הדרישות המטבוליות של הגוף מסופק. ההערכה היא כי 5.7 מיליון אמריקנים סובלים מאי ספיקת לב וזה הגורם העיקרי של אשפוז בארצות הברית 9. העלות הקולקטיבית של טיפול בחולים באי ספיקת לב בארצות הברית עולה על 300 $ מיליארדים דולרים בשנת 9-10. הטיפול סופי רק עבור אי ספיקת לב סופנית הוא השתלת לב orthotopic. בכל שנה, ההערכה היא כי יותר מ -100,000 לבבות תורמים נדרשים נהלים השתלה לב בארצות הברית 1-2. לאור המספרים של תורמים המוגבלים, רק כ -2,400 השתלות מבוצעות מדי שנה בארה"ב 2. ברור, מחסור האיבר הזה צריך להיות מטופל כמו אסטרטגיות אחרות נדרשות לייצר איברים נוספים transplantation, באופן אידיאלי, איברים אלה יהיו עצמיים כדי למנוע סיבוכים הקשורים דחיית דיכוי חיסוני בחיים.
Cardiomyocytes המבוגר יונק להפגין יכולת התחדשות מוגבלת על פגיעה, אך הראיות אחרונות עולה כי לבבות בילוד יונקים לשמור על יכולת התחדשות מדהימה בעקבות פציעת 5-8. באופן ספציפי, לאחר כריתה כירורגית חלקית, חלון משוב התגלה בין יום לידה ואחרי הלידה 7. זה תקופת משובי מאופיין בחוסר צלקת פיברוטית, היווצרות נאווסקולריזציה, שחרור גורמי angiogenic מן epicardium, ו cardiomyocyte התפשטות 5-8 , 11. חלון משוב זה זמן מספק את הפוטנציאל לשימוש בלב בילוד כמקור רומן של חומר לפיתוח לב bioartificial.
מטריקס ידוע לספק רמזים חשובים לקדם cardiomyocytהתפשטות וצמיחה דואר. הבדלים ברורים בזמינויות מולקולות מטריצות הילודים מבוגרים 12 ויכולנו לקדם התחדשות נחקרו 13. מטריצות מבוגרות decellularized שמשו מספר מחקרים לספק פיגום ECM עבור ואכלוס הסלולר והדור של לב bioartificial. בעוד שמחקרים אלה, ותגליות חדשות בטכנולוגיות תאי גזע, מתקדמים במהירות, מספר משוכות טרם נפגשו. לדוגמא, מגבלות בשימור מבנה יליד המטריצה, אינטגרציה הסלולר בקיר מטריקס, ואת היכולת לתמוך התפשטות וצמיחה כל להגביל את ההצלחה של גישה זו. בעוד תכונות התחדשות מעולות כבר ייחסו ללב בילוד, על ההיבטים המעשיים של שימוש ברקמות כגון מוגבל החיפושים שלה.
בהתבסס על יכולת ההתחדשות הפגינה הלב בילוד, פתחנו מטריצות רומן על ידי פיתוחטכניקה של decellularization ללב עכבר P3. לב P3 נבחר ללימודים אלה כפי שהוא בתוך החלון של התחדשות לב כמו בעבר נקבע 6 אבל הלב הוא גדול מספיק כדי קציר, decellularize ו recellularize. מטרת המחקר הנוכחי היא להוכיח את ההיתכנות של יצירת מטריצת מלב עכבר בילוד. המחקרים שלנו לספק ראיות על היתכנותו של decellularizing דקה, לב בילוד תוך שמירה על שלמות מבני חלבוניים של ECM. כמו כן, אנו מדגימים את היכולת recellularize ECM לב זה עם cardiomyocytes mCherry לבטא ואנחנו בחנו cardiomyocytes אלה עבור ביטוי של סמנים לבביים שונים הבאים recellularization. טכנולוגיה זו תאפשר בדיקה של עליונות של מטריצה בילוד לפיתוח לב bioartificial.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים העכבר בוצעו בהתאם לחוק צער בעלי-חיים בארה"ב אושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש באוניברסיטת מינסוטה.
1. שיטת בידוד לב עכבר
- להרדים עכבר בילוד ידי עריפת ראש עם להב ליחד.
- ספוגית החזה עם 70% אתנול.
- לנתח העור מהחזה על ידי חיתוך זה מקיר החזה במספריים רגילים תוך משייכת העור רוחבית עם זוג # 5 מלקחיים.
- לחורר את הבטן רק נחה עצם החזה עם המספריים על ידי חיתוך דרך דופן הבטן. לתפוס את תהליך xiphoid עם מלקחיים # 5, לחזור בו עצם החזה rostrally מהגוף תוך צמצום אף כי צלעות משני צדי החזה עם מספריים. כלוב הצלעות משתקף superiorly עם המלקחיים כדי לחשוף את הלב.
- בבוטות לנתח את שתי אונות הראשיות של התימוס ידי משייכת רוחבית עם # 5 מלקחיים, חשיפההקשת של אבי העורקים, כמו גם הוורידים caval ו ריאתי.
- Transect העורקים הגדולים מן קשת אבי העורקים, ואת אבי העורקים עצמה, עם מספריים באביב 10 ס"מ. שמור האאורטה בין הבסיס של הלב העורק brachiocephalic. אחוז הקצוות של כלי נקטע עם # 5 מלקחיים כדי לשקף את הלב קדימה, הפרידה בינו לבין קנה הנשימה והוושט.
- Transect בכלי הדם הריאתי וורידים מרכזיים אחרים, על ידי חיתוך בין הריאות והלב משני צידי הלב עם מספריים באביב 10 ס"מ. הוורידים פתוחים לספק ניקוז.
- הסר את הלב מן mediastinum עם # 5 מלקחיים, לתפוס את הקצוות הכרותים של הכלי המרכזי. מניחים את הלב בצלחת תרבות 60 מ"מ המכיל בופר פוספט סטרילית (PBS) עבור צנתור.
2. שיטה Decellularization ידי Langendorff זלוף
- הכן את הרכבת קטטר מראש. צייר סעיף 4 ס"משל PE 50 צינורות בלהבת אלכוהול קטנה כדי ליצור צנתר קטן, רזה. חתוך את הקצוות עם סכין כדי לענות על המידות (מקורב. 300 מיקרומטר OD קוטר חיצוני עם מקורבות של OD כ. 500 מיקרומטר) שמוצגות באיור 1. זה יספק שני צנתרים סימטריים מכל צד של המשיכה.
- כוון את הקצוות של הצינור לתוך הלהבה בקצרה, כדי להמס מקורב על הפתיחה בסוף הדק.
- מלאו את המזרק 12 מ"ל עם PBS ולהרכיב את הקטטר על ידי הצבת שסתום 3 כיווני על המזרק. הוספת 22 G x 1 מחט הברזלים ולהוביל את המחט דרך מחץ. החלק את הקטטר צינורות PE נמשך על המחט (איור. 1).
- להשקות את החלקים שהותקנו עם PBS, והבטיח כי כל בועות האוויר הוסרו.
- הכנס את קטטר, הכינו כפי שתואר לעיל, לתוך אבי העורקים של הלב מבודד, לא הארכת בעבר שסתום אבי העורקים ולקשור עם עניבה אחת 7-0 תפר. לנוח המקורב של tהוא קטטר proximally נגד עניבה, מה שהופך חותם חזק ומניעת בלב מלבוא את הקטטר.
- שים לב הצנתור בהגדלה, בעוד בעדינות מרוססת בלב באמצעות המזרק המכיל PBS. ודא שאין נזילות במערכת ואת רקמת מחוויר הומוגנית כמו מוסר דם סמוי.
- מניח את מחץ לתוך הצוואר של מתאם הכניסה ולאטום אותו על ידי קיפול הצדדים על פני הזכוכית.
- חברו את המיכל מלא 60 מ"ל של סולפט dodecyl נתרן 1% (SDS) במים מזוקקים (DH 2 O) באמצעות קו של אורך מספיק כדי לייצר טור שיוצר 20 מ"מ כספית בלחץ כפי שמוצג באיור. 1. חשב את הלחץ מן גובה העמודה נוזלי מבוסס על מערכת יחסים של 1 מ"מ כספית שווה 1.3595 ס"מ H 2 O.
זהירות: SDS היא אבקה צמרית מאוד עם תכונות מגרה. לתקשר יש להימנע. טפול האבקה באמצעות ביגוד מגן מתאים. - Perfuse הלב עם 1 SDS% במשך 14 שעות. הלב יהיה שקוף במראה ללא רקמה נותרת נצפית.
- לרוקן את המערכת עד ברזלים של הפתרון SDS הנותרים ולהחליפו 10 מ"ל DH 2 O. Perfuse הלב עם 10 מ"ל 1% Triton X-100 (מדולל במים מזוקקים), ואחריו 10 מ"ל DH 2 O, ואחריו 60 מ"ל PBS המכיל סטרפטומיצין פניצילין 1x (עט סטרפטוקוקוס).
- אחסן את הלב ב- PBS עם 1x עט סטרפטוקוקוס על 4 מעלות צלזיוס. אם יישום פוסט decellularization המיועד דורש זלוף אז את הקטטר באב העורקים צריך להישמר, אחרת לחתוך את הקשר תפר ולהסיר את הקטטר.
קביעת DNA 3.
- הכן תקציר של הלב ECM או שליטה decellularized באמצעות 200 מיקרוגרם / מ"ל proteinase K ב 50 מ"מ KCl, 2.5 מ"מ MgCl 2, 0.45% Tween 20 ב 10 מ"מ טריס (pH 8.3).
- דגירת הרקמה ב 55 ° C עם תסיסה עד להמסת הרקמה,בדרך כלל 4-5 שעות.
- לכמת את התוכן DNA של homogenate עם DNA מחייב assay 4,11.
קיבוע 4. חתך של רקמות
- תקן decellularized, recellularized או P3 מלא לבבות paraformaldehyde 4% ב PBS במשך 30 דקות בטמפרטורת חדר.
- שטפו את הרקמה PBS 3x.
- הנח את הרקמה בתמיסה של סוכרוז 7.5% חיץ פוספט 0.1 M ב 4 ° C. עד שהיא שוקעת.
- שינוי הפתרון סוכרוז 15% חיץ פוספט 0.1 M ב 4 ° C, שוב, עד שהיא שוקעת.
- מומלץ לחמם את רקמות על 37 מעלות צלזיוס, להחליף מחצית מהמחזור עם פתרון ג'לטין ב סוכרוז 15% & חיץ פוספט 0.1 M לאזן בין לילה. ריכוזים של ג'לטין גדלו בשלבי דרך 1%, 2.5%, 5% ולבסוף 7.5% פעמים.
- מניחים את דגימות cryomolds באמצעות ג'לטין 7.5% טרי. כדי לשחזר את הצורה של דגימות decellularized, ג'לטין נוזלי ניתן perfused לתאי כמו tהוא לבבות ומעוצבים. להקפיא ידי הצפת cryomolds על חנקן נוזלי. חנות ב -80 מעלות צלזיוס.
- חותכים (10 מיקרומטר עבה) קטעים עם cryostat. תביא את השקופית הקרובה לפני שטח הסעיף ולבחון את הסעיף ומתרחק מן הסכין על פני השטח בשל התשלום בשקופיות המטופלים אלקטרוסטטי. לייבש את השקופיות לילה ולאחסן ב -80 ° C לצורך ניתוח עתידי.
- הסר את השקופיות מהמקפיא, לאזן לטמפרטורת החדר ואז ומניחים בצנצנת Coplin המכיל PBS במשך 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס כדי לפזר את הג'לטין.
- הכתם בסעיפים לחתוך משלב 4.7 עם Hematoxylin ו Eosin. מקום שקופית בתוך צנצנת Coplin. לחשוף את השקופיות hydrated בשלב 4.8 כדי Hematoxylin במשך 45 שניות, מי ברז עבור 1.5 דקות, חיץ במשך 3 דקות, מי ברז דקות 1, bluing סוכן עבור 1.5 דקות, 80% אתנול דקות 1, אלכוהוליים Eosin Y עבור 8 שניות, 80% אתנול דקות 1, 100% אתנול עבור 1 2x דקות, ניקוי סוכן (תחליף קסילן) עבור 1 3x דקות, coverslip עם שרףהרכבה בינונית מבוסס. בדוק את השקופיות מיקרוסקופיות.
- כדי לאשר את השמירה של תגובתיות חלבון ECM של ECM הלב, כתם במשך חלבונים מבניים ECM כגון קולגן IV על ידי הצבת את השקופיות hydrated בתא humidified ולטפל עם 10% בסרום חמור נורמלי (NDS) ב בופר פוספט עם 0.1% Triton -X100 (PBST) במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר (RT). השתמש נפח מספיק כדי לכסות את סעיפי רקמות.
- החלף את הפתרון עם הנוגדן הראשוני מועדף דילול לקבוע באופן אמפירי ב 5% NDS / PBST. לדוגמא, נוגדן קולגן IV היה מדולל ב 1: 150. דגירת הלילה ב 4 מעלות צלזיוס.
- שטפו את השקופיות עם PBST 3x ולהחיל נוגדנים משני הבחירה מצומדות עם פלורסנט לצבוע. לדלל את הנוגדן בסכום לקבוע באופן אמפירי. דגירה במשך שעה 1 ב RT. לשטוף עם PBS 3x.
- כתם השקופיות עם צבע DNA מחייב כגון DAPI לאמת בהיעדר גרעיני תאים באמצעות mounti המכיל DAPIng בינוני כאשר הכיסוי מחליק את השקופיות.
- בדוק את השקופיות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ב 50 עד 400X.
5. P1 ילודים Murine חדרית cardiomyocytes עבור Recellularization
- ריסוס כל גור עם 70% אתנול ו לערוף עם להב לייחד.
- חזק כל גור בין האגודל והאצבע תוך בית החזה מחולק על קו האמצע עם מספרי סטרילי קטנים כדי לחשוף את חלל בית החזה. החל הלחץ על מנת לאפשר את הלב כדי לבלוט בחופשיות מהחזה בזמן שהוא נחתך חינם של כלי מרכזי הפרוזדורים לעזוב את רקמת חדרית בלבד.
- מניחים כל הלב ישירות לתוך צינור 50 מ"ל המכיל 20 מ"ל סידן קר כקרח, תמיסת מלח שנאגרו של האנק חינם ביקרבונט עם 20 מ"מ 4- (2-hydroxyethyl) חומצה -1-piperazineethanesulfonic (CBFHH) עד כל הלבבות נאספים.
- לשאוב CBFHH ולהוסיף 10-15 מ"ל של CBFHH טריים (קרים כקרח) אל הצינור. שטפו את הרקמה על ידי מתערבל את הרקמה tהוא הצינור מספר פעמים.
- למזוג את הפתרון המכיל את הלבבות לתוך צלחת פטרי פלסטיק 60 מ"מ.
- לנתח כל רקמה סמויה פרוזדורים מלבם בהגדלה על קרח ידי זמירה אותו הרחק הלבבות עם מספרי האביב. לרכך את החדרים לחתיכות קטנות בגודל homogenously. הסר את כל רקמה שאינה חדרית מופרדת מהצלחת עם מלקחיים 5 #.
- Pipet כמה שיותר הפתרון CBFHH כפי שנדרש להעביר את שברי רקמה לתוך בקבוקון סטרילית קטן המכיל בר ומערבבים מיקרו סטרילי.
- לאפשר לרקמות משקעות לתחתית של הבקבוקון ולהסיר פתרון CBFHH.
- מאפרים 50 מ"ל של פתרון אנזים 1.75 מ"ג / מ"ל טריפסין, 20 מיקרוגרם / מ"ל DNase השנייה CBFHH. Pipet 5 מ"ל של תמיסת אנזים זה ולהוסיף אותו צינור המכיל רקמות חדרית טחון ומניחים על בוחש מגנטי. מערבבים בקצב קבוע (340 סל"ד) בטמפרטורת החדר למשך 8 דקות.
הערה: פעולת הערבוב צריכה להיות עדינה ובכל זאת לאפשרהשעייתו של תרחיף. - הסר את הבקבוקון מהצלחת והמערבבים ולאפשר את התערובת הדלילה עד המשקעים במשך 3 דקות. Pipet וזורק supernatant לעכל ראשוני, כפי שהוא בעיקר מכיל תאי דם ופסולת רקמות.
- Pipet aliquot 5 מיליליטר השנייה של פתרון האנזים ולהוסיף אותו החדר לעכל. מערבבים במשך 8 דקות ולאפשר לו משקעים במשך 3 דקות אחר. לפני תחילת מעכל, להכין שני צינורות 50 מ"ל (המסומנת 1 ו -2) שכל אחת מהן מכילה 12 מ"ל קר כקרח עוברי בסרום שור (FBS). מניחים מסננת תא 40 מיקרומטר גבי צינור אחד. Pipet supernatant זו דרך המסנן על צינור 1.
- חזור על תהליך העיכול פעמים 8 נוספים, לסירוגין המיקום של supernatant לעכל בין שני צינורות המכילים FBS. פיצול supernatant האחרון שווה בשווה בין צינורות 1 ו -2 כדי להבטיח כמויות שווות בצינור אחד.
הערה: כל צינור איסוף יכיל חברה 32.5 מיליליטר נפח כולל של השעית תא. - בצנטריפוגה צינורות המכיליםing את XG supernatant 150 עבור 6 דקות ב 4 ° C.
- בעוד איסוף aliquots העיכול, להכין חמש צלחות תרבות 100 מ"מ רקמת עם 6 מ"ל של התקשורת (מדיה של הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) עם 10% FBS, 1x עט סטרפטוקוקוס, 1x L- גלוטמין) לכל צלחת. דגירה aliquots אלה על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 30 דקות כדי לאזן את התקשורת.
- לשאוב את התערובת אנזים CBFHH ו resuspend התאים לתוך 30 מ"ל של התקשורת בתרבות מוכן לעיל, שילוב תאים משני צינורות איסוף.
- חזור 6 מ"ל של תרחיף תאים לכל אחד צלחות 100 מ"מ ו דגירה במשך 45 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
- בסוף הדגירה, העברת תאים שאינם חסידים עד 5 מנות חדשות מחדש דגירה של 45 דק '(השבר פיברובלסטים יהיה החל לדבוק את הכלים ניתן לגדל בנפרד אם רוצה).
- בסוף הסיבוב השני של ציפוי מראש, לאסוף את המדיה ותאי לא חסיד מן המנות ספין לתקשורת ב 150XG במשך 6 דקות.
- צייר את תקשורת עודפת להביא את התאים לריכוז הרצוי המשוער, (4.0 x 10 5 תאים לכל לבנות ב 100 μl של perfusate). הסרת aliquot לבדיקת ספירה או כדאיות 14.
6. Bioreactor Recellularization של מטריקס הלב P3
- Pretreat מטריצת הלב המבודד עם תקשורת והתרבות (ראה שלב 5.15) לילה לפני הוספת התאים.
- הרכיבו את האלמנטים של מערכת Langendorff כפי שמוצג באיור. 2. החיטוי חלק זכוכית אתילן אוקסיד לעקר את חלקי הפלסטיק כדי להבטיח סטריליות. יחידות משנה שונות של המערכת ניתן להרכיב במנדף זרימה למינרית לפני רכוב על דוכן תמיכה. באמבט מים במחזור ואת נתיב זרימת מים מחומם הושמט לבהירות.
- מלא את המערכת המורכבת עם 120 מיליליטר של תקשורת בתרבות רקמות (ראה שלב 5.15).
- מניח את מטריצת לב צינתור משלב 2.14 של מועצה עירונית 60 מ"מימצלחת ture בהגדלה ולהתחבר מזרק 1 מ"ל עם 22 G x 1 מחט עמוסה ההשעיה תא משלב 5.20 על קטטר. ודא כי הקהל הזה הוא ללא בועות אוויר כדי למנוע embolizing בלב.
- בעדינות perfuse 100 μl של השעית תא לתוך מטריצת הלב דרך העורקים הכליליים. לכשיושלם, לנתק את שילוב מזרק / מחט.
הערה: זלוף איטי של כ. 20 μl לדקה נדרש כדי למנוע את התאים מלצאת הוורידים, העוברים בלב. - עם בדל 22g בוטה מאובטח ההולם Luer על החלק התחתון של מכסה צנצנת לב bioreactor, לדחוף את הקטטר אל הבדל.
- הפעל את משאבת peristaltic ולבחון כי תמורת הזרימה כמתואר באיור 2. תמורת זרימה מהמאגר באמצעות המשאבה דרך מלכודת הבועה הקטטר להציב האאורטה בשלב 2.5 (השביל אדום באיור. 2). שים את זרימת מחזור הדם של הלב מתוך הוורידs ו טפטוף מן הקודקוד, הסירקולציה המחודשת למאגר התקשורת.
הערה: קצב זרימת זלוף תלוי בגורמים בודדים כגון התנגדות כלי הדם של המבנה, ואת גודל הלב, אבל בקצב של 50 עד 100 μl / min הוא נקודת התחלה טובה. בנקודות זמן ביניים, ניתן לבצע הערכות תפקודיות. סולם גודל הלב בילוד recellularized מגביל את ההערכות, כי ניתן לבצע אך שקבענו מערכות מבוססות אופטי יכולות לשמש כדי לכמת להכות התנהגות בדיוק כפי שהם שמשו לבבות עכברוש מבוגרים. 4 הבונה ניתן perfused מורחבת תקופות של זמן (עד 23 שעות).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
decellularization
בממוצע, זמן decellularization של לב P3 באמצעות פרוטוקול זה הוא כ 14 שעות. מקבלת משקל לב ממוצע של 23 מ"ג עבור ילוד P3.
Acellularity
איור 3 א מדגימים לב בילוד P3 במלואו ללא פגם (הר שלם). איור 3B מראה את אותו בלב הבא decellularization. איורי 4 א ו -4 להראות מכתים hematoxylin ו eosin של לבבות שלמים decellularized, בהתאמה. הערת העדר גרעיני hematoxylin חיובי על הקטנת מבנים אאוזינופילית בלב decellularized. בנוסף, התוכן DNA של הלב decellularized מצטמצם משמעותית מ 68.08 ± 2.25 מיקרוגרם בלב שלם (n = 6) כדי 4.73 ± 2.27 מיקרוגרם בלב decellularized (n = 5).
דק-page = "1"> immunoreactivity קולגן
התחזוקה של תאי מטריקס (ECM) הבאים decellularization חיוני Repopulation עם תאים אקסוגניים לפונקציונליות של מטריקס. כדי להעריך את התוכן של ECM בילוד ב ECM שלם decellularized, חיסונית מכתים עבור קולגן IV בוצע. איור 4C ו- D להוכיח כי קולגן IV מתבטא וחסונה בשני בלב שלם decellularized וכי לוקליזציה של החלבון הזה נשמר לאחר הסרת תאים, בעוד גרעינים חיוביים DAPI יוסרו באופן יעיל (איור 4E-ח).
תוכן DNA
הנוכחות של ה- DNA משמש כאינדיקציה נוספת של cellularity. באיור 5, DNA מוכח להיות ירידה של 93% בלבבות בילוד הבאים decellularization דטרגנט מבוסס. דרגה זו של הפחתת DNA עולה בקנה אחד עםדיווחים בספרות באמצעות decellularization דטרגנט מבוסס ברקמות אחרות 15-16.
Recellularization
ביצענו אימונוהיסטוכימיה כדי לקבוע את הביטוי של סמנים cardiomyocyte שונים בלב recellularized. איור 6 ממחיש תאים היגרו לתוך הקיר של החדר השמאלי (איור 6 א ו 6 ב). איור 6 ג מדגים את תיוג DAPI של הלב recellularized. איור 6D-G ממחיש תאים, כי הם חיוביים עבור 2.5 NKX, mCherry, α-actinin ו DAPI, בהתאמה. NKX2.5 ידוע לתייג ובתאי לב, ואילו-actinin α הוא חלבון sarcomeric מסמן cardiomyocytes המובחן. צפינו רוב התאים המבטאים כל סמנים אלה (ורוד; איור 6 שעות), המציין כי התאים האלה ממשיכים להביע סמנים cardiomyocyte even לאחר 23 ימים של זלוף.
איור 1. סכמטי של decellularization חומרה. A. 60 סמ"ק מזרק חבית המאגר עבור בתמיסת דטרגנט. B. הרכבת צנתר עם מזרק השקיה כמפורט. C. פרט קצה הצנתר צינורות PE נמשך. D. קאמרי מחץ Decellularization עם ניקוז. נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. ייצוג סכמטי של bioreactor לב. 1. לחות של גז carbogen (קווים ירוקים מייצגים זרימת הגז). 2. כונן משאבת Peristaltic זלוף תקשורתחמצון (קווים סגולים לייצג זרימת מדיה דרך oxygenator). 3. oxygenator קיר דק. 4. oxygenator גיליון מאגר תקשורת. 5. תא Preload מלכודת בועה. 6. תא לב (קווים אדומים מייצגים זרימת מדיה אל מהלב). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. הר שלם של הלב עכבר בילוד P3 לפני (א) ואחרי decellularization (B). לב זה decellularized בשיטת זלוף Langendorff כמתואר בשיטה 2. שים לב הלב הופך שקוף ומעט מוגדל הבאים זלוף (B) . סולם = 2 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. היסטולוגיה של הלב עכבר בילוד P3 יליד decellularized. בסעיף cryostat (10 מיקרומטר) הוכתמו H & E (A, B), קולגן IV (C, D, G, H) ו DAPI (E, F, G, H ). תמונות ממוזגות מיוצגות G ו- H. H & E מכתים מראה עדר גרעין תא ואת הציטופלסמה ברקמת decellularized (B) בהשוואה בלב הילידים (א). בעוד תוכן קולגן IV נשאר decellularization הבאה (D), מכתים DAPI (סמן של גרעינים) הוא בוטל. התמונות הממוזגות להדגים את colocalization של קולגן IV ו DAPI בלב התם (G) והיעדר colocalization זה בלב decellularized (H). נתונים אלה מצביעים על כך תאים לא עוד לאכלס את מטריצת הקולגן של הלב. סולם = 500 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5. הערכת תוכן DNA. הביקורת (n = 6) ו decellularized (n = 5) לבבות assayed עבור תוכן DNA בשיטת פיקו-ירוק. כימות מבוטא מיקרוגרם של ה- DNA לכל לב ± סטיית התקן. כוכבית מציינת p <0.01 לעומת שליטה. נתונים אלו מעידים כי decellularization מפחית תוכן DNA משמעותית בלב בילוד P3. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
oad / 54,459 / 54459fig6.jpg "/>
איור 6. היסטולוגיה של P3 מטריקס הלב 23 הימים הבאים recellularization עם P1 mCherry לבטא cardiomyocytes. מוכתם H & E (A, בקנה מידה = 250 מיקרומטר, B, בקנה מידה = 50 מיקרומטר), DAPI (C, בקנה מידה = 250 מיקרומטר), NKX 2.5, mCherry, α-actinin, DAPI, והתמזגו (D, E, F, G, H, בקנה מידה = 50 מיקרומטר). אנחנו הוכחנו את והאכלוס היעיל של מטריקס קולגן עם cardiomyocytes P1 (AC). בנוסף, אנו ציינו כי cardiomyocytes החיובית מ-הדובדבן להביע Nkx2.5 ו α-actinin 23 ימים לאחר הקדמה לתוך מטריצת קולגן. נתונים אלו מעידים כי תאים אלה לשמר את הזהות cardiomyocyte שלהם לפרקי זמן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של f זהigure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
התלות של טכניקה זו על perfusions החוזרת והנשנית של הלב הופכת את ההימנעות של תסחיף מרכיב קריטי של תוצאה מוצלחת. מתוך הצנתור הראשוני של לב שלבי 2.2-2.6, לשינויים של פתרון בין שלבי 2.8-2.14, יש מניפולציות שיכולים לאפשר כניסתה של בועות אוויר אשר פשר זרימת perfusate לתוך שריר הלב. בשל גודלו הזעיר של הלב בילוד, אפילו בועות דקות בכלי הדם יכולות לגרום אוטם טכני, ובכך הופך decellularization שלם. בנוסף, בשלבים לשטוף אחר כך, זלוף שלם יכול לגרום שאריות דטרגנט כי משפיע לרעה התאמה ביולוגית. יתר על כן, שינויים מהירים בטמפרטורה, כגון בעת הסרת מטריקס מאחסון 4 מעלות צלזיוס כפי שהוצעו בשלב 2.14, צריכים לגשת בזהירות כי זה גם יכול להיות מקור של היווצרות בועת אוויר כאשר מומס מהלכי גז מתוך פתרון עם השינוי בטמפרטורה. Wהליך תרנגולת recellularization, טיפול נוסף צריך להיות מיושם, בעת הכנת המזרק עם השעית התא, כדי להבטיח את העירוי הוא בועה חינם (שלב 6.4).
זה עשוי להיות נחוץ כדי לתפעל את הפרטים של פרוטוקול זה כדי להכיל סוגים ברקמות אחרות. ישנם מספר פרוטוקולי decellularization דיווח 4,9,11 אשר יכול לספק הדרכה. המטרה הסופית (ים) של כל פרוטוקול decellularization צריך לכלול את התחזוקה של מבנה החלבון ECM וביוכימיה הקשורות, והסרה נאותה מרכיבים תאיים הילידים כפי שהודגם על ידי DNA שיורית. בהגדרה זו, הפעלת לחץ זלוף מופרזת גורמת שיבוש ultrastructure ECM, אשר ניתן דמיינו היסטולוגית.
גודלו של לב עכבר P3 מכניס כמה מגבלות על ממשל תא לעומת רקמות מבוגרות. בעוד לבבות מבוגרים מציגים קיר חדר מספיק עבה שגורם transmural Injectioשיטת משלוח תא אפשרי נה, בלב P3 הוא קטן מספיק כי מחט, שגודלה לא lyse ההשעיה תא, עושה נזק משמעותי ללב. זלוף היא אסטרטגית משלוח קיימא, אך הדבר תלוי תאים של גודל וצורה מסוימים כדי להיות מועבר באופן יעיל. מיוציטים murine ילודים לעבוד גם בעניין זה. תאים עגולים קטנים אחר גם הוכחו לשרת מטרה זו 11. סולם הגודל של לבבות אלה מונע את השימוש של אנליזה פונקציונלית קונבנציונלית פיזיולוגית, כמו קטטרים לנפח בלחץ. בניגוד לגישות אחרות מבוססים על לכידת וידאו יכול להיות כדי להיחשב.
נתונים אלה תומכים ההיתכנות של decellularization ו recellularization של לב עכבר בילוד. מחקרים קודמים הדגימו את שימוש לבבות מבוגרים לצורך מחקרי decellularization / recellularization. המטריצות המופק מלבבות המבוגרות אלה כבר אוכלסו מחדש עם cardiomyocytes בילוד 4 ואנושיתאי גזע מושרים (hiPSCs) 17. במקרה של hiPSCs, הלבבות אוכלסו מחדש מציגים ירידה בסמני pluripotency כגון NANOG, Sox2, ו Oct4 ומבני שריר דמוי נוצרו; כולן עדות של התבגרות. הרמזים התאיים של ECM, לעומת זאת, הוכחו לשחק תפקיד קריטי בהתפתחות של תאים, רקמות, ואיברים אשר הניעו אותנו מנסה ליצור מטריצות מרקמות שידועות כתומכי יכולת התחדשות. במחקרים שלנו, אנו מראים כי לבבות recellularized עדיין מבטאים סמנים cardiomyocyte, גם לאחר התרבות ממושכת. נתונים אלה מצביעים על כך, באמצעות מטריצות הרומן, cardiomyocytes יכול להישמר במשך פרקי זמן ארוכים בלי לאבד את זהותם כמו cardiomyocytes. הנתונים שלנו לתמוך את הטכניקה ואת היתכנות decellularizing לב עכבר בילוד. המטריצות בילוד להחזיק את הפוטנציאל למתן בונת רומן ללימודים ואכלוס וכן לייצור ג'לים שיש superior יכולת התחדשות. שימוש ECMS בילוד אלה, אנו נמצאים כעת בהתמודדות עם העליונות של פיגומים אלה כדי ליצור רקמות פונקציונליות עם מגוון רחב של סוגי תאים, כולל hiPSCs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Materials for mouse heart isolation | |||
| P1 mouse pups (as shown; B6;D2-Tg(Myh6*-mCherry)2Mik/J) | Jackson Laboratories | 21577 | or equivalent |
| 60 mm Culture dish | BD Falcon | 353004 | or equivalent |
| Phosphate buffered saline pH 7.4 (sterile) | Hyclone | SH30256.01 | or equivalent |
| Single Use Blade | Stanley | 28-510 | or equivalent |
| Standard Scissors | Moria Bonn (Fine Science Tools) | 14381-43 | or equivalent |
| Spring Scissors 10 cm | Fine Science Tools | 15024-10 | or equivalent |
| Vannas Spring Scissors - 3 mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15000-00 | or equivalent |
| #5 Forceps | Dumnot (Fine Science Tools) | 11295-00 | or equivalent |
| 2. Materials for decellularization | |||
| Inlet adaptor | Chemglass | CG-1013 | autoclavable |
| Septum | Chemglass | CG-3022-99 | autoclavable |
| 1/8 in. ID x 3/8 OD C-Flex tubing | Cole-Parmer | EW-06422-10 | autoclavable |
| Male luer to 1/8" hose barb adaptor | McMaster-Carr | 51525K33 | autoclavable |
| Female luer to 1/8" hose barb adaptor | McMaster-Carr | 51525K26 | autoclavable |
| Prolene 7-0 surgical suture | Ethicon | 8648G | or equivalent |
| Ring stand | Fisher Scientific | S47807 | or equivalent |
| Clamp | Fisher Scientific | 05-769-6Q | or equivalent |
| Clamp regular holder | Fisher Scientific | 05-754Q | or equivalent |
| 60 cc syringe barrel | Coviden | 1186000777T | or equivalent |
| Beaker | Kimble | 14000250 | or equivalent |
| 22 G x 1 Syringe Needle | BD | 305155 | or equivalent |
| 12 cc syringe | Coviden | 8881512878 | or equivalent |
| 3-way stop cock | Smith Medical | MX5311L | or equivalent |
| PE50 tubing | BD Clay Adams Intramedic | 427411 | Must be formable by heat. Polyethylene recommended. |
| 1% SDS | Invitrogen | 15525-017 | Ultrapure grade recommended. Make up fresh solution and filter sterilize before use. |
| 1% Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Make up fresh solution from a 10% stock and filter sterilize before use. |
| Sterile dH2O | Hyclone | SH30538.02 | Or MilliQ system purified water. |
| 1x Pen/Strep | Corning CellGro | 30-001-Cl | or equivalent |
| 3. Materials for DNA quantitation | |||
| Proteinase K | Fisher | BP1700 | >30 U/mg activity |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | or equivalent |
| MgCl2·6H2O | Mallinckrodt | 5958-04 | or equivalent |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | or equivalent |
| Tris base/hydrochloride | Sigma-Aldrich | T1503/T5941 | or equivalent |
| Pico-Green dsDNA assay kit | Life Technologies | P7589 | requires fluorimeter to read |
| 4. Method for fixation and sectioning of tissue | |||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | or equivalent |
| Gelatin Type A from porcine skin | Sigma-Aldrich | G2500 | must be 300 bloom or greater |
| 5. Method for tissue histology | |||
| Cryomolds 10 x 10 x 5 mm | Tissue-Tek | 4565 | or equivalent |
| Cryostat | Hacker/Bright | Model OTF | or equivalent |
| Microscope Slides 25 x 75 x 1 mm | Fisher Scientific | 12-550-19 | or equivalent |
| Hematoxylin 560 | Surgipath/Leica Selectech | 3801570 | or equivalent |
| Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | or equivalent |
| Define | Surgipath/Leica Selectech | 3803590 | or equivalent |
| Blue buffer | Surgipath/Leica Selectech | 3802915 | or equivalent |
| Alcoholic Eosin Y 515 | Surgipath/Leica Selectech | 3801615 | or equivalent |
| Formula 83 Xylene substitute | CBG Biotech | CH0104B | or equivalent |
| Permount Mounting Medium | Fisher Chemical | SP15-500 | or equivalent |
| Collagen IV Antibody | Rockland | 600-401-106.1 | or equivalent |
| α-Actinin Antibody | Abcam | AB9465 | or equivalent |
| mCherry Antibody | Abcam | AB205402 | or equivalent |
| NKX2.5 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-8697 | or equivalent |
| Donkey anti-mouse AF488 Antibody | Life Technology | A21202 | or equivalent |
| Donkey anti-chicken AF594 Antibody | Jackson Immunoresearch | 703-585-155 | or equivalent |
| Donkey anti-goat CY5 Antibody | Jackson Immunoresearch | 705-175-147 | or equivalent |
| Fab Fragment Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) AF594 | Jackson Immunoresearch | 111-587-003 | or equivalent |
| Prolong Gold Antifade Mountant with DAPI | ThermoFisher | P36930 | or equivalent |
| 6. Isolation of neonatal ventricular cardiomyocytes using pre-plating | |||
| HBSS (Ca, Mg Free) | Hyclone | SH30031.02 | or equivalent |
| HEPES (1 M) | Corning CellGro | 25-060-Cl | or equivalent |
| Cell Strainer | BD Falcon | 352340 | or equivalent |
| 50 ml tube | BD Falcon | 352070 | or equivalent |
| Primeria 100 mm plates | Corning | 353803 | Primeria surface enhances fibroblast attachment promoting a higher myocyte purity |
| Trypsin | Difco | 215240 | or equivalent |
| DNase II | Sigma-Aldrich | D8764 | or equivalent |
| DMEM (Delbecco's Minimal Essential Media) | Hyclone | SH30022.01 | or equivalent |
| Vitamin B12 | Sigma-Aldrich | V6629 | or equivalent |
| Fibronectin coated plates | BD Bioscience | 354501 | or equivalent |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30910.03 | or equivalent |
| Heart bioreactor glassware | Radnoti Glass Technology | 120101BEZ | Must be sterilizable by autoclaving or gas. |
References
- Yusen, R. D., et al. Registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: Thirty-second official adult lung and heart-lung transplantation report--2015. J Heart Lung Transplant. 34 (10), 1264-1277 (2015).
- Go, A. S., et al. Heart disease and stroke statistics--2014 update: A report from the american heart association. Circulation. 129 (3), e28-e292 (2014).
- Kapelios, C. J., Nanas, J. N., Malliaras, K. Allogeneic cardiosphere-derived cells for myocardial regeneration: current progress and recent results. Future Cardiol. 12 (1), 87-100 (2016).
- Ott, H. C., et al. Perfusion decellularized matrix: Using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat Med. 14 (2), 213-221 (2008).
- Porrello, E. R., Olson, E. O. A neonatal blueprint for cardiac regeneration. Stem Cell Research. 13 (3 Pt B), 556-570 (2014).
- Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).
- Polizzotti, B. D., et al. Neuregulin stimulation of cardiomyocyte regeneration in mice and human myocardium reveals a therapeutic window. Sci Transl Med. 7 (281), 281ra45 (2015).
- Jesty, S. A., et al. c-kit+ precursors support postinfarction myogenesis in the neonatal, but not adult, heart. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (33), 13380-13385 (2012).
- Ambrosy, A. P., et al. The Global Health and Economic Burden of Hospitalizations for Heart Failure: Lessons Learned From Hospitalized Heart Failure Registries. J Am Coll Cardiol. 63 (12), 1123-1133 (2014).
- Roger, V. L., et al. Executive Summary: Heart Disease and Stroke Statistics-2012 Update A Report From the American Heart Association. Circulation. 125 (22), 188-197 (2012).
- Kennedy-Lydon, T., Rosenthal, N. Cardiac regeneration: epicardial mediated repair. Proc R Soc B. 282 (1821), 2147-2172 (2015).
- Williams, C., Sullivan, K., Black, L. D. Partially Digested Adult Cardiac Extracellular Matrix Promotes Cardiomyocyte Proliferation In Vitro. Adv Healthcare Mat. 4 (10), 1545-1554 (2015).
- Borg, T. K., et al. Recognition of extracellular matrix components by neonatal and adult cardiac myocytes. Dev Biol. 104 (1), 86-96 (1984).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immnol. 111, A3-B1-3 (2015).
- Gilbert, T. W., Freund, J. M., Badylak, S. F. Quantification of DNA in biologic scaffold materials. J Surg Res. 152 (1), 135-139 (2009).
- Akhyari, P., et al. The quest for an optimized protocol for whole-heart decellularization: a comparison of three popular and a novel decellularization technique and their diverse effects on crucial extracellular matrix qualities. Tissue Eng Part C Methods. 17 (9), 915-926 (2011).
- Lu, T. Y., et al. Repopulation of decellularized mouse heart with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular progenitor cells. Nat Commun. 4 (2307), 1-11 (2013).
