Summary
في هذه الدراسات، ونحن نقدم منهجية للرواية، حديثي الولادة، السقالات القلب الفئران للاستخدام في الدراسات التجدد.
Introduction
فشل القلب هو شائع وقاتل. وهو مرض التدريجي الذي يؤدي إلى انقباض انخفضت من القلب، الذي يعوق تدفق الدم إلى الأعضاء ويترك مطالب التمثيل الغذائي في الجسم تتم تلبيتها. ويقدر أن 5.7 مليون أميركي يعانون قصور القلب وهذا هو السبب الرئيسي في المستشفى في الولايات المتحدة 9. تكلفة الجماعية لعلاج المرضى في فشل القلب في الولايات المتحدة يتجاوز 300 مليار $ دولار سنويا 9-10. العلاج النهائي الوحيد للفشل نهاية المرحلة القلب هو مثلي زرع القلب. في كل عام، وتشير التقديرات إلى أن هناك حاجة إلى أكثر من 100،000 قلوب المانحة لعمليات زرع القلب في الولايات المتحدة الأمريكية 1-2. ويرجع ذلك إلى عدد محدود من الجهات المانحة، يتم تنفيذ سوى ما يقرب من 2400 عملية زراعة سنويا في الولايات المتحدة (2). بوضوح، يحتاج هذا النقص الجهاز لمعالجتها كما هو مطلوب استراتيجيات أخرى لإنتاج أجهزة إضافية لtransplantaنشوئها، ومن الناحية المثالية، هذه الأجهزة سيكون ذاتي وذلك لتجنب المضاعفات المرتبطة الرفض وكبت المناعة مدى الحياة.
العضلية الكبار الثدييات يبرهن على وجود قدرة على التجدد محدودة على الاصابة لكن تشير أدلة حديثة أن قلوب الأطفال حديثي الولادة الثدييات الحفاظ على القدرة على التجدد ملحوظة بعد الاصابة 5-8. على وجه التحديد، وبعد استئصال الجراحي الجزئي، وقد تم اكتشاف نافذة التجديدي بين الولادة وبعد الولادة يوم 7. وتتميز هذه الفترة التجدد بسبب عدم وجود ندبة متليفة، وتشكيل اتساع الأوعية الدموية، وإطلاق سراح من العوامل عائية من النخاب، وcardiomyocyte انتشار 5-8 11. يوفر هذا الإطار التجدد الوقت إمكانية استخدام قلب الأطفال حديثي الولادة كمصدر جديدة من مواد لتطوير قلب bioartificial.
ومن المعروف أن المصفوفة خارج الخلية لتقديم العظة هامة لتعزيز cardiomyocytالبريد انتشار والنمو. وقد استكشفت اختلافات واضحة في توافر الجزيئات في المصفوفات حديثي الولادة والبالغين 12 و قدرتها على تشجيع تجديد 13. وقد استخدمت المصفوفات الكبار Decellularized في العديد من الدراسات لتوفير سقالة ECM لإعادة تعمير الخلوي وتوليد قلب bioartificial. في حين أن هذه الدراسات والاكتشافات الجديدة في مجال تكنولوجيا الخلايا الجذعية، تحقق تقدما سريعا، لها عدة عقبات لم تتحقق بعد. على سبيل المثال، القيود في الحفاظ على بنية الأصلي للمصفوفة، والتكامل الخلوي في الجدار مصفوفة، والقدرة على دعم انتشار ونمو كل حد في نجاح هذا النهج. في حين نسبت سمات التجدد متفوقة على قلب الأطفال حديثي الولادة، والجوانب العملية لاستخدام هذه الأنسجة محدودة التنقيب.
وبناء على القدرة التجديدية أثبت للقلب الأطفال حديثي الولادة، وقد وضعنا مصفوفات جديدة من خلال تطويرتقنية decellularization للقلب P3 الماوس. وقد تم اختيار قلب P3 لهذه الدراسات كما هو ضمن إطار التجديد القلب كما سبق تحديدها 6 ولكن القلب هو كبير بما يكفي لموسم الحصاد، decellularize وrecellularize. الهدف من هذه الدراسة هو إظهار جدوى إنشاء مصفوفة من قلب فأر حديثي الولادة. توفر دراستنا دليلا على جدوى decellularizing دقيقة واحدة، قلب الأطفال حديثي الولادة مع الحفاظ على السلامة الهيكلية والبروتينية إدارة المحتوى في المؤسسة. علينا أن نبرهن أيضا القدرة على recellularize هذا ECM القلب مع mCherry العضلية التعبير ولقد درست هذه العضلية للتعبير عن مختلف علامات القلب التالية recellularization. ستسمح هذه التقنية لللاختبار تفوق مصفوفة حديثي الولادة لتطوير قلب bioartificial.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم إجراء جميع التجارب الماوس وفقا لقانون رعاية الحيوان الولايات المتحدة وتمت الموافقة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي في جامعة مينيسوتا.
1. طريقة للماوس القلب العزلة
- الموت ببطء الماوس حديثي الولادة عن طريق قطع الرأس مع استخدام شفرة واحدة.
- مسحة الصدر مع 70٪ من الإيثانول.
- تشريح الجلد من الصدر عن طريق قطع بعيدا عن جدار الصدر مع مقص القياسية في حين سحب الجلد أفقيا مع زوج من ملقط # 5.
- خرم البطن فقط أقل شأنا من القص مع مقص من خلال قطع جدار البطن. استيعاب عملية الخنجري مع ملقط # 5، التراجع عن القص rostrally من الجسم في حين قطع على الرغم من أن الضلوع على جانبي الصدر مع مقص. وينعكس القفص الصدري متفوق مع ملقط للكشف عن القلب.
- بصراحة تشريح اثنين من الفصوص الرئيسية للالغدة الصعترية عن طريق سحب أفقيا مع # 5 ملقط، وتعريضقوس الأبهر، وكذلك الأوردة الأجوف والرئوية.
- القطع الشرايين الرئيسية من قوس الأبهر، والشريان الأورطي نفسه، مع مقص الربيع 10 سم. الإبقاء على الشريان الأورطي بين قاعدة من القلب والشريان العضدي الرأسي. فهم نهايات الأوعية قطعت مع # 5 ملقط لتعكس القلب إلى الأمام، يفصل بينه وبين القصبة الهوائية والمريء.
- القطع والأوعية الدموية الرئوية والأوردة الرئيسية الأخرى، عن طريق قطع بين الرئتين والقلب على جانبي القلب مع مقص الربيع 10 سم. لا تزال الأوردة المفتوحة لتوفير الصرف الصحي.
- إزالة القلب من المنصف مع ملقط 5 #، واستيعاب نهايات قطعت من السفن الكبرى. وضع القلب في طبق ثقافة 60 ملم تحتوي على معقم الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) لالقسطرة.
2. طريقة لDecellularization التي كتبها Langendorff الإرواء
- إعداد الجمعية القسطرة مقدما. يوجه جزء 4 سممن PE 50 أنابيب في لهب الكحول صغيرة لخلق، قسطرة أصغر أرق. تقليم ينتهي بشفرة لمواجهة أبعاد (تقريبا 300 ميكرومتر الخارجي OD قطر مع شفة تقريبا. OD 500 ميكرون) هو مبين في الشكل 1، وهذا سيوفر اثنين القسطرة متناظرة من كل جانب من سحب.
- تدل على نهاية قطع من أنابيب في لهب لفترة وجيزة، لتذوب شفة على افتتاح في نهاية رقيقة.
- ملء الحقنة 12 مل مع برنامج تلفزيوني وتجميع القسطرة عن طريق وضع 3-الطريقة محبس على حقنة. إضافة 22 G × 1 الإبرة إلى محبس ودفع الإبرة من خلال الحاجز. حرك رسمها PE أنابيب القسطرة على الإبرة (الشكل 1).
- لري أجزاء مجمعة مع برنامج تلفزيوني، مؤكدا أنه تمت إزالة جميع فقاعات الهواء.
- إدراج القسطرة، أعدت على النحو المبين أعلاه، في الشريان الأورطي في القلب معزولة، لا تمتد الماضي الصمام الأبهري وligate مع ربطة عنق واحد من 7-0 خياطة. ضع شفة رانه قثطار قريب ضد ربطة عنق، وجعل ختم مشددة ومنع القلب من نزوله القسطرة.
- مراقبة القسطرة تحت التكبير، في حين perfusing بلطف القلب باستخدام حقنة تحتوي على برنامج تلفزيوني. تأكد من عدم وجود تسرب في النظام والنسيج يبيض متجانس كما هو إزالة الدم الكامنة.
- وضع الحاجز في عنق محول مدخل وختم ذلك عن طريق طي الجانبين على الزجاج.
- إرفاق خزان مليئة 60 مل من 1٪ كبريتات الصوديوم دوديسيل (SDS) في الماء المقطر (DH 2 O) عبر خط طول كاف لإنتاج العمود الذي يولد 20 ملم زئبق ضغط كما هو مبين في الشكل. 1 أحسب ضغط من ارتفاع عمود السائل على أساس العلاقة بين 1 ملم زئبق يساوي 1.3595 سم H 2 O.
تحذير: SDS هو مسحوق صوفانية للغاية مع خصائص مهيجة. وينبغي تجنب الاتصال. التعامل مع مسحوق باستخدام الملابس الواقية المناسبة. - يروي القلب مع 1٪ SDS لمدة 14 ساعة. سيتم شفافة القلب في المظهر مع عدم وجود الأنسجة المتبقية ملاحظتها.
- مسح نظام يصل إلى محبس من الحل SDS المتبقية واستبدالها مع 10 مل درهم 2 O. يروي القلب مع 10 مل 1٪ تريتون X-100 (المخفف في الماء المقطر)، تليها 10 مل O 2 درهم، يليه 60 مل تحتوي على برنامج تلفزيوني الستربتومايسين البنسلين 1X (القلم بكتيريا).
- تخزين قلب في برنامج تلفزيوني مع 1X القلم بكتيريا في 4 درجات مئوية. إذا كان التطبيق آخر decellularization المقصود يتطلب نضح ثم ينبغي الحفاظ القسطرة في الشريان الأورطي، وقطع وإلا فإن التعادل خياطة وإزالة القسطرة.
تحديد 3. الحمض النووي
- إعداد ملخص للECM أو مراقبة القلب decellularized باستخدام 200 ميكروغرام / مل بروتين كاف في 50 ملي بوكل، 2.5 ملي MgCl 2، 0.45٪ توين 20 في 10 ملي تريس (درجة الحموضة 8.3).
- احتضان الأنسجة عند 55 درجة مئوية مع الإثارة حتى يذوب الأنسجة،عادة 4-5 ساعة.
- Quantitate محتوى الحمض النووي للجناسة مع الحمض النووي فحص 4،11 ملزمة.
4. التثبيت وباجتزاء من الأنسجة
- إصلاح decellularized، recellularized أو السيطرة P3 قلوب في 4٪ امتصاص العرق في برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- غسل الأنسجة في برنامج تلفزيوني 3X.
- وضع الأنسجة في حل من 7.5٪ سكروز في 0.1 العازلة الفوسفات M في 4 درجات مئوية حتى تغرق.
- تغيير الحل إلى 15٪ سكروز في 0.1 العازلة الفوسفات M في 4 درجات مئوية، مرة أخرى، إلى أن المصارف.
- تسخين الأنسجة إلى 37 درجة مئوية، استبدال نصف حجم بمحلول الجيلاتين في 15٪ سكروز و 0.1 م العازلة الفوسفات ويوازن بين عشية وضحاها. وزادت تركيزات الجيلاتين تدريجي من خلال 1٪، 2.5٪، 5٪، وأخيرا 7.5٪ مرتين.
- وضع العينات في cryomolds باستخدام الطازج 7.5٪ الجيلاتين. لاستعادة شكل من العينات decellularized، الجيلاتين السائل يمكن perfused في غرف كما روتتشكل انه القلوب. تجميد من قبل تعويم cryomolds على النيتروجين السائل. تخزين في -80 درجة مئوية.
- قطع (10 ميكرون سميكة) المقاطع مع ناظم البرد. جلب الشريحة على مقربة من الباب السطحية ومراقبة قسم تتحرك الخروج من سكين على السطح بسبب التهمة على الشرائح تعامل كهربية. تجفيف الشرائح بين عشية وضحاها وتخزين في -80 درجة مئوية لتحليل المستقبل.
- إزالة الشرائح من الثلاجة، تتوازن إلى درجة حرارة الغرفة ثم ضع في جرة Coplin تحتوي على برنامج تلفزيوني لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية إلى حل الجيلاتين.
- وصمة عار على قطع مقاطع من الخطوة 4.7 مع الهيماتوكسيلين ويوزين. مكان الشرائح في جرة Coplin. كشف الشرائح رطب في الخطوة 4.8 إلى الهيماتوكسيلين لمدة 45 ثانية، والاستفادة من المياه لمدة 1.5 دقيقة، العازلة لمدة 3 دقائق، ماء الصنبور لمدة 1 دقيقة، الصبغة الزرقاء وكيل ل1.5 دقيقة، 80٪ من الإيثانول لمدة 1 دقيقة، المشروبات الكحولية يوزين Y لمدة 8 ثانية، 80٪ من الإيثانول لمدة 1 دقيقة، و 100٪ من الإيثانول ل1 2X دقيقة، وتطهير وكيل (زيلين بديل) لمدة 1 دقيقة 3X، ساترة مع الراتنجالمستندة إلى تصاعد المتوسط. فحص الشرائح مجهريا.
- لتأكيد الإبقاء على ECM البروتين التفاعل من ECM القلب، وصمة عار لECM البروتينات الهيكلية مثل الكولاجين الرابع عن طريق وضع الشرائح المائية في غرفة ترطيب وعلاج مع 10٪ الحمار العادي المصل (NDS) في الفوسفات مخزنة المالحة مع 0.1٪ تريتون -X100 (PBST) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة (RT). استخدام كمية كافية لتغطية أقسام الأنسجة.
- استبدال حل مع الأجسام المضادة الأولية من خيار في والتخفيف العزم تجريبيا في 5٪ NDS / PBST. على سبيل المثال، كان المخفف الأجسام المضادة الكولاجين الرابع في 1: 150. احتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
- تغسل الشرائح مع PBST 3X وتطبيق الضد الثانوية الاختيار مترافق مع صبغة الفلورسنت. تمييع الضد بمبلغ تحدد تجريبيا. احتضان لمدة 1 ساعة على RT. يغسل مع برنامج تلفزيوني 3X.
- وصمة عار على الشرائح مع صبغة الحمض النووي ملزم مثل دابي للتحقق من عدم وجود نواة الخلية باستخدام mounti دابي تحتوي علىنانوغرام المتوسطة عندما غطاء الانزلاق الشرائح.
- دراسة الشرائح مع المجهر الفلورسنت في 50 و 400X.
5. P1 حديثي الولادة الفئران البطيني العضلية للRecellularization
- رش كل الجرو مع الايثانول 70٪ وقطع رأس مع استخدام شفرة واحدة.
- عقد كل الجرو بين الإبهام والسبابة في حين يتم تقسيم الصدر في خط الوسط مع مقص العقيمة صغيرة لكشف التجويف الصدري. الضغط للسماح للقلب لتبرز بحرية من الصدر بينما يتم قطع عليه مجانا من السفن الكبرى والأذينين ولم يتبق سوى نسيج البطين.
- ضع كل قلب مباشرة في أنبوب 50 مل تحتوي على 20 مل الجليد الباردة الكالسيوم، محلول ملحي مخزنة كربونات مجانا هانك مع 20 ملي 4- (2-هيدروكسي) حامض -1-piperazineethanesulfonic (CBFHH) حتى يتم جمع كل القلوب.
- نضح CBFHH وإضافة 10-15 مل من CBFHH جديدة (المثلج) إلى أنبوب. غسل الأنسجة عن طريق يحوم الأنسجة في تيكان أنبوب عدة مرات.
- صب محلول يحتوي على قلوب الى 60 ملم البلاستيك طبق بتري.
- تشريح أي نوع من الأنسجة الأذيني الكامنة من قلوب تحت التكبير على الجليد وتقليم بعيدا عن قلوب مع مقص الربيع. اللحم المفروم حتى البطينين إلى قطع صغيرة الحجم متجانس. إزالة أي فصل الأنسجة غير البطين-من الطبق مع ملقط # 5.
- الماصة مثل كثير من الحل CBFHH كما هو مطلوب لنقل أجزاء الأنسجة إلى قارورة معقمة صغيرة تحتوي على بقضيب الصغيرة العقيمة.
- السماح للأنسجة لالرواسب في قاع القارورة وإزالة حل CBFHH.
- يشكلون 50 مل من محلول أنزيم 1.75 ملغ / مل التربسين، 20 ميكروغرام / مل الدناز الثاني في CBFHH. الماصة 5 مل من هذا المحلول انزيم وإضافته إلى أنبوب يحتوي على مفروم النسيج البطين ومكان على محرك مغناطيسي. يحرك بمعدل ثابت (340 دورة في الدقيقة) في درجة حرارة الغرفة لمدة 8 دقائق.
ملاحظة: يجب أن يكون العمل التحريك لطيف وتسمح حتى الآنللتعليق على الطين. - إزالة قارورة من لوحة ضجة والسماح الطين إلى الرواسب لمدة 3 دقائق. الماصة وتجاهل الهضم الأولي طاف، كما أنه يحتوي على خلايا الدم في المقام الأول والحطام الأنسجة.
- الماصة والثانية 5 مل قسامة من الحل الانزيم وإضافته إلى البطين هضم. تحرك المكونات لمدة 8 دقائق والسماح لها الرواسب لمدة 3 دقائق أخرى. قبل بداية هضم، وإعداد كل منهما 50 مل أنابيب (المسمى 1 و 2) تحتوي كل منها على 12 مل الجليد الباردة مصل بقري جنيني (FBS). وضع مصفاة الخلية 40 ميكرومتر فوق كل أنبوب. الماصة هذا طاف من خلال مرشح في أنبوب 1.
- تكرار عملية الهضم 8 مرات إضافية، بالتناوب موضع طاف هضم بين اثنين من الأنابيب التي تحتوي على FBS. تقسيم طاف الماضي مناصفة بين أنابيب 1 و 2 لضمان كميات متساوية في كل أنبوب.
ملاحظة: كل أنبوب جمع يحتوي الآن 32.5 مل الحجم الكلي للتعليق الخلية. - أنابيب الطرد المركزي تحتوي علىجى x ج طاف 150 لمدة 6 دقائق في 4 درجات مئوية.
- في حين جمع قسامات الهضم، وإعداد خمسة 100 لوحات زراعة الأنسجة ملم مع 6 مل من وسائل الاعلام (Dulbecco لتعديل النسر وسائل الإعلام (DMEM) مع 10٪ FBS، 1X القلم بكتيريا، 1X L-الجلوتامين) لكل لوحة. احتضان هذه aliquots في 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 لمدة 30 دقيقة لكي تتوازن وسائل الإعلام.
- نضح الانزيم خليط CBFHH و resuspend الخلايا في 30 مل من وسائل الإعلام ثقافة أعد أعلاه، والجمع بين الخلايا من كلا أنابيب جمع.
- عودة 6 مل من خلية إلى تعليق كل من لوحات 100 ملم واحتضان لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
- في نهاية الحضانة، ونقل الخلايا غير ملتصقة إلى 5 أطباق جديدة وإعادة احتضان لمدة 45 دقيقة (جزء الليفية وبدأت التمسك أطباق ويمكن زراعتها بشكل منفصل إذا رغبت في ذلك).
- في نهاية الجولة الثانية من مرحلة ما قبل الطلاء، وجمع وسائل الإعلام والخلايا غير ملتصقة من الأطباق وتدور وسائل الإعلام في 150x ج لمدة 6 دقائق.
- رسم من وسائل الإعلام الزائدة لجعل الخلايا إلى التركيز المطلوب تقريبي، (4.0 × 10 5 خلايا لكل بناء في 100 ميكرولتر من الإرواء). إزالة قسامة عن العد وأو قابلية الاختبار 14.
6. مفاعل حيوي Recellularization من P3 القلب مصفوفة
- يمهد للمعالجة المصفوفة القلب معزولة مع وسائل الإعلام الثقافة (راجع الخطوة 5.15) بين عشية وضحاها قبل إضافة الخلايا.
- تجميع عناصر نظام Langendorff كما هو مبين في الشكل. 2. الأوتوكلاف أجزاء الزجاج وأكسيد الإثيلين تعقيم وقطع من البلاستيك لضمان العقم. وحدات فرعية مختلفة من نظام يمكن تجميعها في غطاء تدفق الصفحي قبل أن تكون محمولة على موقف الدعم. لقد تم حذف تعميم حمام الماء ويسخن مسار تدفق المياه من أجل الوضوح.
- ملء نظام تجميعها مع 120 مل من وسائل الاعلام زراعة الأنسجة (راجع الخطوة 5.15).
- وضع مصفوفة القلب مقسطر من الخطوة 2.14 في طريق مسدود 60 ممطبق البنية تحت التكبير وتوصيل حقنة 1 مل مع 22 G × 1 إبرة محملة تعليق الخلية من الخطوة 5.20 إلى القسطرة. تأكد من أن هذا التجمع هو خال من فقاعات الهواء لتجنب embolizing القلب.
- يروي بلطف 100 ميكرولتر من تعليق خلية في المصفوفة القلب عبر الشرايين التاجية. مرة واحدة كاملة، فصل مزيج حقنة / إبرة.
ملاحظة: نضح بطيئة تقريبا. مطلوب 20 ميكرولتر لكل دقيقة لمنع الخلايا من المتدفقة من الأوردة والتي تمر عبر القلب. - مع كعب حادة 22G تأمينها لتركيب لور على الجانب السفلي من جرة غطاء مفاعل حيوي القلب، ودفع القسطرة على كعب.
- بدء تشغيل مضخة تحوي ونلاحظ أن عائدات تدفق على النحو المبين في الشكل 2. عائدات التدفق من الخزان عن طريق مضخة من خلال فخ فقاعة لالقسطرة وضعها في الشريان الأورطي في الخطوة 2.5 (مسار أحمر في الشكل 2). مراقبة تدفق الدورة الدموية في القلب من الوريدالصورة والتنقيط من قمة، إعادة تدوير إلى الخزان وسائل الإعلام.
ملاحظة: معدل تدفق نضح يعتمد على العوامل الفردية مثل مقاومة الأوعية الدموية للبناء، وحجم القلب، ولكن بمعدل 50 إلى 100 ميكرولتر / دقيقة هو نقطة انطلاق جيدة. في نقطة زمنية وسيطة، وتقييمات وظيفية يمكن تنفيذها. مقياس حجم القلب recellularized حديثي الولادة يحد من التقييمات، التي يمكن القيام بها لكننا مصممون على النظم القائمة بصريا يمكن أن تستخدم لتحديد الضرب السلوك تماما كما أنها استخدمت في قلوب الفئران البالغة. 4 يمكن perfused في بناء لمدد فترات من الزمن (تصل إلى 23 ساعة).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Decellularization
في المتوسط، والوقت لdecellularization من قلب P3 باستخدام هذا البروتوكول ما يقرب من 14 ساعة. يعطى متوسط وزن القلب من 23 ملغ لحديثي الولادة P3.
Acellularity
يوضح الشكل 3A قلب الأطفال حديثي الولادة P3 سليمة تماما (كامل جبل). ويوضح الشكل 3B نفس القلب بعد decellularization. أرقام 4A و 4B تظهر الهيماتوكسيلين ويوزين تلطيخ من قلوب سليمة وdecellularized، على التوالي. لاحظ غياب الهيماتوكسيلين النوى إيجابية وانتقاص من الهياكل الحمضة في قلب decellularized. وبالإضافة إلى ذلك، يتم تقليل محتوى الحمض النووي للقلب decellularized كبير من 68.08 ± 2.25 ميكروغرام في قلب سليمة (ن = 6) إلى 4.73 ± 2.27 ميكروغرام في قلب decellularized (ن = 5).
رقيقة الصفحات = "1"> الكولاجين مناعية
الحفاظ على المصفوفة خارج الخلية (ECM) بعد decellularization أمر ضروري لإعادة تعمير مع الخلايا الخارجية ووظائف المصفوفة. لتقييم محتوى ECM حديثي الولادة في ECM سليمة وdecellularized، تم تنفيذ المناعية تلطيخ لالكولاجين الرابع. الشكل 4C ود إثبات وأعربت أن الكولاجين الرابع بقوة في كل قلب سليمة وdecellularized والتي حافظت على توطين هذا البروتين بعد إزالة الخلايا، في حين تتم إزالة دابي النوى إيجابية على نحو فعال (الشكل 4E-ح).
المحتوى الحمض النووي
يستخدم وجود الحمض النووي كمؤشر إضافي من الخلوية. في الشكل (5)، ويتجلى الحمض النووي لتكون بنسبة 93٪ في قلوب الأطفال حديثي الولادة التالية decellularization استنادا المنظفات. هذه الدرجة من تخفيض الحمض النووي تتفق معتقارير في الأدب باستخدام decellularization استنادا المنظفات في الأنسجة الأخرى 15-16.
Recellularization
وقد أجرينا المناعية لتحديد التعبير عن مختلف علامات cardiomyocyte في قلب recellularized الشكل 6 يوضح الخلايا التي هاجرت في جدار البطين الأيسر (الشكل 6A و 6B). الشكل 6C يدل على وضع العلامات دابي من القلب recellularized. الشكل 6D-G يوضح الخلايا التي هي ايجابية للNKX 2.5، mCherry، ألفا-actinin ودابي، على التوالي. ومن المعروف NKX2.5 لتسمية الخلايا الاصلية في القلب، في حين ألفا-actinin هو بروتين الساركومير الذي يصادف العضلية متباينة. وقد لاحظنا أغلبية الخلايا التي تعبر عن كل هذه علامات (وردي، الشكل 6H)، مشيرا إلى أن هذه الخلايا تستمر في التعبير عن علامات cardiomyocyte إفأون بعد 23 يوما من نضح.
الشكل 1. رسم تخطيطي للجهاز decellularization. A. 60 سم مكعب خزان حقنة برميل عن حل المنظفات. ب. التجمع القسطرة مع حقنة الري كما هو مفصل. C. التفاصيل من طرف المؤسسة العامة أنابيب القسطرة استخلاصها. د. غرفة Decellularization والحاجز مع استنزاف. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. تمثيل تخطيطي لمفاعل حيوي القلب. 1. الترطيب من الغاز كربوجين (خطوط خضراء تمثل تدفق الغاز). 2. تحوي محرك مضخة لنضح وسائل الإعلام والأوكسجين (خطوط الأرجواني تمثل تدفق وسائل الاعلام من خلال مكساج). 3. رقيقة الجدار مكساج. 4. ورقة مكساج وخزان سائل الإعلام. غرفة 5. التحميل المسبق وفخ فقاعة. 6. غرفة القلب (خطوط حمراء تمثل تدفق وسائل الاعلام من وإلى القلب). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. الجامع جبل P3 حديثي الولادة قلب فأر قبل (A) وبعد decellularization (B). وdecellularized هذا القلب باستخدام طريقة الارواء Langendorff كما هو موضح في أسلوب 2. لاحظ أن القلب يصبح شفاف وقليلا الموسع التالية نضح (ب) . مقياس = 2mm في. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
كانت ملطخة الشكل 4. الأنسجة من الأم وdecellularized P3 حديثي الولادة قلب فأر. قسم ناظم البرد (10 ميكرون) مع H & E (A، B)، الكولاجين الرابع (C، D، G، H) ودابي (E، F، G، H ). وتمثل الصور المدمجة في مجموعة ويظهر H. H & E تلطيخ غياب نواة الخلية والسيتوبلازم في الأنسجة decellularized (ب) بالمقارنة مع قلب الأم (A). وفي حين أن مضمون الكولاجين الرابع لا يزال decellularization التالي (D)، وتلطيخ دابي (علامة نوى) وإلغاؤها. الصور المدمجة تثبت colocalization من الكولاجين الرابع ودابي في قلب ساذج (G) وعدم وجود هذا colocalization في قلب decellularized (H). وتشير هذه البيانات إلى أن الخلايا لا يعد تجميع مصفوفة الكولاجين من القلب. مقياس = 500 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5. تقييم محتوى الحمض النووي. التحكم (ن = 6) وdecellularized (ن = 5) قلوب يعاير عن محتوى الحمض النووي من طريقة بيكو الأخضر. أعربت الكميات كما ميكروغرام من الحمض النووي في قلب ± الانحراف المعياري. وتشير النجمة ف <0.01 مقارنة مع السيطرة. وتشير هذه البيانات إلى أن decellularization يقلل من محتوى الحمض النووي بشكل كبير في قلب P3 حديثي الولادة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
OAD / 54459 / 54459fig6.jpg "/>
الشكل 6. الأنسجة من P3 مصفوفة القلب 23 يوما التالية recellularization مع P1 mCherry معربا العضلية. الملون مع H & E (A، على نطاق و= 250 ميكرون، B، مقياس = 50 ميكرومتر)، دابي (C، على نطاق و= 250 ميكرون)، NKX 2.5، mCherry، α-actinin، دابي، واندمجت (D، E، F، G، H، مقياس = 50 ميكرومتر). لقد أثبتنا في إعادة تعمير الفعال لمصفوفة الكولاجين مع العضلية P1 (AC). بالإضافة إلى ذلك، لاحظنا أن العضلية إيجابية م الكرز تعبر عن Nkx2.5 وactinin α 23 يوما التالية مقدمة في مصفوفة الكولاجين. وتشير هذه البيانات إلى أن هذه الخلايا الحفاظ على الهوية cardiomyocyte لفترات طويلة من الوقت. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا وigure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
اعتماد هذه التقنية على تروية دموية متكررة من القلب يجعل تلافي حدوث الانسداد عنصر حاسم في تحقيق نتائج ناجحة. من القسطرة الأولية للقلب في خطوات 2،2-2،6، إلى التغييرات من حل بين خطوات 2،8-2،14، هناك التلاعب التي يمكن أن تسمح مقدمة من فقاعات الهواء التي حل وسط تدفق سائل الإرواء في عضلة القلب. نظرا لضآلة حجم قلب الأطفال حديثي الولادة، حتى فقاعات دقيقة في الأوعية الدموية يمكن أن يؤدي إلى احتشاء الفني، مما يجعل decellularization غير مكتملة. بالإضافة إلى ذلك، في خطوات غسل لاحقة، يمكن نضح ناقصة تؤدي إلى بقايا المنظفات التي تؤثر سلبا على توافق مع الحياة. وعلاوة على ذلك، والتغيرات السريعة في درجات الحرارة، مثل عند إزالة مصفوفة من 4 درجات مئوية تخزين كما هو مقترح في الخطوة 2.14، يجب التعامل معها بحذر وهذا يمكن أيضا أن تكون مصدرا للتشكيل فقاعة الهواء عندما يذوب التحركات الغاز من حل مع التغيير في درجة الحرارة. Wالدجاجة الشروع في recellularization، ينبغي تطبيق الرعاية إضافية، عند إعداد المحاقن مع تعليق الخلية، لضمان ضخ هو فقاعة مجانا (الخطوة 6.4).
قد يكون من الضروري للتلاعب في تفاصيل هذا البروتوكول لاستيعاب أنواع الأنسجة الأخرى. هناك أفاد عدد من البروتوكولات decellularization 4،9،11 التي يمكن أن توفر التوجيه. وينبغي أن يتضمن الهدف النهائي (ق) من أي بروتوكول decellularization الحفاظ على بنية البروتين ECM والكيمياء الحيوية ذات الصلة، وإزالة ما يكفي من المكونات الخلوية المحلية كما يتضح من الحمض النووي المتبقية. في هذا الإطار، وتطبيق ضغط التروية المفرط يؤدي إلى اختلال التركيب الدقيق ECM، والتي يمكن تصور تشريحيا.
حجم قلب P3 الماوس يضع بعض القيود على إدارة خلية بالمقارنة مع أنسجة البالغين. بينما قلوب الكبار تمثل جدار البطين يكفي السميك الذي يجعل بطريق مباشرة صبغ الممكن تسليم خلية الطريقة، والقلب P3 صغيرة بما يكفي أن إبرة، فإن حجم والتي لا ليز تعليق خلية، لا أضرار كبيرة في القلب. نضح هو استراتيجية تسليم قابلة للحياة، ولكن يعتمد على خلايا ذات حجم وشكل معين ليتم تسليمها على نحو فعال. myocytes الفئران حديثي الولادة تعمل بشكل جيد في هذا الصدد. وقد تبين أيضا خلايا دائرية صغيرة أخرى لخدمة هذا الغرض 11. مقياس حجم هذه القلوب يحول دون استخدام التحليل الوظيفي فيزيولوجي التقليدية مثل القسطرة حجم الضغط. قد يتعين النظر في النهج الأخرى القائمة على التقاط الفيديو.
وتدعم هذه البيانات جدوى decellularization وrecellularization من قلب فأر حديثي الولادة. وقد أظهرت دراسات سابقة استخدام قلوب الكبار لغرض الدراسات decellularization / recellularization. تم إسكانها المصفوفات التي تنتج من هذه القلوب الكبار مع الأطفال حديثي الولادة العضلية 4 و البشريةالناجم عن الخلايا الجذعية المحفزة (hiPSCs) 17. في حالة hiPSCs، عرض قلوب إسكانها انخفاضا في علامات تعدد القدرات مثل NANOG، SOX2، وOCT4 وهياكل تشبه العضلات شكلت. كل موحية من النضج. ومع ذلك، فقد ثبت العظة خارج الخلية من ECM أن تلعب دورا حاسما في نمو الخلايا والأنسجة والأعضاء مما دفعنا لمحاولة توليد مصفوفات من الأنسجة التي تعتبر مأوى القدرة على التجدد. في دراساتنا، علينا أن نبرهن على قلوب recellularized لا يزال التعبير عن علامات cardiomyocyte، حتى بعد ثقافة لفترات طويلة. وتشير هذه البيانات، وذلك باستخدام مصفوفات جديدة، العضلية يمكن أن تبقى لفترات طويلة من الزمن دون أن تفقد هويتها العضلية. تدعم البيانات لدينا هذه التقنية والجدوى الاقتصادية للdecellularizing حديثي الولادة قلب فأر. المصفوفات حديثي الولادة، لديها إمكانية لتوفير بنيات جديدة للدراسات إعادة تعمير وكذلك لإنتاج المواد الهلامية التي لديها سوبerior القدرة على التجدد. باستخدام هذه موبينيل حديثي الولادة، نحن نعالج الآن تفوق هذه السقالات لتشكل أنسجة وظيفية مع مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا، بما في ذلك hiPSCs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Materials for mouse heart isolation | |||
| P1 mouse pups (as shown; B6;D2-Tg(Myh6*-mCherry)2Mik/J) | Jackson Laboratories | 21577 | or equivalent |
| 60 mm Culture dish | BD Falcon | 353004 | or equivalent |
| Phosphate buffered saline pH 7.4 (sterile) | Hyclone | SH30256.01 | or equivalent |
| Single Use Blade | Stanley | 28-510 | or equivalent |
| Standard Scissors | Moria Bonn (Fine Science Tools) | 14381-43 | or equivalent |
| Spring Scissors 10 cm | Fine Science Tools | 15024-10 | or equivalent |
| Vannas Spring Scissors - 3 mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15000-00 | or equivalent |
| #5 Forceps | Dumnot (Fine Science Tools) | 11295-00 | or equivalent |
| 2. Materials for decellularization | |||
| Inlet adaptor | Chemglass | CG-1013 | autoclavable |
| Septum | Chemglass | CG-3022-99 | autoclavable |
| 1/8 in. ID x 3/8 OD C-Flex tubing | Cole-Parmer | EW-06422-10 | autoclavable |
| Male luer to 1/8" hose barb adaptor | McMaster-Carr | 51525K33 | autoclavable |
| Female luer to 1/8" hose barb adaptor | McMaster-Carr | 51525K26 | autoclavable |
| Prolene 7-0 surgical suture | Ethicon | 8648G | or equivalent |
| Ring stand | Fisher Scientific | S47807 | or equivalent |
| Clamp | Fisher Scientific | 05-769-6Q | or equivalent |
| Clamp regular holder | Fisher Scientific | 05-754Q | or equivalent |
| 60 cc syringe barrel | Coviden | 1186000777T | or equivalent |
| Beaker | Kimble | 14000250 | or equivalent |
| 22 G x 1 Syringe Needle | BD | 305155 | or equivalent |
| 12 cc syringe | Coviden | 8881512878 | or equivalent |
| 3-way stop cock | Smith Medical | MX5311L | or equivalent |
| PE50 tubing | BD Clay Adams Intramedic | 427411 | Must be formable by heat. Polyethylene recommended. |
| 1% SDS | Invitrogen | 15525-017 | Ultrapure grade recommended. Make up fresh solution and filter sterilize before use. |
| 1% Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Make up fresh solution from a 10% stock and filter sterilize before use. |
| Sterile dH2O | Hyclone | SH30538.02 | Or MilliQ system purified water. |
| 1x Pen/Strep | Corning CellGro | 30-001-Cl | or equivalent |
| 3. Materials for DNA quantitation | |||
| Proteinase K | Fisher | BP1700 | >30 U/mg activity |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | or equivalent |
| MgCl2·6H2O | Mallinckrodt | 5958-04 | or equivalent |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | or equivalent |
| Tris base/hydrochloride | Sigma-Aldrich | T1503/T5941 | or equivalent |
| Pico-Green dsDNA assay kit | Life Technologies | P7589 | requires fluorimeter to read |
| 4. Method for fixation and sectioning of tissue | |||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | or equivalent |
| Gelatin Type A from porcine skin | Sigma-Aldrich | G2500 | must be 300 bloom or greater |
| 5. Method for tissue histology | |||
| Cryomolds 10 x 10 x 5 mm | Tissue-Tek | 4565 | or equivalent |
| Cryostat | Hacker/Bright | Model OTF | or equivalent |
| Microscope Slides 25 x 75 x 1 mm | Fisher Scientific | 12-550-19 | or equivalent |
| Hematoxylin 560 | Surgipath/Leica Selectech | 3801570 | or equivalent |
| Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | or equivalent |
| Define | Surgipath/Leica Selectech | 3803590 | or equivalent |
| Blue buffer | Surgipath/Leica Selectech | 3802915 | or equivalent |
| Alcoholic Eosin Y 515 | Surgipath/Leica Selectech | 3801615 | or equivalent |
| Formula 83 Xylene substitute | CBG Biotech | CH0104B | or equivalent |
| Permount Mounting Medium | Fisher Chemical | SP15-500 | or equivalent |
| Collagen IV Antibody | Rockland | 600-401-106.1 | or equivalent |
| α-Actinin Antibody | Abcam | AB9465 | or equivalent |
| mCherry Antibody | Abcam | AB205402 | or equivalent |
| NKX2.5 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-8697 | or equivalent |
| Donkey anti-mouse AF488 Antibody | Life Technology | A21202 | or equivalent |
| Donkey anti-chicken AF594 Antibody | Jackson Immunoresearch | 703-585-155 | or equivalent |
| Donkey anti-goat CY5 Antibody | Jackson Immunoresearch | 705-175-147 | or equivalent |
| Fab Fragment Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) AF594 | Jackson Immunoresearch | 111-587-003 | or equivalent |
| Prolong Gold Antifade Mountant with DAPI | ThermoFisher | P36930 | or equivalent |
| 6. Isolation of neonatal ventricular cardiomyocytes using pre-plating | |||
| HBSS (Ca, Mg Free) | Hyclone | SH30031.02 | or equivalent |
| HEPES (1 M) | Corning CellGro | 25-060-Cl | or equivalent |
| Cell Strainer | BD Falcon | 352340 | or equivalent |
| 50 ml tube | BD Falcon | 352070 | or equivalent |
| Primeria 100 mm plates | Corning | 353803 | Primeria surface enhances fibroblast attachment promoting a higher myocyte purity |
| Trypsin | Difco | 215240 | or equivalent |
| DNase II | Sigma-Aldrich | D8764 | or equivalent |
| DMEM (Delbecco's Minimal Essential Media) | Hyclone | SH30022.01 | or equivalent |
| Vitamin B12 | Sigma-Aldrich | V6629 | or equivalent |
| Fibronectin coated plates | BD Bioscience | 354501 | or equivalent |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30910.03 | or equivalent |
| Heart bioreactor glassware | Radnoti Glass Technology | 120101BEZ | Must be sterilizable by autoclaving or gas. |
References
- Yusen, R. D., et al. Registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: Thirty-second official adult lung and heart-lung transplantation report--2015. J Heart Lung Transplant. 34 (10), 1264-1277 (2015).
- Go, A. S., et al. Heart disease and stroke statistics--2014 update: A report from the american heart association. Circulation. 129 (3), e28-e292 (2014).
- Kapelios, C. J., Nanas, J. N., Malliaras, K. Allogeneic cardiosphere-derived cells for myocardial regeneration: current progress and recent results. Future Cardiol. 12 (1), 87-100 (2016).
- Ott, H. C., et al. Perfusion decellularized matrix: Using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat Med. 14 (2), 213-221 (2008).
- Porrello, E. R., Olson, E. O. A neonatal blueprint for cardiac regeneration. Stem Cell Research. 13 (3 Pt B), 556-570 (2014).
- Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).
- Polizzotti, B. D., et al. Neuregulin stimulation of cardiomyocyte regeneration in mice and human myocardium reveals a therapeutic window. Sci Transl Med. 7 (281), 281ra45 (2015).
- Jesty, S. A., et al. c-kit+ precursors support postinfarction myogenesis in the neonatal, but not adult, heart. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (33), 13380-13385 (2012).
- Ambrosy, A. P., et al. The Global Health and Economic Burden of Hospitalizations for Heart Failure: Lessons Learned From Hospitalized Heart Failure Registries. J Am Coll Cardiol. 63 (12), 1123-1133 (2014).
- Roger, V. L., et al. Executive Summary: Heart Disease and Stroke Statistics-2012 Update A Report From the American Heart Association. Circulation. 125 (22), 188-197 (2012).
- Kennedy-Lydon, T., Rosenthal, N. Cardiac regeneration: epicardial mediated repair. Proc R Soc B. 282 (1821), 2147-2172 (2015).
- Williams, C., Sullivan, K., Black, L. D. Partially Digested Adult Cardiac Extracellular Matrix Promotes Cardiomyocyte Proliferation In Vitro. Adv Healthcare Mat. 4 (10), 1545-1554 (2015).
- Borg, T. K., et al. Recognition of extracellular matrix components by neonatal and adult cardiac myocytes. Dev Biol. 104 (1), 86-96 (1984).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immnol. 111, A3-B1-3 (2015).
- Gilbert, T. W., Freund, J. M., Badylak, S. F. Quantification of DNA in biologic scaffold materials. J Surg Res. 152 (1), 135-139 (2009).
- Akhyari, P., et al. The quest for an optimized protocol for whole-heart decellularization: a comparison of three popular and a novel decellularization technique and their diverse effects on crucial extracellular matrix qualities. Tissue Eng Part C Methods. 17 (9), 915-926 (2011).
- Lu, T. Y., et al. Repopulation of decellularized mouse heart with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular progenitor cells. Nat Commun. 4 (2307), 1-11 (2013).
