I dessa studier ger vi metodik för nya, neonatala, murina hjärt ställningar för användning i regenerativa studier.
The only definitive therapy for end stage heart failure is orthotopic heart transplantation. Each year, it is estimated that more than 100,000 donor hearts are needed for cardiac transplantation procedures in the United States1-2. Due to the limited numbers of donors, only approximately 2,400 transplants are performed each year in the U.S.2. Numerous approaches, from cell therapy studies to implantation of mechanical assist devices, have been undertaken, either alone or in combination, in an attempt to coax the heart to repair itself or to rest the failing heart3. In spite of these efforts, ventricular assist devices are still largely used for the purpose of bridging to transplantation and the utility of cell therapies, while they hold some curative promise, is still limited to clinical trials. Additionally, direct xenotransplantation has been attempted but success has been limited due to immune rejection. Clearly, another strategy is required to produce additional organs for transplantation and, ideally, these organs would be autologous so as to avoid the complications associated with rejection and lifetime immunosuppression. Decellularization is a process of removing resident cells from tissues to expose the native extracellular matrix (ECM) or scaffold. Perfusion decellularization offers complete preservation of the three dimensional structure of the tissue, while leaving the bulk of the mechanical properties of the tissue intact4. These scaffolds can be utilized for repopulation with healthy cells to generate research models and, possibly, much needed organs for transplantation. We have exposed the scaffolds from neonatal mice (P3), known to retain remarkable cardiac regenerative capabilities,5-8 to detergent mediated decellularization and we repopulated these scaffolds with murine cardiac cells. These studies support the feasibility of engineering a neonatal heart construct. They further allow for the investigation as to whether the ECM of early postnatal hearts may harbor cues that will result in improved recellularization strategies.
Hjärtsvikt är vanligt och dödliga. Det är en progressiv sjukdom som resulterar i minskad kontraktilitet av hjärtat, vilket försämrar blodflödet till organ och lämnar de metaboliska kraven från kroppens otillfredsställda. Det uppskattas att 5,7 miljoner amerikaner har hjärtsvikt och det är den främsta orsaken till sjukhusvistelse i USA 9. Den sammantagna kostnaden för behandling av patienter i hjärtsvikt i USA överstiger $ 300 miljarder dollar per år 9-10. Den enda definitiva terapi för slutstadiet av hjärtsvikt är orthotopic hjärttransplantation. Varje år uppskattas det att mer än 100.000 givar hjärtan behövs för hjärttransplantationsförfaranden i USA 1-2. På grund av de begränsade antalet donatorer är endast cirka 2400 transplantationer utförs varje år i USA två. Uppenbarligen måste denna organbristen åtgärdas som andra strategier krävs för att producera ytterligare organ för transplantation och helst skulle dessa organ vara autologa för att undvika de komplikationer som är förknippade med avstötning och livstids immunsuppression.
Däggdjur vuxna cardiomyocytes visa en begränsad förnyelseförmåga vid skada men nyligen tyder på att däggdjur neonatala hjärtan upprätthålla en anmärkningsvärd förnyelseförmåga efter skada 5-8. Speciellt efter partiell kirurgisk resektion, en regenerativ fönster har upptäckts mellan födelse och postnatal dag 7. Denna regenerativa period kännetecknas av en brist på fibrotisk ärr, bildandet av kärlnybildning, frigörande av angiogena faktorer från epikardium och cardiomyocyte spridning 5-8 , 11. Denna regenerativa tidsfönster ger möjlighet till användning av den neonatala hjärt som en ny källa av material för utveckling av en bioartificiell hjärta.
Den extracellulära matrisen är känd för att ge viktiga ledtrådar för att främja cardiomyocyte spridning och tillväxt. Tydliga skillnader i tillgången på molekyler i neonatala och vuxna matriser 12 och deras förmåga att främja regenerering har undersökts 13. Decellulariserade vuxna matriser har använts i flera studier för att tillhandahålla en ECM byggnadsställning för cellulär rekolonisering och genereringen av en bioartificiell hjärta. Även om dessa studier, och nya upptäckter inom stamcellsteknik, avancerar snabbt, flera hinder har ännu inte uppfyllt. Till exempel begränsningar i att bevara nativa strukturen av matrisen, cellulära integration i matrisen väggen, och förmåga att stödja spridning och tillväxt all gräns framgången med detta tillvägagångssätt. Medan överlägsna regenerativa egenskaper har tillskrivits den neonatala hjärtan, har de praktiska aspekterna av att använda en sådan vävnad begränsat sin utforskning.
Baserat på den demonstrerade regenerativ kapacitet neonatal hjärta, har vi utvecklat nya matriser genom att utveckla entekniken med decellularisering för P3 mus hjärta. P3 hjärta valdes för dessa studier eftersom det är inom fönstret hjärt förnyelse som tidigare bestämts 6 men hjärtat är tillräckligt stor för att skörda, decellularize och recellularize. Målet med denna studie är att visa att det är möjligt att skapa en matris från en neonatal mus hjärta. Våra studier visar att möjligheten att decellularizing en minut, neonatal hjärta samtidigt som strukturella och proteinhaltigt integritet ECM. Vi visar också förmågan att recellularize denna hjärt ECM med mCherry uttrycker cardiomyocytes och vi har undersökt dessa kardiomyocyter för uttryck av olika hjärtmarkörer efter recellularization. Denna teknik gör det möjligt för testning av överlägsenhet en neonatal matris för utvecklingen av en bioartificiell hjärta.
Beroendet av denna teknik vid upprepade perfusion av hjärtat gör undvikande av en blodpropp en kritisk komponent i ett framgångsrikt resultat. Från den första kateterisering av hjärtat i steg 2,2-2,6, till förändringarna i lösning mellan steg 2.8-2.14 finns manipulationer som kan tillåta införsel av luftbubblor som äventyrar flödet av perfusatet i hjärtmuskeln. På grund av den ringa storleken av den neonatala hjärta, kan även mycket små bubblor i kärl orsaka en teknisk infarkt, vilket gör det decellu…
The authors have nothing to disclose.
The authors gratefully acknowledge Ms. Cynthia DeKay for the preparation of the figures.
1. Materials For Mouse Heart Isolation | |||
P1 mouse pups (as shown; B6;D2-Tg(Myh6*-mCherry)2Mik/J) | Jackson Laboratories | 21577 | or equivalent |
60 mm Culture dish | BD Falcon | 353004 | or equivalent |
Phosphate buffered saline pH 7.4 (sterile) | Hyclone | SH30256.01 | or equivalent |
Single Use Blade | Stanley | 28-510 | or equivalent |
Standard Scissors | Moria Bonn (Fine Science Tools) | 14381-43 | or equivalent |
Spring Scissors 10 cm | Fine Science Tools | 15024-10 | or equivalent |
Vannas Spring Scissors – 3mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15000-00 | or equivalent |
#5 Forceps | Dumnot (Fine Science Tools) | 11295-00 | or equivalent |
2. Materials For Decellularization | |||
Inlet adaptor | Chemglass | CG-1013 | autoclavable |
Septum | Chemglass | CG-3022-99 | autoclavable |
1/8 in. ID x 3/8 OD C-Flex tubing | Cole-Parmer | EW-06422-10 | autoclavable |
Male luer to 1/8" hose barb adaptor | McMaster-Carr | 51525K33 | autoclavable |
Female luer to 1/8" hose barb adaptor | McMaster-Carr | 51525K26 | autoclavable |
Prolene 7-0 surgical suture | Ethicon | 8648G | or equivalent |
Ring stand | Fisher Scientific | S47807 | or equivalent |
Clamp | Fisher Scientific | 05-769-6Q | or equivalent |
Clamp regular holder | Fisher Scientific | 05-754Q | or equivalent |
60 cc syringe barrel | Coviden | 1186000777T | or equivalent |
Beaker | Kimble | 14000250 | or equivalent |
22g x 1 Syringe Needle | BD | 305155 | or equivalent |
12 cc syringe | Coviden | 8881512878 | or equivalent |
3-way stop cock | Smith Medical | MX5311L | or equivalent |
22 x 1 g needle | BD | 305155 | or equivalent |
PE50 tubing | BD Clay Adams Intramedic | 427411 | Must be formable by heat. Polyethylene recommended |
1% SDS | Invitrogen | 15525-017 | Ultrapure grade recommended. Make up fresh solution and filter sterilize before use. |
1% Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Make up fresh solution from a 10% stock and filter sterilize before use. |
Sterile dH2O | Hyclone | SH30538.02 | Or MilliQ system purified water. |
1X Pen/Strep | Corning CellGro | 30-001-Cl | or equivalent |
3. Materials For DNA Quantitation | |||
Proteinase K | Fisher | BP1700 | >30U/mg activity |
KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | or equivalent |
MgCl*6H2O | Mallinckrodt | 5958-04 | or equivalent |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | or equivalent |
Tris base/hydrochloride | Sigma-Aldrich | T1503/T5941 | or equivalent |
Pico-Green dsDNA assay kit | Life Technologies | P7589 | requires fluorimeter to read |
4. Method for fixation and sectioning of tissue. | |||
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | or equivalent |
Gelatin Type A from porcine skin | Sigma-Aldrich | G2500 | must be 300 bloom or greater |
5. Method for tissue histology | |||
Cryomolds 10 x 10 x 5mm | Tissue-Tek | 4565 | or equivalent |
Cryostat | Hacker/Bright | Model OTF | or equivalent |
Microscope Slides 25 x 75 x 1 mm | Fisher Scientific | 12-550-19 | or equivalent |
Hematoxylin 560 | Surgipath/Leica Selectech | 3801570 | or equivalent |
Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | or equivalent |
Define | Surgipath/Leica Selectech | 3803590 | or equivalent |
Blue buffer | Surgipath/Leica Selectech | 3802915 | or equivalent |
Alcoholic Eosin Y 515 | Surgipath/Leica Selectech | 3801615 | or equivalent |
Formula 83 Xylene substitute | CBG Biotech | CH0104B | or equivalent |
Permount Mounting Medium | Fisher Chemical | SP15-500 | or equivalent |
Collagen IV Antibody | Rockland | 600-401-106.1 | or equivalent |
α-Actinin Antibody | Abcam | AB9465 | or equivalent |
mCherry Antibody | Abcam | AB205402 | or equivalent |
NKX2.5 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-8697 | or equivalent |
Donkey anti-mouse AF488 Antibody | Life Technology | A21202 | or equivalent |
Donkey anti-chicken AF594 Antibody | Jackson Immunoresearch | 703-585-155 | or equivalent |
Donkey anti-goat CY5 Antibody | Jackson Immunoresearch | 705-175-147 | or equivalent |
Fab Fragment Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) AF594 | Jackson Immunoresearch | 111-587-003 | or equivalent |
Prolong Gold Antifade Mountant with DAPI | ThermoFisher | P36930 | or equivalent |
6. Isolation of neonatal ventricular cardiomyocytes using pre-plating. | |||
HBSS (Ca, Mg Free) | Hyclone | SH30031.02 | or equivalent |
HEPES (1M) | Corning CellGro | 25-060-Cl | or equivalent |
Cell Strainer | BD Falcon | 352340 | or equivalent |
50 mL tube | BD Falcon | 352070 | or equivalent |
Primeria 100 mm plates | Corning | 353803 | Primeria surface enhances fibroblast attachment promoting a higher myocyte purity |
Trypsin | Difco | 215240 | or equivalent |
DNase II | Sigma-Aldrich | D8764 | or equivalent |
DMEM (Delbecco's Minimal Essential Media) | Hyclone | SH30022.01 | or equivalent |
Vitamin B12 | Sigma-Aldrich | V6629 | or equivalent |
Fibronectin coated plates | BD Bioscience | 354501 | or equivalent |
Fetal bovine serum | Hyclone | SH30910.03 | or equivalent |
Heart bioreactor glassware | Radnoti Glass Technology | 120101BEZ | Must be sterilizable by autoclaving or gas. |